全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(2) :291 － 296 http:/ /www． zjnyxb． cn
钟浩，高贵宾，吴良如．部分茶竿竹亚属竹种亲缘关系的 ITS序列分析［J］．浙江农业学报，2016，28(2) :291 － 296．
DOI:10. 3969 / j． issn． 1004 － 1524. 2016. 02. 18
收稿日期:2015-06-01
基金项目:中国林科院基本科研业务费专项资金(CAFYBB2014QA038) ;国家林业局竹子研究开发中心研究基金项目(ZXJJ201207) ;浙
江省科技计划项目(2014F10047)
作者简介:钟浩(1984—) ，男，浙江杭州人，硕士，助理研究员，研究方向为竹子分子遗传。E-mail:13706710845@ 163． com
* 通信作者，吴良如，E-mail:boteatree@ 163． com
部分茶竿竹亚属竹种亲缘关系的 ITS序列分析
钟 浩1，2，高贵宾1，2，吴良如1，2，*
(1． 国家林业局竹子研究开发中心，浙江 杭州 310012;2． 浙江省竹子高效加工重点实验室，浙江 杭州 310012)
摘 要:为了探讨怀集县铁厘茶竿竹和白水茶竿竹与其他茶竿竹亚属竹种之间在分子水平上的差异以及它
们的分类地位，对包括铁厘茶竿竹和白水茶竿竹在内的 9 个茶竿竹亚属竹种的核糖体基因(nrDNA)的内转
录间隔区(ITS)序列进行分析，并构建系统进化树。结果表明，所有供试材料 ITS 全长在 559 ～ 648 bp，(G +
C)含量变化范围为 46. 02% ～ 57. 65%，其中铁厘茶竿竹和白水茶竿竹 ITS 全长分别为 559 bp 和 614 bp，(G
+ C)含量分别为 55. 64%和 57. 65%。ITS序列构建的系统进化树显示:正种茶竿竹及其变种聚为一个大支，
其中铁厘茶竿竹和白水茶竿竹聚在一起。以上结果佐证了铁厘茶竿竹和白水茶竿竹是正种茶竿竹的 2 个
变种。
关键词:正种茶竿竹;ITS;系统进化树
中图分类号:Q78;S795. 1 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2016)02-0291-06
Analysis on genetic relationship of some Chagan-bamboo species by using ITS region se-
quence
ZHONG Hao1，2，GAO Gui-bin1，2，WU Liang-ru1，2，*
(1． China National Bamboo Research Center，Hangzhou 310012，China;2． Key Laboratory of High Efficient Pro-
cessing of Bamboo of Zhejiang Province，Hangzhou 310012，China)
Abstract:The molecular differences among Pseudosasa amabilis var． ferrea，Pseudosasa amabilis var． peshuiensis and
other Chagan-bamboo species were identified by analyzing internal transcribed spacer sequence in nrDNA of P． amabi-
lis var． ferrea，P． amabilis var． peshuiensis and other 7 Chagan-bamboo species． and the phylogenetic tree was estab-
lished to clarify their taxonomic status． The results showed that ITS length of all tested species ranged from 559 to
648 bp，and their (G + C)content ranged from 46. 02% to 57. 65% ． ITS length of P． amabilis var． ferrea and P．
amabilis var． peshuiensis was 559 bp and 614 bp，respectively． Their (G + C)content was 55. 64% and 57. 65%，
respectively． The established phylogenetic tree showed that P． amabilis and its varieties were clustered in one big
