全 文 ：收稿日期:2009-03-13　　　修回日期:2009-05-30
基金项目:国家自然科学基金(No.20075016)
＊通讯作者:尤进茂 , 男 ,教授 , 博士生导师 ,主要从事荧光试剂的开发及应用.
第 26卷第 1期
Vol.26　No.1 分 析 科 学 学 报JOURNAL OF ANALYTICAL SCIENCE 2010 年 2 月Feb. 2010
DOI编码:10.3969/ j.issn.1006-6144.2010.01.006
藏药蕨麻多糖水解单糖的毛细管区带电泳分离研究
夏　莲1 , 2 , 3 , 孙志伟2 , 3 , 白新伟1 , 索有瑞2 , 尤进茂＊1 , 2
(1.生命有机分析重点实验室 ,曲阜师范大学化学与化工学院 ,山东曲阜 273165;
2.中国科学院西北高原生物研究所 ,青海西宁 810001;3.中国科学院研究生院 ,北京 100049)
摘　要:以 1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)为柱前衍生试剂 ,探讨了毛细管区带电泳
模式下对藏药蕨麻多糖水解液中单糖的分离条件。实验采用 58.5 cm×50 μm i.d.毛
细管(有效长度 50 cm),55 mmol/ L 硼酸盐缓冲溶液(pH =9.46),柱温 20℃,分离电压
22 kV ,进样 10 s。该法不加任何添加剂 ,9种单糖可高效 、快速基线分离 ,实现了对藏
药蕨麻多糖水解液中单糖的分离和定量分析 ,结果令人满意 。
关键词:多糖;蕨麻;1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮;毛细管区带电泳
中图分类号:O657.8　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-6144(2010)01-0025-05
藏药蕨麻(Potenti l la anserina L .)属青藏高原特有的经济植物 ,为蔷薇科委陵菜属植物鹅绒委陵菜
之膨大块根 ,又叫“人参果” ,属多年生草本植物。蕨麻作为一种具有较高营养价值和医疗保健功能的药食
两用植物 ,有着广阔的开发应用前景[ 1] 。现代药理学表明:蕨麻具有健脾胃 、收敛止血 、补血益气 、生津利
痰之功效 ,主治脾虚腹泻 、贫血及营养不良等症[ 2-3] 。另有报道蕨麻具有治疗黄疸性及病毒性肝炎的功
效[ 4-5] ,是一种常用藏药及滋补佳品 。据文献记载 ,蕨麻中含有糅质 、糖类 、蛋白质 、脂肪酸及委陵菜苷等
成分[ 6-9] ,而对蕨麻多糖的研究相对较少。杨桦等[ 10] 从蕨麻中分离出多糖 ,并测定了总糖含量 。陈灵然
等[ 11]和张霞等[ 12]分别进行了蕨麻多糖的药理学活性研究 。刘春兰等[ 13] 用苯酚-硫酸法对蕨麻多糖的单
糖组成进行了分析 ,但由于方法选择性差 ,多数单糖组分无法检出。
毛细管电泳以快速 、高效 、灵敏度高 、所需样品量少等优点被广泛应用[ 14-15] 。目前 ,毛细管电泳对糖
的分析主要集中在单糖和寡糖的分离检测。Suzuki等[ 16] 提出了一种不同于还原氨化类型的衍生法 ,以 1-
苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为衍生试剂 ,利用活泼碳(C-4)和还原糖的还原端之间的缩合反应进行糖
类的测定 。赵燕等[ 17] 以 PMP 作为衍生试剂成功分离了八种单糖 ,并将该方法用于中药大黄多糖(RTP)
的单糖组成及其摩尔比的测定 。本文以 1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)作柱前衍生剂 ,采用水提取乙
醇逐级沉淀法从蕨麻中提取多糖组分 ,经 Savage 法脱蛋白后的多糖以三氟乙酸水解 ,所得单糖用 NMP
标记后 ,采用毛细管区带电泳实现了各组分的分离和定量测定 ,为蕨麻多糖的开发应用提供了理论依据 。
1　实验部分
1.1　仪器 、试剂与材料
HP-3D毛细管电泳仪(美国 ,Agi lent公司),配备二极管阵列检测器;58.5 cm ×50 μm i.d.毛细管(有
效长度 50 cm ,河北省永年锐沣色谱器件有限公司)。
1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)由本实验室合成[ 18] ;单糖标准品(美国 , Sigma 公司);硼砂(分析
纯 ,徐州试剂二厂);其它试剂均为分析纯;水为 Mil li-Q超纯水 。
蕨麻植物样品购自西宁市药材市场 ,经中国科学院西北高原生物研究所藏药中心周昌范研究员鉴定 。
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第 1 期 夏　莲等:藏药蕨麻多糖水解单糖的毛细管区带电泳分离研究 第 26 卷
1.2　标准溶液的配制
准确称取葡萄糖 、半乳糖 、甘露糖标准品各 0.0180 g ,阿拉伯糖 、木糖各 0.0150 g ,鼠李糖 、岩藻糖各
