全 文 ：利用球茎大麦杂交诱导单倍体的研究 ”
宋 仁 敬
(贵州农学院 )
利用球茎大麦 ( H o r d e u m b u l b o s u m ) 杂
交诱导单倍体 ,我们从七六年开始研究 。 研究
内容包括 : 如何提高球茎大麦与普通小麦杂
交诱导单倍体的效率 ; 离体穗杂交与幼胚培
养的技术 , 进行了幼胚发育分化与形态建成
细胞胚胎学的观察 ; 对单倍体植株培育与二
倍化等技术作了比较系统的试验与分析 , 对
诱导单倍体的机理作了初步的探讨。 试验结
果表明 , 利用球茎大麦与普通小麦杂交诱导
单倍体的效率比花培诱导单倍体的效率高 ,
一般诱导效率达 5 . 8%~ 10 % ,技术简易。 球
茎大麦杂交诱导单倍体的技术在遗传育种中
具有重要意义 。
.、).、
材 料 和 方 法
材料 父本一球茎大麦 ( H o dr eu m lbt 卜
b o s
u m )
~
母本一普通小麦 ( T r i能 u m ae s气
呈v u m ) 若干个杂交组合的 F , 、 F Z 、 r 3植株及
阿波 、 劳夫林等品种 。
离体穗培养在麦穗开花前两天 , 分别从
父母本植株上选取发育健壮无病虫害的穗 ,
带一剑叶从植株上剪下 , 插入盛 有 培养 液
的 30 0毫升烧杯或三角瓶中室内培养 。培养液
选用 K n o p , H oa g l an d和 自研 7 9 一 1 完全培
养液。 靠窗自然散光光照 , 温度26 ~ 29 ℃ 。
每日摇动培养液一次 。 培养液使用 3 , 4 日
更换。
杂交 采用常规有性杂交法 。 为促使受
精过程的进行 , 运用大量花粉重复授粉法 ,
授粉后次日用赤霉酸 ( G A 3 ) 75 P P m的 溶液
处理授粉柱头及子房。 室内杂交 可 全 日 进
行 , 只需在杂交时用 1 0 瓦白炽 灯 光照父母
本穗即可刺傲开花授粉杂交 。
幼胚的接种与培养 · 授粉后 13 ~ 15 天从
母本穗上取下具幼胚的颖果 , 经 0 . 1% 的升汞
或 :1 S OQ的新洁尔灭溶液消毒灭菌后 , 切去毛
刷部位接种于盛培养茎的试管或三角瓶中。
同时采用嫁接培养法培养幼胚 。 在无菌条件
下将幼胚解剖下来 , 嫁接于普通小麦 (任一品
种发育 15 天左右去胚 ) 的胚乳上 , 再接种于
培养基上培养 。 幼胚进行暗培养 , 培养室温
25 ~ 28 ℃ 。 幼胚萌动后每日加光 3 0 0 0勒克斯
1 小时 。 成苗后移栽入花盆土中培养 。 幼胚
培养基选用 B l a y d e s , M S 、 B 。 、 N 。及马铃 薯
等基本培养基 。 不附加生长 素 , 琼脂 0 . 7~
0
.
9%
, 蔗糖 7 ~ 9 % , p H H S . 8一 6 . 4 。
显微制片 作胚胎学显微观察的幼胚 ,
先行ca r , oy , s液固定 4 一2通小时 , 石蜡包 埋
切片 , 切片厚 12 微米 。 ’ 海登汉苏本精番红对
染制成永久片 , 显微拍片观察分析 。 单倍体
根尖细胞染色体鉴定 , 压碎法苏本精或醋酸
洋红染色作显微镜检 。
试 验 结 果
一 、 球茎大凌生态及形态学特征
球茎大麦有二倍体 (2 n 二 14 ) 和 四 倍
* 本院张庆勤及兴义地区农业局邹升银两 同志
曾参加部分研究工作 . 本院潘世元同志协助 田间试
验工作 . 特此致谢 。
本论文曾在中国遗传学会 1 0 8。年 U 月于广州 召
开的植物单性生殖学术会议全体会上宣读 .