group，in which P． amabilis var． ferrea and P． amabilis var． peshuiensis were clustered into one small group． The a-
bove results indicated that P． amabilis var． ferrea and P． amabilis var． peshuiensis were two variants of Pseudosasa
amabilis．
Key words:Pseudosasa amabilis;ITS;phylogenetic tree
正种茶竿竹(Pseudosasa amabilis) ，属禾本科
竹亚科(Bambusoideae Nees)矢竹属(Pseudosasa)
茶竿竹组的模式种［1］，是我国特产的珍贵竹种之
一，竹秆通直、节平、壁厚、光滑、坚韧、材质优良，
可制作各种竹器家具、雕刻装饰、钓鱼竿、滑雪
杖、旗竿、篱笆等。竹材纤维含量达 53. 2%，适于
造纸和制人造丝浆［2］。正种茶竿竹主产于江西、
福建、湖南、广东、广西等省区，近年，江苏、浙江
省有引种栽培，模式标本采自广东广宁［1］，生于
丘陵平原或河流沿岸的山坡。
中国植物志记载，茶竿竹亚属有 16 种 5 变
种［1］，均分布在我国华南、华东地区之南部，而徐
英宝等［2］报道，怀集县有 3 个变种，即正种茶竿
竹(var． amabilis)、铁厘茶竿竹(var． ferrea)和白
水茶竿竹(var． peshuiensis) ，在植物志中没有记
载，其他文献也未见报道。
内转录间隔区(internal transcribed spacer，
ITS)，在被子植物较低的分类阶元上具有核苷酸序
列的高度变异性和长度保守性，它能提供详尽的、系
统学分析所需的可遗传性状，在许多被子植物的科
内、属内和属间关系的系统发育研究中已被证明是
十分有用的分子标记［3 －4］。ITS分子标记也已广泛
应用于竹类植物［5 －8］。ITS 序列短(600 ～ 700 bp)、
两端连接高度保守区，而且具有拷贝数多、长度保
守、一致进化、进化速率较快等优点，适用于被子植
物近缘属间及种间甚至居群间关系的系统学研
究［3，9］。本文利用 ITS分子标记对部分茶竿竹亚属
进行亲缘关系分析，从分子水平探讨怀集县铁厘茶
竿竹和白水茶竿竹的分类地位。
1 材料与方法
1． 1 材料
材料收集包括茶竿竹 5 个变种，包括正种茶
竿竹、福建茶竿竹(var． convexa)、薄箨茶竿竹
(var． tenuis)、铁厘茶竿竹(var． ferrea)和白水茶
竿竹(var． peshuiensis) ;还采集了茶竿竹亚属的
其他 4 个种，包括斑箨茶竿竹(P． notate)、笔竿竹
(P． guangxianensis)、近实心茶竿竹(P． subsolida)
和尖箨茶竿竹(P． acutivagina) (表 1)。其中福建
茶竿竹、薄箨茶竿竹、笔竿竹、近实心茶竿竹、斑
箨茶竿竹和尖箨茶竿竹采自福建华安竹种园;正
种茶竿竹、铁厘茶竿竹和白水茶竿竹采自广东省
肇庆市怀集县。采集的样品均通过福建省华安
县林业局华安竹种园邹跃国高级工程师的形态
学鉴定。采集竹子嫩叶的混合样，经变性硅胶快
速干燥后带回实验室置于 － 70 ℃冰箱保存备用。
表 1 材料名称及编号
Table 1 The number and name of the samples
编号 种名 采样点
1 铁厘茶竿竹 P． amabilis var． ferrea 广东怀集
2 福建茶竿竹 P． amabilis var． convexa 福建华安
3 近实心茶竿竹 P． subsolida 福建华安
4 薄箨茶竿竹 P． amabilis var． tenuis 福建华安
5 斑箨茶竿竹 P． notate 福建华安
6 尖箨茶竿竹 P． acutivagina 福建华安
7 正种茶竿竹 P． amabilis 广东怀集
8 笔竿竹 P． guangxianensis 福建华安
9 白水茶竿竹 P． amabilis var． peshuiensis 广东怀集
1． 2 方法
1． 2． 1 基因组 DNA的提取
采用改良的 CTAB法提取 9 个竹种的基因组
DNA［10］，用 Titertek-Berthold Colibri 超微量分光
光度计检测 DNA 的浓度和纯度，取 1 μL 在 1%
TAE琼脂糖凝胶上进行电泳检测 DNA 的质量，
然后定量至 100 ng·μL －1，－ 20 ℃保存备用。
1． 2． 2 ITS序列扩增与测序
