全 文 ：天 津 中 医 药
Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine
2009年 6月第 26卷第 3期
Jun． 2009, Vol．26 No．3
蕨麻为蔷薇科委陵菜属鹅绒委陵菜（Potentilla
anserine L．）的地下块根，《青海高原药物图鉴》载为
“常用上药”。有研究表明，蕨麻可显著提高机体对
氧的利用率，具有明显的抗缺氧作用[1-2]。为确定蕨
麻抗缺氧活性有效部位，笔者通过建立原代培养大
鼠心肌细胞缺氧损伤模型，研究蕨麻正丁醇部位对
心肌细胞缺氧损伤的保护作用。
1 材料
1.1 动物 新生 1~3 d SD乳鼠 100只，雌雄兼用，
由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提
供（许可证号：SCK-(军)2002-001）。
1.2 试剂 蕨麻购自青海，蕨麻正丁醇部位由本室
制备（每克相当于蕨麻生药 10 g）。取复方丹参滴丸
按照《中国药典》（2005年版）方法制备阳性对照药。
胰蛋白酶和噻唑蓝（MTT）购自北京鼎国生物技术开
发中心；DMEM/F-12培养基购自 Gibco公司；胎牛
血清购自中国医学科学院血液病研究所；5-溴-2-
脱氧尿嘧啶（5-Brdu）购自 Sigma公司；青霉素、链霉
素购自 Amresco公司。乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、肌
酸激酶(CK)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒和
丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程公司。
1.3 仪器 3111型 CO2培养箱（美国Thermo forma），
TS100倒置相差显微镜（日本 Nikon），Galaxy-R混
合气体培养箱（英国 RSBiotech），680 酶标仪（美国
Bio-Rad），UV-1601紫外可见分光光度计（日本岛津）。
2 方法
2.1 原代培养心肌细胞缺氧模型制备与实验分组
2.1.1 原代培养心肌细胞培养 取新生 1~3 d 的
20 只 SD 乳鼠，心室肌剪成约 1 mm3 组织块，以
0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸二钠溶液
（EDTA）37 ℃下消化 3 次，10 min/次，离心，弃去首
次消化上清液，收集其他各次上清液加入等体积的
DMEM/F-12培养基终止消化，离心收集心肌细胞，
加入含 10%胎牛血清的 DMEM/F-12 培养基和 5-
Brdu（终浓度 0.1mmol/L），轻轻吹打混匀，接种于 25cm2
培养瓶中，于 37 ℃、5% CO2培养箱中孵育 70 min，
使绝大部分非心肌细胞贴壁。吸取培养瓶内细胞悬
液计数，调整细胞浓度为 1×108个/L，接种到 24 孔
板，每孔 1 mL；96孔板，每孔 200 μL。待 48 h细胞贴
壁后，更换含 10%胎牛血清的 DMEM/F-12培养基
（不含 Brdu），每 2 d换液 1次，培养 4 d。
2.1.2 心肌细胞缺氧模型制备 取上述培养 4 d的
心肌细胞，换无血清 DMEM/F-12培养基连续培养
24 h后，用预先以 95%N2-5% CO2混合气饱和 30 min
的 D-Hank’s液（氯化钠 8 g，氯化钾 0.4 g，十二水合
磷酸氢二钠 0.13 g，磷酸氢二钾 0.06 g，碳酸氢钠
0.35 g，酚红 0.02 g，溶于 1 L三蒸水中）替代正常培
养基，而后将培养板移入混合气体培养箱（95%N2、
5% CO2、O2浓度<1%），于 37 ℃缺氧培养 6 h [3]。
2.1.3 实验分组 实验设空白对照组、缺氧损伤模
型组、3 g/L复方丹参阳性对照组及蕨麻正丁醇部位
3、1.5、0.75 g/L浓度组。缺氧损伤模型组只加等体积
*基金项目：国家自然科学基金（No. 30672774）。
作者简介：王 舒（1984-），男，2006级硕士研究生，主要从
事天然产物活性成分研究工作。
通讯作者：李灵芝。
蕨麻正丁醇部位对缺氧损伤心肌细胞的保护作用 *
王 舒 1，韦 薇 2，李灵芝 2，3,李 怡 3，李建宇 3，张 丽 3
（1.天津医科大学药学院，天津 300070；2.天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室，天津 300162；
3.武警医学院药物化学教研室，天津 300162）
摘要：[目的] 研究蕨麻正丁醇部位对缺氧损伤心肌细胞的保护作用。 [方法] 建立大鼠原代培养心肌细胞缺氧损