0.0164 g , 葡萄糖醛酸 、半乳糖醛酸各 0.0212 g ,用水溶解并定容至 10 mL ,得到各单糖浓度均为 0.01
mol/L 的标准混合液 。准确称取 NMP 0.112 g ,用乙腈定容至 10 mL ,其浓度为 0.05 mol/L。
1.3　蕨麻多糖的提取
取干燥 、研细的蕨麻根粉 20 g ,加 200 mL去离子水 ,90℃下超声提取 1 h ,抽滤 ,取上清液减压浓缩至刚
好有固体颗粒析出 ,加 3倍体积的95%的乙醇 ,静置 24 h ,离心得沉淀物。所得沉淀物用 60 mL水溶解后 ,用
氯仿-正丁醇(体积比 4∶1)萃取三次(脱蛋白);上清液加 60 mL 乙醇放置 24 h ,离心沉淀 ,所得沉淀物 70℃烘
干 ,得 50%乙醇沉淀的蕨麻粗多糖(P50)170.67 mg;离心后的上清液补加 80 mL 乙醇 ,放置 24 h后离心沉
淀 ,沉淀物 70℃烘干 ,得 70%乙醇沉淀的蕨麻粗多糖(P70)18.07 mg;继续在所得的上清液中加 400 mL 乙
醇 ,放置 24 h后离心沉淀 ,所得沉淀物 70℃烘干 ,得 90%乙醇沉淀的蕨麻粗多糖(P90)9.33 mg 。
分别取上述三种蕨麻粗多糖 5 mg ,加 2 mol/ L 的三氟乙酸 1 mL ,封口后于 110℃下水解 8 h ,放冷后
N 2吹干 ,用水溶解并定容至 1 mL 备用 。
1.4　单糖的衍生
向 2 mL 安瓿瓶中加入 200μL NMP 乙腈溶液 、20 μL 单糖标准品混合液 、20μL 17%氨水 ,封口后于
70℃水浴中反应 35 min , 取出放冷后用氮气吹干 ,加 2 mL 乙腈-水(体积比为 4∶1)溶解后进样分析。衍
生化反应见图 1(以甘露糖为代表单糖)。
图 1　1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)与还原性单糖衍生反应示意图
Fig.1　Derivatization scheme of 1-(2-naphthyl)-3-methyl-5-pyrazolone(NMP)with reductive saccharides
1.5　分析方法
以不同浓度的硼砂缓冲溶液 ,在不同 pH 、电压和温度下 ,采用二极管阵列检测(DAD)分别对糖类衍
生物进行测定。实验前对缓冲溶液进行超声脱气 5 min ,每次进样之前 ,分别用 0.1 mol/L NaOH 溶液 、
超纯水 、硼酸盐缓冲液冲洗毛细管柱 5 m in ,更换缓冲液时 ,需要分别冲洗 10 min 。
2　结果与讨论
2.1　NMP与 PMP紫外吸收
将 NMP 与 PMP分别溶解在乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)和四氢呋喃(T HF)中(浓度均
为 1.0×10-5 mol/ L),在相同实验条件下测得的 NMP 与 PMP 的最大紫外吸收和摩尔吸光系数见表 1。
NMP 是在 PMP 的基础上用萘基取代苯基后的产物 ,萘基取代后的 NMP 分子共轭体系加强 , 243 nm 波
长处的摩尔吸光系数明显增加 ,检测灵敏度更高。
2.2　衍生化条件的选择
NMP 与糖的衍生随溶剂不同衍生化产率有显著差异 。实验中分别选取ACN 、MeOH 、THF 、N , N-
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第 1 期 分 析 科 学 学 报 第 26 卷
表 1　NMP和 PMP的最大紫外吸收波长和摩尔吸光系数
Table 1　The maximum absorption wavelength and molar absorbance coefficients of NMP and PMP
Solvent
NMP PMP
Abso rbance
Mo la r abso rptivity
(×10 -4) Absorbance
Molar absorptivity
(×10-4)
Ace tonitrile 0.419(214 nm) 4.19 0.219(243 nm) 2.19
0.558(243 nm) 5.58
Methanol 0.309(214 nm) 3.09 0.128(243 nm) 1.28
0.330(243 nm) 3.30
Ethanol 0.385(214 nm) 3.85 0.114(249 nm) 1.14
0.409(243 nm) 4.09
Tetr ahydrofuran 0.515(243 nm) 5.15 0.166(247 nm) 1.66
二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)作溶剂 ,对衍生产率进行了考察 。结果表明 ,在 DMF 、DMSO 和
ACN 中的衍生产率基本相同 ,均高于在 MeOH 和 THF 中的衍生产率。考虑到衍生液的后续处理 ,实验
中选用 ACN 作溶剂 。NMP 与糖的衍生化随碱性催化剂的不同 ,导致不同的衍生化产率 。林雪等[ 19] 改进
了 PMP 与单糖的衍生反应 ,用氨水代替 NaOH 作碱性催化剂 ,得到了满意的结果 。本实验采用 17%氨