根据文献［11］由上海生工合成引物 ITS5
(5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3)和 ITS4
(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) ，对 ITS1-
5. 8S rDNA-ITS2 区域进行扩增。20 μL反应体系
含 50 ～ 100 ng 基因组 DNA，0. 2 μmol·L －1 ITS5，
0. 2 μmol·L －1 ITS4，2 U Ex Taq 聚合酶，1 × PCR
缓冲液 (10 mmol·L －1 Tris-HCl，pH 8. 3;50
mmol·L －1 KCl) ，1. 5 mmol·L －1 MgCl2，0. 2 mmol·
L －1 dNTP。反应条件如下:94 ℃ 5 min;94 ℃ 60
s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35 个循环;72 ℃ 5
min;4 ℃保温［12］。PCR 产物经回收、连接(载体
为 pMD18-T Vector)、大肠杆菌转化(菌株为
DH5α)和菌液 PCR 检测后，将阳性克隆的菌液
送上海生工进行测序，同时也进行 PCR产物直接
测序，克隆测序与 PCR产物直接测序结果相同的
ITS序列用于研究［13］。
1． 2． 3 数据处理
将测序获得的序列与 GenBank 核酸序列数
·292· 浙江农业学报 第 28 卷 第 2 期
据库中的序列用 blastn 程序进行相似性比对，利
用 Vector NTI 11. 5. 1 软件选取 Clustal W 方法进
行多重序列比对，比对结果利用 MEGA 6. 0 软件
的非加权组平均法(UPGMA)构建进化树。通过
DnaSP version 5. 10 软件(http:/ /www． ub． es /
dnasp /)［12，14］分析核苷酸多样性。
2 结果与分析
2． 1 ITS序列 PCR扩增结果
从 9 个茶竿竹亚属竹种基因组 DNA 中均扩
增出一条约 600 bp的片段，图 1 所示为其中 7 个
竹种的扩增结果。
M:GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder;1 ～ 4，6 ～ 8:见表 1;
CK:以水为对照。
图 1 引物 ITS5 和 ITS4 对茶竿竹亚属竹种的 ITS序列
扩增结果
Fig． 1 The amplification result of Chagan-bamboo species
by ITS5 and ITS4
2． 2 PCR产物克隆
获得的片段转化至大肠杆菌后，以白色菌落
培养的菌液为模板，用测序引物进行 PCR检测，取
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测［12］，如图 2。
2． 3 测序结果及序列分析
测序获得的序列用 blastn程序进行相似性比
M:GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder;1 ～ 9:见表 1;CK:以水
为对照。
图 2 菌液 PCR鉴定结果
Fig． 2 The result after idenfication of the bacteria liquid
对确定为 ITS区序列。以 9 个茶竿竹亚属竹种为
研究对象，粳稻(Oryza sativa ssp． japonica)日本
晴作为外类群进行同源性分析(图 3)。由表 2 可
知，9 个竹种及水稻 ITS 序列之间的相似性均高
于 60%，其中福建茶竿竹和薄箨茶竿竹之间
达 99%。
表 2 九个茶竿竹亚属竹种 ITS序列同源性分析
Table 2 Homologous analysis of ITS from 9 Chagan-bamboo
species
1 9 2 4 7 8 3 6 5 Os
1 93 86 86 84 86 76 77 72 69
9 84 84 83 82 75 74 72 63
2 99 94 89 78 76 72 67
4 94 90 78 76 72 67
7 87 76 73 72 68
8 77 77 71 66
3 70 68 61
6 68 62
5 60
Os
注:表中数值为 ITS序列通过 CLUSTAL W多重序列比对后计算
所得相似性;1 ～ 9:见表 1;Os:水稻。
9 个茶竿竹亚属竹种 ITS 序列长度差异较
大，为 559 ～ 648 bp，(G + C)含量变化范围为
46. 02% ～57. 65%。而与外类群日本晴相比，无
论是序列长度还是(G + C)含量都存在较大的差
异(表 3)。