伤模型，采用噻唑蓝（MTT）法检测心肌细胞代谢活力；胎盼兰染色法检测细胞成活率；比色法测定细胞外乳酸脱氢酶
（LDH），肌酸激酶（CK）活性及细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。 [结果] 与模型组比较，蕨麻
正丁醇提取部位各剂量组细胞代谢活力及细胞成活率显著提高 (P<0.01)，并均可显著减少缺氧损伤引起的 LDH、CK
的外漏量(P<0.01)，提高细胞 SOD活性(P<0.01)，减少 MDA的产生(P<0.01或 P<0.05)。 [结论] 蕨麻正丁醇部位具有抗
心肌缺氧损伤作用，其途径之一可能与其抗自由基氧化的能力有关。
关键词：蕨麻；正丁醇部位；缺氧；抗氧化
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1519(2009)03-0250-03
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溶媒，与各药物干预组一同缺氧培养；空白对照组用
等体积 D-Hank’s液替代正常培养基，同时培养于
5% CO2培养箱中，每组 6个复孔。
2.2 心肌细胞存活率测定 各组细胞培养 6 h后，
0.25%胰蛋白酶液消化，制成细胞悬液，胎盼兰染
色。蓝染细胞为死细胞，活细胞则拒染。在倒置相差
显微镜下，用计数板分别计数活细胞和死细胞，按下
式计算细胞存活率。
细胞存活率 (%) =活细胞总数÷(活细胞总数 +
死细胞总数)×100%
2.3 心肌细胞代谢活力测定 接种于 96孔板的心
肌细胞，缺氧模型组及各药物干预组缺氧培养 6 h，
正常对照组则于 37℃、5%CO2培养箱中同步孵育 6h，
而后取出各组样本，每孔加入 20 μL MTT（5 g/L），于
37℃、5% CO2孵箱中继续孵育 4 h，终止培养，倒板。
加入 150 μL二甲基亚砜（DMSO）振摇 15 min，使结
晶充分溶解，于测定波长 570 nm、参考波长 630 nm
处，测定各孔吸光度（O.D）值。
2.4 心肌细胞外 LDH、CK活性测定 接种于 24孔
板的各组心肌细胞，缺氧模型组及各药物干预组缺
氧处理 6 h，正常对照组同样于 37 ℃、5% CO2培养
箱中同步孵育 6 h，而后取各组细胞培养上清液，用
取新生 1~3 d的 SD乳鼠心室肌，实验操作按试剂盒
说明进行。
2.5 心肌细胞内 SOD活性、MDA含量测定 接种
于 24孔板的各组心肌细胞，同上处理 6 h后，0.25%
胰酶消化，血清终止，离心 1 000 r/min，10 min，加
0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）1 mL溶解沉淀制成
细胞悬液，细胞超声仪粉碎。用黄嘌呤氧化酶法测
定细胞内 SOD活性；用硫代巴比妥酸比色法测定细
胞内 MDA含量，操作方法按试剂盒说明进行。
2.6 统计学处理 采用 SPSS 11.5软件进行方差分
析，P<0.05为有统计学差异。
3 结果
与正常对照组比较，MTT法测得模型组心肌细
胞 OD值显著减小，细胞成活率显著降低（P<0.01），
LDH及 CK的外漏量显著增加（P＜0．01）；细胞内
SOD活性显著下降（P＜0．01）；MDA 含量显著增加
（P＜0．05）；与模型组比较，蕨麻正丁醇提取部位各剂
量和复方丹参组 O．D值显著增大（P＜0．01）（见表
1），并均可显著减少缺氧损伤引起的 LDH、CK的外
漏量（P＜0．01）（见表 2），提高细胞 SOD 活性（P＜
0．01），减少MDA的产生（P＜0．01或 P＜0．05）（见表 3）。
4 讨论
心肌细胞因缺血缺氧受到损伤时，线粒体功能
异常，氧化呼吸链受损，电子传递阻断，ATP产生减
少。琥珀酸脱氢酶是琥珀酸氧化呼吸链里重要的复
合酶之一，琥珀酸脱氢酶的活性，可以反映心肌细胞
缺氧损伤的程度。利用琥珀酸脱氢酶可以催化噻唑
蓝（MTT）生成紫红色不溶性产物的特性，可通过吸
光度的变化反映细胞的代谢活力。本实验结果表明，
缺氧模型组比正常对照组吸光度值显著降低，表明
表 2 不同处理对缺氧损伤心肌细胞 LDH和
CK外漏量的影响(x±s)
Tab.2 Effects of different treatment on the leakages of
LDH and CK in cardiomyocytes injured by hypoxia (x±s)
组别
对照组
缺氧模型组
复方丹参 3 g/L
蕨麻正丁醇部位 3 g/L
蕨麻正丁醇部位 1.5 g/L
蕨麻正丁醇部位 0.75 g/L
n
6
6
6
6
6
6
LDH (U/ L)
51.23±3.47
92.10±5.26*
65.75±3.28△
56.49±4.27△