体 (2= n 28) 两种 。 本试验所用 材 料为四
倍体图版 1 。
球茎大麦是一野生异花授粉 多 年 生 物
种 。 原产于沿地中海的一些左陵地区 , 在摩
洛哥 , 意大利 , 西班牙以及苏联都有发现 。
我国有弓}种栽培。
生态特征 球茎大麦为半冬 性 长 日 照
型 。 冬季要求60 ~ 70 天 5 ℃低温条件通过春
化阶段 , 光照阶段要求20 ℃ 16 小时的光照条
件 。 在贵阳地区栽培需要补充光照才能与半
冬性的普通小麦同一时期抽穗开花 。
形态特征 植株高 80 ~ 1 0 厘米 , 分 菜
旺盛 。 一小穗具三小花 , 中间小花为完全两
性花 ,两性花 ,具雄蕊三个 。 茎杆基部有 1 ~
2 厘米直径的球形结构 , 由此取名球 茎 大
麦 。 球茎为天性凡殖器管 , 可 以繁殖 ,无性
系 , 繁殖系数很高。 生长健壮正常抽德的植
株 , 晴天于早上 7 时开花散粉 , 阴天推迟在
8 ~ 9 时开花散粉。 每稼开花顺序自中上而
下 。 一穗开花散粉的延续时间 3 天左右 。 加
之花药长大 , 药囊充满花粉 , 杂交时极易获
得大量花粉 , 因此很有利于对母本进行大量
花粉重复授粉 。
二 、 球茎大麦与普通小麦杂交诱导单倍
体的程序和技术
利用球茎大麦杂交诱导单倍体的程序可
包括 : 培育球茎大麦产生大量优良的花粉 ,
与被诱导的母本植株授粉杂交获得幼胚并离
体培养产生单倍体植株 (图 1 ) 。上述所列杂
交诱导单倍体的技术为一般的技术程序 , 欲
使利用球茎大麦与普通小麦杂交高频率地诱
、 要单精钱愁还直接砂及六系列技术与理论问
`题。 夕九年来作者在这方面作了一些试验和探
讨 :
1
、 提高杂交受精结实率 : 由于球茎大
麦与普通小麦之间为属间杂交 , 若仅采用一
般的常规杂交技术 , 结实极低甚而不结实。
因而有必要采用一些有效的辅助措施 , 促使
受精过程的顺利进行。 有下列措施 :
第一 : 大量花粉重复授粉可提高受精结
实率 。
第二 、 不同时间施用G执对受精结实 的
影响。 授粉后越用G A赴理小花柱头和 子房有促进受精结实的作用。 但由于施用的时间
不同 , 作用效果也不同 , 试 验 表 明 , 施 用
G A
,的时间以授粉后的次 日及第三 日早 上 9
一 10 时进行效果最好 ,以此技术处 理的 D G D
高凡结实率可达 8 、 8时。 而在授粉后次 日 下
午 3时施用卿结实率仅有 2 . 6纬。 若在次日上
午 9 一 10 时施用 , 结实率又可提高 为 5 . 8 %
(表 1 ) 。
O D 高 , 2
浪
络二` 三 a 第二日土午
份一 1 0时
第二日下
每本小花技
粉后施 用
。 ^ 时问
上午获. 10 时 午 3时
第三 , 不同培育条件及不同花粉来源对
受精结实率的影响 。 为提高有性杂交工作效
率 , 采用室内离体稼培养杂交的技术一般可
比室外杂交提高工 效 3 ~ 令倍 。 但 受 精 结
实率有所下降 (表 2 ) , 这是由于离体培养的
穗 , 在离体培养过程中 , 遭到了生理上和组
织上的严重破坏 , 又不能在短时的培养过程
中得到恢复 , 这就必然对受精结实带来不 良
影响 , 致使室内离体穗峰养杂拿祷于室外正
公 常株杂交的结实率。 取阿波穗离体室内培养
让其自然开花授粉 自交 , 结实率也只有正常
结实的 70 ~ 80 % , 这表明室内离体穗培养杂
交的技术有待进一步研究 。
促使离体穗培养再生根 目前室内离
体穗培养杂交结实率低的主要原因来自于培
养的离体穗在整个培养过程中 , 不从切 口或