9 个茶竿竹亚属竹种 ITS 序列中共有 118 个
单一信息位点(singleton variable sites) ，其中二变
异体信息位点 80 个，三变异体信息位点 33 个，
表 3 ITS序列(G + C)含量和长度多态性分析
Table 3 (G + C)contents and length polymorphism of ITS
植物材料 长度 /bp (G + C)含量 /%
1 559 55. 64
2 565 55. 58
3 648 50. 93
4 567 55. 56
5 591 46. 02
6 636 53. 62
7 571 55. 17
8 565 55. 22
9 614 57. 65
Os 799 48. 56
注:1 ～ 9:见表 1;Os:水稻。
·392·钟 浩，等．部分茶竿竹亚属竹种亲缘关系的 ITS序列分析
红色方框表示引物 ITS5 和 ITS4 所在的位置;1 ～ 9:见表 1;Os:水稻。
图 3 九个茶竿竹亚属竹种 ITS序列同源性分析
Fig． 3 Homologous analysis of ITS from 9 Chagan-bamboo species
·492· 浙江农业学报 第 28 卷 第 2 期
四变异体信息位点 5 个;142 个简约信息位点
(parsimony informative sites) ，其中二变异体信息
位点 62 个，三变异体信息位点 60 个，四变异体
信息位点 20 个。插入 /缺失位点(InDel)141 个
(表 4)。
表 4 ITS序列多态性位点分析
Table 4 Polymorphism and InDel sites of ITS
多态区域 变异类型 位点数量
单一信息位点 二变异体信息位点 80
三变异体信息位点 33
四变异体信息位点 5
简约信息位点 二变异体信息位点

62
三变异体信息位点 60
四变异体信息位点 20
插入 /缺失位点

141
2． 4 ITS序列系统演化分析
利用 MEGA 6. 0 软件的非加权组平均法
(UPGMA)对 9 个茶竿竹亚属竹种 ITS 序列构建
进化树(图 4)。结果显示，正种茶竿竹及其变种
聚为一个大枝(图中黑框所示，自展值为 100%) ，
其中怀集县的 2 个茶竿竹变种铁厘茶竿竹和白
水茶竿竹聚在一起(自展值为 100%) ，而笔竿竹
也在其中。茶竿竹亚属的其他 3 个种，包括斑箨
茶竿竹、近实心茶竿竹和尖箨茶竿竹各成一枝。
3 讨论
从以上结果来看，聚类比较清晰，与经典的
茶竿竹亚属分类(植物志)有其一致性。如笔竿
竹在经典的分类中就与正种茶竿竹亲缘关系较
进化树是将 PCR分离的 9 个茶竿竹亚属竹种的 ITS序列通过多重序列比对以水稻 ITS序列为外类群构建;显示的自展值是 1 000。
图 4 茶竿竹亚属 ITS序列 UPGMA系统进化树
Fig． 4 The UPGMA tree of Chagan-bamboo species by using ITS sequences
近，在进化树中与正种茶竿竹聚在一起;怀集县
的 2 个茶竿竹变种铁厘茶竿竹和白水茶竿竹以
100%的支持率聚在一起，它们又与其他 3 个茶
竿竹变种以 100%的支持率聚在一起，从分子水
平上佐证了它们是茶竿竹的 2 个变种，而且体现
了一定的地理特异性。福建茶竿竹和薄箨茶竿
竹之间 ITS序列相似性达 99%，在进化树中也以
100%的支持率聚在一起，这与植物志中茶竿竹
分变种两者的分类地位一致。其他 3 个竹种(尖
箨茶竿竹、近实心茶竿竹和斑箨茶竿竹)在进化
树中的位置也支持经典的茶竿竹亚属分类。
竹类植物作为进化上的一个特殊类群，其茎
(秆)高度木质化，营养生长周期长，且以营养繁
殖为主，一旦开花，整片竹林死亡，导致繁殖器官
很难获得，常用于分类的外部形态特征也会由于
环境的变化而变化，使得竹子分类比较困难也比
较混乱。本文采用的 ITS分子标记从分子水平对
茶竿竹亚属竹种进行鉴定，揭示其遗传物质内在
的差异，没有时空限制。
ITS序列的进化较稳定、独立，序列分析也较
少受主观影响;ITS序列中氨基酸或 DNA 碱基替
换率能够为物种间的分支年龄和多样化率提供
更有效的评估，从而保证更好的分离效率［13］。
由于本身位点内(intralocus)和位点间(interlo-
cus)进化的同步性，在许多物种内 ITS 不存在位
点多态性，一般较少用于种以下水平的研究。但
仍有不少报道发现 ITS 序列种内、亚种和居群间
存在多态性［15］。大多数的被子植物种间 ITS 差
·592·钟 浩，等．部分茶竿竹亚属竹种亲缘关系的 ITS序列分析
异值为1. 2% ～ 10. 2%，属间差异值为 9. 6% ～
28. 8%［15 － 16］，而本文的研究结果表明，茶竿竹亚