61.34±4.78△
70.55±4.83△
CK (kU/L)
0.09±0.010
0.28±0.015*
0.12±0.015△
0.09±0.007△
0.11±0.007△
0.16±0.010△
注：对照组相比 *P<0.01，与对照组相比△P<0.01。
表 1 不同处理对缺氧损伤心肌细胞存活率及
代谢活力的影响 (x±s)
Tab.1 Effects of different treatment on the survival ratio and the
metabolic activity of cardiomyocytes injured by hypoxia (x±s)
组别
对照组
缺氧模型组
复方丹参 3 g/L
蕨麻正丁醇部位 3 g/L
蕨麻正丁醇部位 1.5 g/L
蕨麻正丁醇部位 0.75 g/L
n
6
6
6
6
6
6
心肌细胞存活率(%)
94.1±1.2
57.7±3.9*
80.8±3.9△△
82.3±4.1△△
81.2±3.8△△
79.9±4.0△
OD
0.315±0.012
0.053±0.003*
0.070±0.008△
0.157±0.011△△
0.104±0.019△△
0.039±0.011△
注：与对照组相比 *P<0.01，与模型组 △△P<0.01, △P<0.05。
表 3 不同处理对缺氧损伤心肌细胞 SOD活性和
MDA含量的影响 (x±s)
Tab.3 Effects of different treatment on the activity of SOD and the
content of MDA in cardiomyocytes injured by hypoxia (x±s)
组别
对照组
缺氧模型组
复方丹参 3 g/L
蕨麻正丁醇部位 3 g/L
蕨麻正丁醇部位 1.5 g/L
蕨麻正丁醇部位 0.75 g/L
n
6
6
6
6
6
6
SOD (kU/mL)
117.7±17.36
40.11±7.69**
80.99±6.91△△
75.91±4.61△△
78.36±5.57△△
81.23±6.29△△
MDA(mmoL/L)
7.60±1.05
8.81±0.73*
6.38±0.68△
4.60±0.56△△
6.30±0.27△
6.93±0.66△
注：与对照组相比，**P<0.01，*P<0.05，与模型组相比△△P<0.01，
△P<0.05。
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细胞内琥珀酸脱氢酶的活性已经降低，细胞呼吸功
能受损，说明缺氧 6 h可以损害心肌细胞代谢能力，
细胞存活率的降低也证实了这一点。与缺氧模型组
相比，不同剂量蕨麻正丁醇部位处理后，细胞代谢活
力及细胞存活率显著提高，说明蕨麻正丁醇部位能
减弱缺氧导致的心肌细胞琥珀酸脱氢酶活性的损
害，维持缺氧损伤心肌细胞的呼吸功能。缺氧导致
细胞急性损伤时，细胞膜完整性遭到破坏，细胞通透
性增加，LDH 将从胞浆中释放出来，因此细胞外
LDH活性可间接反映胞膜的完整性。肌酸激酶（CK）
是重要的心肌酶之一，其释放量直接反映了心肌缺
氧损伤的程度。故细胞外 LDH、CK活性越高，表明
细胞损伤越严重。本实验结果显示，与缺氧模型组
比较，蕨麻正丁醇部位各剂量组均可显著减少缺氧
条件下心肌细胞 LDH及 CK的外漏量，且其外漏量
随蕨麻正丁醇部位浓度的升高而减少，说明其可在
急性缺氧时，一定程度上维持心肌细胞膜的完整性。
各剂量组在减少细胞 LDH、CK外漏，升高 SOD活
性，减少膜脂质过氧化产物 MDA方面的作用均可
达到 3 g/L复方丹参干预的效果。
心肌缺血缺氧时，机体抗氧化防御系统受损，并
诱发氧自由基的大量产生，而组织中清除氧自由基
的 SOD活性则降低，导致氧自由基堆积，使机体氧
自由基产生和清除的动态平衡遭到破坏，继而引起
脂质、蛋白质和 DNA的氧化损伤[4]。本实验结果显
示，蕨麻正丁醇部位可以显著提高缺氧心肌细胞内
SOD活性，减少脂质过氧化产物 MDA的产生。表明
该部位可通过增强心肌细胞清除自由基的能力，减
弱缺氧导致的细胞膜氧化损伤，从而对心肌细胞起
到保护作用。
赵赤等曾在以往的实验中采用小鼠窒息性缺氧
模型证实蕨麻正丁醇提取部位显示出很强的抗缺氧
活性[5]。李建宇等采用垂体后叶素致小鼠心肌缺血
模型证实该部位对小鼠急性心肌缺血损伤具有保护
作用，可提高心肌缺血小鼠血清 SOD活性，降低
MDA水平，减少 LDH和 CK的释放[6-7]。本次实验也
证实该部位像蕨麻乙醇总提取物一样能在缺氧条件
下稳定心肌细胞膜，提高细胞清除自由基的能力，减
弱细胞膜氧化损伤，提示蕨麻正丁醇部位具有抗心
肌缺氧、缺血损伤作用，其作用途径之一可能与其抗
自由基氧化的能力有关。
参考文献：
