全 文 ：野生渥丹离体培养再生体系的研究
杨炜茹 ,孙明 ,刘鹏 ,张启翔 ＊　(北京林业大学园林学院国家花卉工程技术研究中心 ,北京 100083)
摘要　[目的 ]探索适合的渥丹组织培养方法。 [方法]以野生渥丹不同部位的鳞片为外植体 ,研究不同灭菌时间、不同培养基对外植体
组织培养过程的影响。 [结果]不同的灭菌时间对鳞片污染率的影响不同 ,均随着灭菌时间的延长呈显著下降的趋势。不同部位的鳞片
污染率差异较大 ,外部鳞片污染率最高 ,其次是中部 ,内部鳞片污染率最低。随着升汞溶液消毒时间的增加 ,各部位鳞片的增殖系数呈
逐渐降低的趋势。以中部鳞片为外植体 ,灭菌时间为 6+6(min)的效果较好 ,污染率为 59.5%,增殖系数为 2.57。诱导不定芽的最适培
养基为 MS+NAA0.1mg/L+6-BA2.0mg/L,增殖系数为 4.08。 [结论]该研究为保护渥丹种质资源和研发具有自主知识产权的品种
奠定了基础。
关键词　渥丹;外植体;组织培养
中图分类号　S603.6　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)02-00533-02
StudyonRegenerationSystemofWildLiliumconcolorinvitroCulture
YANGWei-ruetal　(CollegeofLandscapeArchitecture, BeijingForestryUniversity, NationalEngineeringResearchCenterforFloricul-
ture, Beijing100083)
Abstract　[ Objective] TheaimwastoexplorethesuitabletissueculturemethodforLiliumconcolor.[ Method] Withdiferentpartsofsqua-
mafromwildL.concolorastheexplant, theeffectsofdiferentsterilizingtimesandmediumsontheexplanttissuecultureprocesswerestud-
ied.[ Result] Theeffectsofdiferentsterilizingtimesonthecontaminationrateofthesquamawerediferentandtheyalshoweddowntrend
withtheprolongingofthesterilizingtime.Thecontaminationrateofthesquamaamongdifferentpartsweresignificantlydifferent, andamong
them, thecontaminationrateoftheexternalsquamawashighest, followedbythemiddlepartandthatoftheinternalsquamawaslowest.The
multiplicationcoeficientofthedifferentpartsofsquamashowedgradualdowntrendwiththeincreasingofthesterilizingtimebythemercuric
chloride.Withthemiddlesquamaastheexplant, theeffectofthesterilizingtimeof6+6(min)wasbetter, thenthecontaminationratewas
59.5%andthemultiplicationcoeficientwas2.57.ThesuitablemediumforinducingtheadventitiousbudwasMS+NAA0.1mg/L+6-BA
2.0mg/Landthemultiplicationcoeficientwas4.08.[ Conclusion] TheresearchlaidthefoundationforprotectingtheL.concolorgermplasm
resourcesanddevelopingthevarietywiththeindependentintelectualproperty.
Keywords　Liliumconcolor;Explant;Tissueculture
基金项目　“十一五 ”科技支撑计划课题(2006BAD01A08)。
作者简介　杨炜茹(1980-),女 , 河北石家庄人 , 博士研究生 , 研究方
向:花卉种质资源与育种。 ＊通讯作者。
收稿日期　 2008-10-21
　　渥丹属百合科百合属多年生球根草本。分布于河南 、河
北 、山东 、山西 、陕西和吉林等省 。渥丹花朵直立 ,花径较大 ,
颜色鲜艳 、美丽 ,花期 6 ～ 7月。适宜花坛 、花境丛植 ,亦可做
盆栽观赏或切花用。渥丹适应性很强 ,可粗放管理 ,是良好
的初夏园林地被绿花材料 [ 1] 。目前对渥丹的研究不多 ,且多