属内种间差异值较高，达到 10% ～ 32%，可见，
ITS分子标记适用于茶竿竹亚属内系统发育的研
究，当根据形态鉴别有困难时，可提供一种候选
的，也是可靠的鉴别方法。
参考文献:
［1］ 耿伯介，王正平． 中国植物志第九卷第一分册［M］． 北
京:科学出版社，1996:639 － 659．
［2］ 徐英宝，许本立． 广东怀集茶秆竹生物学特性的初步研究
［J］． 竹子研究汇刊，1984，3(2) :48 － 61．
［3］ 李林，董敦义，丁雨龙． 竹类分子系统学中的 DNA 标记
［J］． 林业科技开发，2009，23(1) :10 － 15．
［4］ 张汉尧，刘小珍，龚秀会，等． 竹子 DNA提取方法改良及
ITS-RFLP分析的初步研究［J］． 江西林业科技，2006 (3) :
3 － 5．
［5］ HODKINSON T R，RENVOIZE S A，CHONGHAILE G N，et
al． A comparison of ITS nuclear rDNA sequence data and
AFLP markers for phylogenetic studies in Phyllostachys(Bam-
busoideae，Poaceae) ［J］． Journal of Plant Research，2000，
113(3) :259 － 269．
［6］ GUO Z H，CHEN Y Y，LI D Z，et al． Genetic variation and
evolution of the alpine bamboos (Poaceae Bambusoideae)
using DNA sequence data［J］． Journal of Plant Research，
2001，114(3) :315 － 322．
［7］ 诸葛强，丁雨龙，续晨，等． 广义青篱竹属(Arundinaria)
核糖体 DNA ITS 序列及亲缘关系研究［J］． 遗传学报，
2004，31(4) :349 － 356．
［8］ GUO Z H，LI D Z． Phylogenetics of the Thamnocalamus group
and its allies (Gramineae:Bambusoideae) :inference from the
sequences of GBSSI gene and ITS spacer［J］． Molecular Phy-
logenetics and Evolution，2004，30(1) :1 － 12．
［9］ 张峰． 用于植物分子系统学研究的基因片段［J］． 山东科
学，2004，17(1) :55 － 58．
［10］ DOYLE J J，DOYLE J L． A rapid DNA isolation procedure
for small quantities of fresh leaf tissue［J］． Phytochemistry，
1987，19(1) :11 － 15．
［11］ WHITE T J，BRUNS T，LEE S，et al． Amplification and di-
rect sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phyloge-
netics［M］/ / INNIS M A，GELFAND D H，SNINSKY J J，et
al． PCR protocols:A guide to methods and applications．
New York:Academic Press． 1990:315 － 322．
［12］ 钟浩． mariner-like转座子在竹亚科的分布、多态性、进化
及转座特性的研究［D］． 杭州:浙江农林大学，2010．
［13］ 尹昭坤，廖承红，徐立新，等． 基于 ITS序列分析对海南
普通野生稻籼粳分化的研究［J］． 生物技术进展，2012，
2(4) :270 － 275．
［14］ LIBRADO P，ROZAS J． DnaSP v5:A software for compre-
hensive analysis of DNA polymorphism data［J］． Bioinformat-
ics，2009，25(11) :1451 － 1452．
［15］ 闫艳华，金华，侯和胜，等． 抗逆速生吴屯杨与近缘种的
ITS序列分析［J］． 贵州农业科学，2011，39(4) :180
－ 183．
［16］ 屈良鹄，陈月琴． 生物分子分类检索表———原理与方法
［J］． 中山大学学报(自然科学版) ，1999，38(1) :1 － 6．
(责任编辑 张 韵)
·692· 浙江农业学报 第 28 卷 第 2 期