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（收稿日期：2008-11-12）
Protective effect of the silverweed cinquefoil root n-butanol fraction on the cardiomyocyte injured by hypoxia
WANG Shu1, WEI Wei2, LI Ling-zhi2,3*, et al
(1. Pharmaceutial college, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China;
2. Tianjin Key Laboratory of Occupational and Environmental Hazards Biomarkers, Tianjin 300193, China;
3. Department of Pharmaceutical Chemistry, Medical Collage of Chinese Peoples Armed Police, Tianjin 300162, China)
Abstract: [Objective] To study the protective effect of the silverweed cinquefoil root n-butanol fraction on the cardiomyocyte injured by
hypoxia. [Methods] Myocardiocyte injured by hypoxia was established in rats in vitro. The metabolic activity and the survive rate of the
myocardiocytes were determined respectively with MTT and Trypan blue stain. The activities of lactate dehydrogenase(LDH) and creatine
kinase(CK) out of cells and superoxide dismutase (SOD) in cells, and the level of malondialdehyde(MDA) in cells were measured by spec -
trophotometry. [Results] Comparing with model group, the metabolic activity and the survival rate of cardiomyocytes were increased sig -
nificantly in all groups treated by silverweed cinquefoil root n-butanol fraction (P<0.01), the releases of LDH, CK from myocardiocytes re-
sulted from hypoxia were reduced(P<0.01), the activity of SOD was improved (P<0.01) and the production of MDA was inhibited in cells
during hypoxia injury. [Conclusion] The silverweed cinquefoil root, n-butanol fraction exerts a remarkable protective effect on cardiomy-
ocyte during hypoxia by improving the ability of clearing oxygen free radial in cardiac myocyte and inhibiting the oxide injury to mem -
brane. It suggests that the silverweed cinquefoil root, n-butanol fraction can inhibit injury of cardiac muscles during hypoxia and this may
be related with its anti-oxide ability.
Key words: silverweed cinquefoil root; n-butanol fraction; hypoxia; anti-oxide
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