节上再发根 , 致使离体在培养过程中 , 仅仅
依靠切 口处受伤细胞的内渗作用被动地吸收
水份积极有限地获得所需的 N 、 P 、 K 等元
素。 因而离体穗极易枯黄早衰 , 严重影响受
精结实的正常进行 。 为促使离体穗培养再生
根 , 曾设计了几种包含生长激素的培养液使
其再诱发新根 , 均未获得成功 。
2
、 培养液的选配 : 在目前还不能诱使
培养中的离休穗再生根的情况下 , 要使授粉
表 2 : 不向给育条珍友木同花粉来滩
对吸抽结实率的璐晌肠
母本培育条件 ! 花粉来源 授小花粉数
结实率
(% )
结实数
室外生长株 室 外 口0 0 2 0 6 。 6
生 长株离体穗培养 3 0 0 1 2 魂。 0
室外生长株 离 休 3 0 0 1 5 5 。 O
穗培养离体穗培养 3 0 0 1 0 3 . 3
二材料 D G D高 F Z
后的离体穗维持 13 ~ 15 天至幼胚初步建成而
不枯黄 , 这就对培养液有较高的要求 。本试验
对培养液作了初步筛选 , 以自己研究的一种
低浓度培养液一一 “ 穗培 79 一 1 ” 较为适合。
大多数试验材料的离体穗在此培养液 中能较
长时间保持鲜绿而不早枯 (表 3 ) 。
表 3 离休稼在不同培养液中的生长情况比较
培 养
了9一 1
王义n o P
]l 人 t t l 一一 一l l穗 数 5 日 6 日 7 日 8 H 9 日 1 0日 1 1日 1 2 日 1 3 日 }1 4日
。
1
。
I l o a g l a l i ( I
, 试验材料 、 阿派
。 , 穗培 79 一 1培养液成份 (毫克 /升 )
C、: ( N o 3 ) : , 5 0 0 , K H Z PO ` 1 3 0 , M g S O `
·
1 1
:
0 1 3 0
,
K C I 6 0
,
F e C I : 2 5% 1 滴 , p哪 . 4一 5 . 8
不同试验材料的离体穗在 79 一 1 培养中
的反应也有差异 , 少数材料也出 现 早 衰枯
黄。
离体穗带一剑叶培养为好 试验表明
离体穗只需带 一剑叶培养就足以满足继续行
光合作用补充穗部发育所需的物质 , 多带叶
片反而增加蒸发面积加重负担 , 促使离体穗
早衰枯黄 。
3
、 球茎大麦与普通小麦不同材料杂交
结实率有很大差异尽管采取一些提高杂交结
实率的措施 , 由于球茎大麦与杂交的母本材
料具有不同的亲合力 , 杂交结实率表现出明
显的差异 , 变化幅度为 O 一 15 % (表 4 ) 。
三 、 幼胚的培养与分化
儿年的试验表明 , 促使幼胚在离体培养
中分化成苗困难较多 。 然而 , 幼胚离体培养
分化成苗又是球茎大麦杂交诱导单倍体的关
键 。 目前幼胚离体培养难以分化成苗 , 涉及
到诸方面的技术和理论上的间题 。
一
1
. 培养基 。 许多试验表明 , 幼胚培养能
否成功的关键在于如何选配适合的培养墓及
表 4 球塞大决与不同母本材料 表 5 . 在几种培养鑫中培葬幼麒的分化串
之间杂文的给共承` _
母 本 材 料 授 粉小花数 结实数 结
实率
%
不同类型分化的
比博岸陈阵八U0é ,0Uù日80即J5lanónU尸口OU,土门,止月1l贵 l x 高纽 F Z劳夫林13 义肯贵F Z高加索 X M i s s o n F :
M i s s o n x 高加索 F :
劳夫林” x 贵 I F ;
高加索 X 贵 I F 2
7 7一 3 8 0 F 3
7 7一 1 1 3 F 3
高加索
贵农 1 号
0
5
5
3
7
0
2
1 5
5
6
噩到翌尖
}
“ …库立一卜口其牛.