水作为催化剂 ,可得到与 NaOH 作催化剂相同的效果 ,且反应产物可直接用氮气吹干 ,从而简化了衍生液
的后续处理 。衍生化产率随温度升高而提高 , 超过 70℃后衍生产率随之降低 , 实验中选择衍生化温度为
70℃, 衍生化时间 35 min。对衍生试剂用量的考察结果表明 , 衍生试剂对总糖用量的摩尔数比达 5倍以
上衍生产率恒定 , 实验选取衍生试剂用量为总糖量的 5倍 。
2.3　毛细管电泳分离条件优化
本研究考察了碳酸盐缓冲体系 、磷酸盐缓冲体系和硼酸盐缓冲体系后 ,发现硼酸盐缓冲体系对糖类衍
生物的分离效果最好 。缓冲溶液浓度的改变会造成电导的变化 ,从而引起峰形的前伸和拖尾 ,所以 ,选择
合适的硼酸盐浓度对提高分离效果具有很重要的作用 。实验在固定其它条件的前提下考察了硼酸盐浓度
在 40 ～ 65 mmo l/L 范围内对糖类衍生物分离的影响 ,发现硼酸盐浓度为 55 mmol/ L 时分离效率较高 ,迁
移时间较短。
溶液 pH 的改变会影响溶质的迁移行为和引起电渗流的变化[ 20] ,从而影响分离。考察了不同 pH 的
缓冲溶液对分离的影响 ,发现 pH =9.46时分离效率最高 ,分离时间最短 ,分离度较高。温度和电压对糖
类分离影响较小 ,为了防止温度过高或电压较高引起温度过高产生较大的焦耳热影响分离效果 ,实验选择
温度为 20℃,电压 22 kV 。单糖标准品衍生物的分离度 、迁移时间 、理论塔板数和选择性见表 2
表 2　单糖衍生物的分离参数
Table 2　Separation parameters of carbohydrates derivatives
Ca rbohydrates M ig ration time(min) N Rs α
Xy l 11.456 3.53×105 1.53 1.01
Ara 11.785 3.11×105 3.95 1.03
G lc 11.885 3.66×105 1.27 1.01
Rha 11.985 2.62×105 1.85 1.01
M an 12.845 2.85×105 7.19 1.06
Fuc 13.037 1.75×105 1.77 1.02
Gal 13.520 3.06×105 4.31 1.04
G lcUA 14.818 3.24×105 2.45 1.02
GalUA 15.704 2.92×105 8.02 1.06
2.4　重现性 、线性回归方程和检出限
在相同毛细管电泳分离条件下 ,对 100μmol/ L 糖类衍生物进行 6次平行分析 , 保留时间和峰面积重
复性见表 2 , 迁移时间相对标准偏差(RSD)小于 0.48%, 峰面积的 RSD小于 4.8%。
在最优化条件下 ,在 250 ～ 5 μmo l/L 的范围内 ,依据峰面积对单糖浓度进行线性回归 , 所得各单糖衍
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第 1 期 夏　莲等:藏药蕨麻多糖水解单糖的毛细管区带电泳分离研究 第 26 卷
生物的线性回归方程 、相关系数和检出限见表 3。各单糖衍生物的线性相关系数在 0.9980 ～ 0.9998 之
间 , 检出限(S/N=3)在 0.85 ～ 2.19 μmol/L 之间 。
表 3　单糖衍生物的线性回归方程 、相关系数 、检出限及保留时间和峰面积的重现性(n=6)
Table 3　Linear regression equations , correlation coefficients , detection limits and repeatabilities for
peak area and retention time of saccharide derivatives(n=6)
Ca rbohydrates
Reg ression
equation ＊
Cor rela tion
coefficient
RSD(%)
mig ration
time
peak ar ea
De tection
limits(μmo l/ L)
Xy l Y =1.906X -0.257 0.9996 0.48 4.8 0.89
Ara Y =2.046X +0.425 0.9997 0.48 4.6 0.85
G lc Y =1.419X +0.788 0.9991 0.46 3.4 1.26
Rha Y =1.540X -1.634 0.9980 0.44 3.5 1.49
M an Y =1.732X -1.765 0.9989 0.44 3.8 1.34
Fuc Y =1.872X -0.305 0.9995 0.46 4.3 1.60
Gal Y =2.231X -0.301 0.9998 0.47 3.2 1.02
G lcUA Y =1.273X -1.890 0.9998 0.48 4.2 2.19
GalUA Y =2.157X -3.327 0.9996 0.45 3.3 1.44
　　＊Y :peak area , X:concent rat ion of monosaccharide , μmol/ L.