集中在生物学特性 [ 2] 、分类学 [ 3-4]和杂交育种 [ 5-6]上。繁殖
也是采用传统的播种和鳞片扦插繁殖 ,繁殖系数低。渥丹的
组织培养和快速繁殖尚未见报道。用组培技术繁殖渥丹不
仅有利于保护种质资源 ,而且为研发具有自主知识产权的品
种提供良好的基础。为此 ,笔者以渥丹的鳞片为外植体进行
了离体培养研究。
1　材料与方法
1.1　植物材料　供试材料渥丹(Liliumconcolor)采自辽宁本
溪平山区。
1.2　试验方法
1.2.1　灭菌时间的筛选。取渥丹的鳞茎于自来水下冲洗干
净 。将鳞片一片片小心剥下 ,尽量不要损伤鳞片基部。将鳞
片分为外 、中 、内 3部分 ,分别用洗涤剂浸泡 20 min,并用柔
软的毛刷轻轻刷洗表面 ,然后清水洗净。在无菌超净工作台
上用 70%的酒精处理 30s,无菌水冲洗 2次 ,再用 0.1%氯化
汞溶液作 2次灭菌处理 ,处理时间分别为 3+3、6+6、9+9
(min),之后用无菌水冲洗 5次。然后将鳞片置于无菌滤纸
上 ,待吸干水分后 ,用解剖刀切成 1cm×1cm的小块 ,接种到
诱导培养基 MS+NAA0.1 mg/L+6-BA1mg/L上。每种处
理接种 10瓶 ,每瓶接 4块鳞茎 , 3次重复。 30 d后统计污染
率和增殖系数。
1.2.2　不定芽诱导分化培养基的筛选。将切割为 1 cm×1
cm大小的不同部位的鳞片接种在附加不同浓度激素的 MS
培养基上。将生长素 NAA定为 0.1 mg/L,细胞分裂素 6-BA
的浓度设为 0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L5个水平 , 30 d后将未
污染的鳞片转接 ,并统计其分化的不定芽数 ,计算增殖系数。
上述培养基均附加琼脂 0.6%、蔗糖 3%、肌醇 0.1%,灭菌前
pH调至 6.0。培养条件:(25±2)℃,光照时间 12 h/d,光照
强度 1 500 ～2 000lx。
1.2.3　数据分析。所得数据采用 DPS统计软件进行方差
分析。
2　结果与分析
2.1　不同灭菌方法对渥丹不同部位鳞片污染和增殖系数的
影响　由表 1可知 ,不同灭菌时间对鳞片污染率的影响不
同 ,均呈现出随灭菌时间的延长 ,鳞片的污染率显著下降的
趋势。各处理之间除内部鳞片呈显著差异外 ,外部和中部均
呈极显著差异。 3个部位的鳞片均以 9+9处理灭菌的鳞片
污染率最低。不同部位的鳞片污染率差异较大 ,外部鳞片污
染率最高 ,其次是中部 ,内部鳞片污染率最低。
试验结果表明 ,各部位的鳞片均呈现出随着升汞溶液消
毒时间的增加 ,鳞片的增殖系数逐渐降低的趋势。外部鳞片
的增殖系数最高 ,灭菌时间 3 +3处理的增殖系数为 4.17;
9+9处理的为 1.83,均高于相同处理的中 、内部鳞片 。除内
部鳞片的 6+6和 9+9处理间没有显著差异外 ,其余处理间
均呈极显著差异。这表明 ,灭菌时间的长短对鳞片增殖影响
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(2):533-534 责任编辑　罗芸　责任校对　李洪
极为显著。灭菌时间越长 ,对鳞片的损伤越严重 ,尤其是对
内部鳞片。其中 , 9+9处理的增殖系数为零 。因此 ,在降低
污染率的前提条件下 ,尽量缩短消毒时间 ,以避免外植体的
死亡。综上所述 ,以中部鳞片为外植体 ,对其进行 6 +6
(min)的消毒时间处理可获得较为理想的结果。
表 1　灭菌时间对渥丹不同组织部位污染率和增殖系数的影响
Table1　Effectsofsterilizationtimeonthepolutionrateandmultipli-
cationcoeficientofdiferenttissuesofLiliumconcolor
组织部位
Tissue
position
灭菌时间∥min
Sterilization
time
污染数∥个
Polution
number
污染率∥%
Polution
rate
增殖系数
Multiplication
coeficient
外部鳞片 3+3 116 96.70aA 4.17aA
External 6+6 89 74.17bB 2.87bB
scale 9+9 52 43.33cC 1.83cC
中部鳞片 3+3 95 79.17aA 3.80aA
Middle 6+6 69 59.50bB 2.57bB
scale 9+9 34 28.33cC 1.33cC
内部鳞片 3+3 11 9.17aA 1.67aA
Internal 6+6 7 5.83abA 0.33bB
scale 9+9 4 3.33bA 0.00bB
　注:接种数均为 120个。同列不同大、小写字母分别表示在 0.01和
0.05水平的差异显著。
　Note:Inoculationnumberis120ineachtreatment.Diferentcapitalleters
andlowercasesmeansignificantdiferencesat0.01and0.05levels,
respectively.