{粤缨毕竺共掣上牡共-竺
}叫粼一二丰军丰一阵{竺卫业公全生二生竺鱼竺上三生
, 授粉后 15 日统计
条件 , 以诱使培养中的幼胚继续进行正常的
胚胎发育 , 维持胚性生长 , 最终导致获得发
育健全的单倍体苗 。 本研究工作瞥进粉多种
培养基的筛选 。 结果表明 , 幼胚在目前常用
的几种培养基中 ( R呈j v e n 1 9 5 2 , R a p p a p o r t
1 9 5 4 , R a n g a一 S w a m y 1 9 6 8 , N o r s t o g 1 9 6 3 ,
B l a y d e s 1 9 6 6
,
M S 1 9 6 2
,
B
。
1 9 6 8
,
N
6及 马
铃薯培养基 ) 均可发生不同程度的分化 (全
苗 , 类苗 , 愈伤组织 ) 。但分化全苗的频率普
遍不高 , 无分化的幼胚其频率高达 6 6 。 6%以
上 。 几种培养基比较 , 唯有 B。培养基诱导全
苗的频 率 较 高 ( 2 0% ) , R a n g a一 SW a m y次 之
(1 。% ) , 马铃薯培养基较低 ( 6 , 6% ) , 但较之
M s与 N 。还略好 (表 5 )
2
.幼胚嫁接培养 。 利用球茎大麦杂交产
生的小麦颖果 , 绝大多数缺乏正常发育的胚
乳 , 致使胚得不到胚乳的 滋 养 而 发育受阻
碍 。 欲使幼胚在培养中维持胚性生长 , 继续进
行正常的胚胎发育 , 胚乳物质应当是不可缺
少的天然有机物 。 试验表明 , 将幼胚从发育
不全的颖果上解剖下来 , 嫁接在发育完好的
小麦胫乳上 , 再接种到培养基中培养 , 发生
了良好的作用 。 不但可提前促成全 一苗的分化 ,
同时提高了成苗百分率 (表 6 ) (图版 2 ) 。
粒 0 O 2 1
丽 0 O 6 . 6 3 。 3 6 。 6有 l 山自, 甲 , , . . ` ` . . . 目. . 万 l l l芽 扮 1 `月. 目 . .一 . ., 亩. 扣 0 0无 O念l 一 } 一 } 味 }Q 吸 叹 q n n根 举} · 拼 } , v 一l萌 { ,兰 4 牛 公 勺 ll l l} }{
(% ) 1 3
。
3 1 0
。
0 1 6
。
6 1 6
.
6 3
。
3
粒 2 1 2 0 2 0 2 1
。
(贵 l x 高纽 ) F : X 球茎大麦 等30 余 个 杂
交组合的材料 . 颖果切去毛刷部分培养 。
表 6 : 幼胚妹接与孩果培养分化成苗比较管
分化成苗
培 一 养 方 式
接 种 数
(粒 )
切除毛刷颖果培养
幼胚嫁接培养
2 0
2 O
粒 (旦百)
3 } 1 5
1 2 6 0
二 B 。培养基 .