2.5　回收率
在蕨麻多糖水解液中分别加入 10μL 浓度为 1.0×10-2 mol/ L 的单糖标准溶液 , 按照上述方法进行
衍生 , 重复 3次所得的各单糖的回收率在 94.83%～ 104.8%。
2.6　样品测定
取 1.3节中多糖水解液 40 μL 于 2 mL 安焙瓶中 ,依次加入NMP 溶液150μL ,17%氨水 30μL ,封口
后于 70℃水浴衍生35 min ,冷却后 N 2 吹干后 ,加水 100 μL 和乙腈 400 μL 溶解后进样分析。蕨麻多糖水
解单糖电泳分离见图 2。经多次测量得单糖含量见表 4。
表 4　蕨麻逐级沉淀多糖中各单糖含量
Table 4　The monosaccharide contents of potentilla anserina L.polysaccharicles obtained by gradually precipitation
M ono-saccharide
Content o f each mono-saccharides obtained by the hydro ly sis of
po ly saccharide from the roo t of Potentilla anserina L.plant
P50(μg/ mg) P70(μg/ mg) P90(μg/ mg)
Xy l 3.945 2.610 2.490
Ara 77.445 28.485 7.110
G lc 17.568 26.514 9.522
Rha 17.646 15.793 5.281
M an 3.942 3.114 3.420
Fuc 2.165 1.738 0
Gal 65.268 19.980 8.820
G lcUA 13.037 9.254 6.528
GalUA 33.484 53.835 0
To ta l 234.500 161.323 43.171
3　结论
采用 NMP 作为柱前衍生试剂 ,通过对衍生化条件和毛细管区带电泳分离条件的优化 ,建立了灵敏 、
快速测定单糖的方法 。实验表明 ,藏药蕨麻中含有九种单糖 ,其中以阿拉伯糖(A ra)、半乳糖(Gal)和半乳
糖醛酸(GlcUA)含量最高 ,葡萄糖(Glc)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcUA)含量居中 ,木糖(Xy l)、甘露
糖(Man)、岩藻糖(Fuc)含量相对较低 ,该方法可作为藏药蕨麻中单糖组成测定的常规方法 。本方法在藏
药蕨麻多糖测定中的成功应用 ,将为丰富植物资源的多糖药物组成分析和质量控制提供新的研究方法。
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第 1 期 分 析 科 学 学 报 第 26 卷
图 2　蕨麻多糖水解单糖的毛细管区带电泳分离图
Fig.2　Chromatograms of saccharides from Potentilla anserina L.sample by capillary zone electrophoresis
a:P50 , b:P70 , c:P90.
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Separation of Derivatized Carbohydrates of
Potentilla anserina L .by
Capillary Zone Electrophoresis
XIA Lian1 , 2 , 3 , SUN Zhi-wei1 , 3 , BAI Xin-wei2 , SUO You-rui1 , YOU Jin-mao＊1 , 2
(1.Northwest P lateau I nst itute o f Biology , the Chinese Academy o f Sciences , X ining 810001;
2.Key Laboratory o f L i f e-Organic Analy sis o f S han dong Province , College o f Chemistry Science ,
Quf u Normal Universi ty , Qu f u 273165;
3.Grad uate Universi ty of Chinese Academy o f Sciences , Bei j ing 100049)
Abstract:A simple and rapid method w as developed for the separation of derivat ized carbohydrates o f
Potent i lla anserina L .using 1-naphthy l-3-me thyl-5-py razo lone (NMP) as derivatization reagent by
capilla ry zone elect ropho resis.The detection w as perfo rmed w ith diode array at 254 nm.A 58.5 cm×50
μm i.d.(50 cm ef fective leng th)untreated fused-silica capillary w as used.The optimum condi tions are
as fo llow s:55 mmol/ L bo rate buffer (pH =9.46), voltage 22 kV , column temperature a t 20℃ and
detection at 254 nm .The samples w ere atmosphe rically introduced w ith an injection t ime of 10 s.The
results indicate that 9 NMP-derivatized carbohydrates achieve baseline resolution wi thin 16 min under
the proposed condi tions.The Potent il la anserina L .sample w as also analy zed under the optimum
condi tions.
Keywords:Poly sacchrides;Potenti l la anserina L .;1-Naphthy l-3-methy l-5-pyrazo lone(NMP);Capillary
zone elect ropho resis
30