2.2　不同培养基对渥丹不同部位鳞片不定芽分化的影响　
由表 2可知 ,外源激素配比不同 ,分化的不定芽数存在一定
差异。在 NAA固定的条件下 ,随着 6-BA浓度的增加 ,各部
位鳞片的增殖系数逐渐增加 ,当 6-BA浓度为 2.0 mg/L时不
定芽数最多 ,增殖系数均高于各自的其他处理。其中 ,外部
鳞片的增殖系数高达 4.08。随着 6-BA浓度的增加 ,增殖系
数反而降低。方差分析结果表明 , 6-BA对中 、外部鳞片影响
较为显著。未添加 6-BA的处理和浓度为 2.0 mg/L的处理
与其他处理间呈极显著差异 ,当 6-BA浓度在 0.5 ～ 1.0 mg/L
时 ,增殖系数无显著差异 。这表明 ,添加 6-BA能显著促进
中 、外部鳞片的增生能力;其中 ,浓度为 2.0 mg/L的处理效
果最为显著。当 6-BA浓度为 4.0 mg/L时 ,出现了较多的愈
伤组织 ,这说明高浓度的 6-BA能促进愈伤组织的形成 。不
同浓度的 6-BA对内部鳞片的增殖率影响不大。结果表明:
最适宜的培养基是加 0.1 mg/LNAA+2.0 mg/L6-BA的 MS
培养基 ,鳞片分化的小鳞芽最多 ,生长最好。
2.3　生根与移栽　将丛生芽切成单株接种在 1/2MS+IAA
0.5 mg/L的生根培养基上 , 15 d左右芽基部长出 4 ～6条白
色小根 ,继续培养 10d后即可移栽。移栽前需炼苗 3 ～ 5 d,
洗净附着在苗上的培养基 ,栽于草炭∶蛭石 =2∶1的基质中 ,
保温保湿 ,待缓苗期过后即可栽入大田 ,成活率达 80%以上。
3　讨论
灭菌是组织培养过程关键的第一步 ,不同的外植体所要
求的时间不同 。一般来说 ,野生种的污染率要远高于栽培品
种 。在预试验中 ,研究发现当升汞单次灭菌 30min时污染率
仍高达 85%以上 ,这可能与野生种渥丹带有较多的内生菌有
关 ,因而采取了二次灭菌 ,效果好于单次灭菌 。灭菌效果依
次为外部鳞片 <中部鳞片 <内部鳞片。虽然内部鳞片的污
染率最低 ,但分化能力最差 ,因而 ,建议选择中部鳞片为外植
体 ,灭菌时间以 6+6(min)为佳。
表 2　不同培养基对渥丹不同部位鳞片不定芽分化的影响
　　Table2　Effectsofculturemediumontheadventitiousscalebud
diferentiationatdifferentsitesofLiliumconcolor
组织部位
Tissue
position
培养基
Culture
medium
接种数∥个
Inoculation
number
不定芽数∥个
Adventitious
budnumber
增殖系数
Multiplication
coeficient
外部鳞片 ① 36 54 1.50dC
External ② 36 82 2.28cB
scale ③ 36 93 2.58cB
④ 36 147 4.08aA
⑤ 36 127 3.52bB
中部鳞片 ① 36 40 1.11dD
Middle ② 36 84 2.33cC
scale ③ 36 91 2.53cC
④ 36 143 3.97aA
⑤ 36 121 3.36bB
内部鳞片 ① 36 37 1.03aA
Internal ② 36 38 1.06aA
scale ③ 36 41 1.14aA
④ 36 42 1.17aA
⑤ 36 40 1.11aA
　注:①MS+NAA0.1mg/L+BA0mg/L;②MS+NAA0.1mg/L+BA
0.5mg/L;③MS+NAA0.1mg/L+BA1mg/L;④MS+NAA0.1
mg/L+BA2mg/L;⑤MS+NAA0.1mg/L+BA4mg/L。
　Note:①MS+NAA0.1mg/L+BA0mg/L;②MS+NAA0.1mg/L+
BA0.5mg/L;③MS+NAA0.1mg/L+BA1mg/L;④MS+NAA
0.1mg/L+BA2mg/L;⑤MS+NAA0.1mg/L+BA4mg/L.
　　激素的种类 、浓度和比例可调控植物组织的形态发生和
分化方向 [ 7] 。当添加 6-BA后 ,鳞片的不定芽数量增多 ,增殖
系数显著增加 ,但当 6-BA浓度为 4.0mg/L时不定芽的数量
反而降低 ,愈伤组织增多 ,这与徐凌飞等的研究结果相一
致 [ 8] 。因而 ,应根据不同的培养目的来选择适宜的激素
配比。
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534 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年