材料组合 D G D高 F : x 球茎大麦
3
. 种胚的细胞胚胎学观察 。 目前幼胚培
养分化成苗的频率太低 , 很大部分培养的颖
果处于不分化或荫动状态 。 若能 将 这 些胚
诱导成苗 , 对球茎大麦诱导单倍体效率就更
可观了 。 试验中对这些未分化和处于萌动状
态的种胚作了胚胎显微制片观察 , 以为在培
养中采取对应措施提供细胞学的依据 。 其结
果分述如下 :
( 1)没有胚的结构气 推侧这类颖果中的
胚和胚乳的建成进行得很慢 , 当胚生长到球
形以后就败育了 (图版 7 ) 。
(幻 在胚的部位仅有似盾片薄壁组织的
结构 。 估计这类胚的发育停止在 很 早 的 阶
段 , 然后继续分化 , 导致胚的全部分生组织
向盾片薄壁组织类型渡 。
( 3 ) 具有典型的幼胫 。 盾片生长较快 ,
胚芽和胚根还未最后建成 。 培养中最易早衰
死亡 。 创造适合这类胚进一步分化发育的条
件 , 这是幼胚离体培养成苗的关键 。
( 4) 有胚的结构 。 但发育分化的方向是
胚芽部位发生了愈伤组织 , 阻止了苗的形成
(图版 3 、 6 )
四 、 单倍体植株的培养与加倍
试管中培养健全 的苗 , 长出三片叶约 10
厘米高时即可移出盆栽于土中 。 管理得好很
易成活 。 对于只出苗不分化根的材料可直接
移植入疏松肥沃土中 ,还较易出根生长 。那种
在试管中经转移培养基诱导的分化技术有时
还不及直接移植于土中的效果好 。
单倍体植株的二倍化 , 可采用 0 . 1~ 0 . 0
4 %的秋水仙碱溶液处理苗 , 使其染色体加
倍 。 但这种处理效果不及 自然加 倍 的 效果
好 。 前者处理易于造成苗的死亡 。 本试验凡
经球茎大麦杂交诱导的单倍体苗 , 经从试管
中移栽于室外盆栽 , 有一个较长的苗期生长
期 , 从当年 6 月至次年 3月长达 9个月的时
间都停滞于苗期生长 , 这样长的生长期极有
利于细胞染色体的自然加倍 , 因此 , 不必再
行人工处理加倍 。
五 、 单倍体植株在生态及形态学方面的
某些 变异
78 年经球茎大麦杂交诱导从试管中移植
于盆中栽培的 20 多株单倍体苗 , 从 当年 5月
移植至次年 3 月长达 9 个多月的时间都处于
苗期生长而不发育 , 直到 5 月才抽穗开花结
实 (在贵阳花溪半冬型小麦 6 月夏播至当年
9 月即可正常抽穗开花结实 ) 。 试验表明 , 这
一生态型变异不能遗传下去 。但它非常有利
于单倍体植株的自然加倍 。
单倍体植株在形态学方面的变异 , 表现
在较多的苗中出现圆筒形的葱状叶 。 这一变
异对整个植株生长发育无不良影响 , 也不遗
传给后代 。
六 、 经球茎大麦杂交诱导获得纯合一致
的杂种后代
利用球茎大麦杂交诱导的杂种单倍体经
二倍化后 , 田间种植表现在遗传性上完全纯
合一致 。 对 D G D高F :这组试验材料的考种分
析 , 植株在生长势 , 株高 , 穗型 , 千粒重 ,
分集等性状整齐一致 , 不再出现分离 (图版
4
.
5 )
。
问 翅 与 讨 论
一 、 球茎大麦诱导单倍体的效率
国外K a s h a , j饥 s e n , B a r k l e y 等人利用球
茎大麦与栽培大麦及中国春小麦杂交诱导单
倍体的效率比较高 , 诱导大麦单倍体的频率
为 1 2 . 9 %而用四倍体球茎大麦诱导其频率更
高 , 为 3 1 . 3% 。 本研究儿年来共 授 粉 杂 交
1 3 0。。余朵小花 , 结实率为 1 0 . 3% 。 培养幼胚
94 5粒 , 共分化苗 80 株 。 诱导单倍体的 频 率
一般为 4 . 5~ 1 3 . 4% , 诱导中国春小麦的频率
为8 . 4% ( 诱导率 = 单 倍 体苗 /培养幼胚 x
1 0 )
。这些试验表明 , 该项技术诱导单 倍 体
的效率较花培的效率略高 。 当然 , 目前从幼
胚培养分化获得健壮的全苗频率很低 , 还有
91
.
6%的幼胚发生其它非全苗的分化或完全
不分化 。 这就大大的限制了这一技术在育种
中的利用 。 故有必要对幼胚接种培 养 的 技
术 、 培养基 、 幼胚发育分化和形态建成等方
面 的问题作进一步的试验和探讨 。
二 、 关于球茎 大麦诱导单倍体的机制
利用球茎大麦杂交诱导单倍体的机制是
奇特的 。 据研究认为 , 球茎大麦与母本杂交
后 , 在形成胚胎的早期阶段 , 球茎大麦的染
色体在合子中逐渐消失或被排除 , 仅余下母
本染色体 。 经 aB r kl ey 的研究证 实 , 球 茎 大
l三,比炜
麦与中国春小麦杂交后的 1~ 6天中 , 分别
孟 固定授粉的小花 , 经细胞学检查 , 发现在合
子细胞分裂的中期 , 染色体数为 35 , 由此证
明父母本完成了正常的受精过程 。 在合子进
一步发育中 , 检查胚和胚乳组织的细胞 , 出
现落后染色体和桥 , 从而认为球茎大麦染色
体的消失就发生在这个过程中。 至于球茎大
麦的染色体为何在合子发育的过程中被排除
或消失 ,据有的研究者认为 , 是由于球茎大麦
衍生种的细胞周期与大麦衍生种的不 同步 ,
球茎大麦的体细胞周期延续时间 比 大 麦 的
长 , 因而造成染色体去除 。 但其机制有待进
一步探讨 。 作者目前正着手于这方面 的研究
和探索 。
三 、 球茎大麦杂交诱导单倍体在遗传育
种研究中的意义
单倍体育种的技术在任何植物中 , 对于
缩减所需鉴定统计的植株数量方面是一个较
好的技术 。 此外 , 单倍体法还提供了在短时
间内研究所需得到基因型的一种可能性 。 采
用诱导植物单性生殖尹花培等技术 , 均可获
得单倍体植林。 在利用种间或属间杂交产生
单倍体的方法中 , 又以利用球茎大麦杂交诱
导单倍体的技术具有较大的优越性 , 诱导频
率还有进一步提高的巨大潜力 , 这在育种 中
将有一定的利用价值 。 又由于利用球茎大麦
诱导单倍体的机制 , 据认为是染色体有选择
地消失 , 这将在染色体水平上 , 进行染色体
工程的研究中作为研究材料被利用 。 因此 ,
可以预料 , 在遗传学理论研究中 , 此项技术
也将受到重视 。
护脚` ` “ 两一两 , 内 , ,两… 州“一” ` 闷 , ,· , … 闷“ · 闪“ · 阅妞· 、 , ,肉 ` 内·闷` ,、 肉 ,~ 气 ·肉 ,内` ,一气` 、 ,矛沪公,」叮
} 巢 脾 调 换 治 蜻 法
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意蜂受大小蜂蜻危害严重 , 它主要寄生在卵 、 虫 、 子脾上 . 被害的幼蜂出房后 , 缺 翅 少腿或营养不良
而成废品 ; 受害的蜂群 , 群势下降很快 , 易感染其他病害 , 往往造成全群复没 。 用化学药物 治 蜻 , 对卵 、
虫 、 蜂及蜜均有不同程度刺激和影响 , 而且用量很严格 , 轻了不起作用 , 重了造成不应有的损失 .
因此少量蜂群 , 治瞒可 以不用药物 . 将封盖子脾提向蜂箱的两侧 , 小子脾 、 虫 卵 脾调到蜂 群 中 心 位
置 . 因蜂王不常到边脾产卵 . 当封盖子出完或出 95 % , 或箱内无子 、 卵 的 空脾和半糖脾 , 提出这些巢脾放
入中蜂群内两个封盖子脾中间清理 , 因中蜂抗埔力强 , 它可将巢脾上的蜻、 靖卵清除干净 . 强群一个晚上 ,
弱群一天多 。 然后提回意蜂群内 , 放在加脾位置 , 让蜂王产卵 .
79 ~ 80 年收花季节 , 均未采用药物治蜻 , 仅用上述方法 , 群 势 发展良好 , 很少见到蜂端成虫 . 其缺点
、 是 , 没有中蜂群或没有相当意蜂群的中蜂群 , 不能或不能完全采用 ; 庞大的意蜂场花工太大 , 无 法 采用 .
仅供边区购置药物不便 、 群数不多者参考 。
遵义鸭溪区金竹公社 牟定国