全 文 ：图 2　基因组 DNA的限制性内切酶的酶切图谱
M:DL2000 marker;1 , 2 ,3 , 4为牡丹 、葡萄 、扁豆 、苦瓜。
Fig.2　Analysi s of digested DNA from different plants by agarose gel eletro-
phoresis
1 , 2 ,3 , 4 represent for tree peony ,grape ,purple haricot ,bitter melon.
图 3　SRAP引物 Em2 Me3扩增结果
M:DL2000 marker;1 , 2 ,3 , 4为牡丹 、葡萄 、扁豆 、苦瓜。
Fig.3　The profile of SRAP amplification using Me3 and Em3 primer combina-
tion
1 , 2 ,3 , 4 represent for tree peony ,grape ,purple haricot ,bitter melon.
行提取 ,提取上清液颜色各不相同 ,上清液黏稠程度以及与氯
仿和异戊醇混匀的难易程度也存在明显差别 , 说明各材料中
的多糖 、酚类物质以及植物色素含量不同[ 2] 。 另外 , 由于 DNA
在低浓度乙醇盐溶液中的沉淀速度远远高于多糖和色素等物
质。李晓波等[ 7] 在提取药材中的 DNA 时 , 先用 100mmol L
NaAc溶解 DNA沉淀 , 然后再用低浓度乙醇抽提 , 分离出多糖。
Cheng Y J等[ 8]先用水饱和乙醚和 1.2～ 1.5mol L NaCl溶液将
大部分多糖去除 , 再用 2 倍乙醇沉淀 DNA 可大大提高效率。
陈大明法[ 9]基因组 DNA 是分两步提取的 ,先用提取缓冲液除
去多糖及酚类物质 , 然后再用裂解缓冲液裂解细胞核 , 使 DNA
释放出来。
Fang G 等[ 10]在提取 DNA 的过程中在加入乙醇沉淀的同
时加入 1mol L NaCl去除多糖等杂质 , 取得了一定的效果。杜
黎明等[ 11]在常规CTAB法基础上 , 将抽提液的 pH 8.0 改为 pH
5.5 , DNA沉淀步骤中 ,取上清液后 ,加入 5mol L NaCl 600μl , 再
加入 400μL冷冻的异丙醇 ,沉淀 DNA。本研究借鉴前人结果做
适当改进 , 使用 1mol L NaCl溶液溶解常规方法提取的 DNA , 离
心后弃沉淀 , 利用在1mol L NaCl溶液中 , DNA易溶解而多糖等
杂质不易溶解的原理 , 使多糖等杂质一步去除 , 从紫外分光光
度计结合凝胶电泳分析检测结果说明该方法能有效地去除植
物叶片中的多糖 、多酚类等物质 , 并且该方法提取的植物基因
组 DNA的纯度和浓度均能满足进一步的分子生物学研究 , 如
PCR、酶切和 Southern 分析等。
沉淀 DNA首选的有机溶剂是乙醇。它对盐类沉淀少 , 且
痕量的乙醇易于挥发 , 一般采用 2 倍体积的乙醇沉淀 DNA。
异丙醇的优点是所需的用量少 , 速度快 ,适宜于浓度低 , 而体
积大的 DNA沉淀 , 但容易使盐类 、蔗糖等与 DNA发生共沉淀 ,
且难以挥发除去。徐娜等[12]在应用快速提取法提取越橘基因
组 DNA时 , 沉淀 DNA 时用冰冻的无水乙醇代替常规用的异丙
醇 , 取得了较好的效果。本研究两次沉淀 DNA 时先采用异丙
醇沉淀再采用预冷的无水乙醇 , 并用 70%乙醇漂洗几次。 这
样在保证 DNA 的得率的同时也提高 DNA 了的纯度。在异丙
醇沉淀时 ,采取挑取絮状沉淀的方法 , 也可减少蛋白质 、多糖
等其它杂质的影响 , 从而提高了 DNA 纯度。
本方法提供了一个通用 、简单易行 , 成本低 , 且安全的去
除植物 DNA 提取过程中多糖等杂质的方法 , 有广泛的应用前
景。
参考文献:
[ 1]黄晓丹 ,张云贵 ,应铁进.高质量植物基因组 DNA的提取[ J] .植物
生理学通讯 , 2006 , 4(2):311-314.
[ 2]马明 ,杨克强 ,郭起荣.改良 CTAB法提取林木树种基因组 DNA 的
研究[ J] .生物技术 ,2007 , 17(3):36-38.
[ 3] Sambrook J , Russell D W.Molecular Cloning:A Laboratory Manual
[M] .third ed.CSHL Press , Cold Spring Harbor , New York.2001.
[ 4]郭大龙 ,罗正荣.部分柿属植物 SRAP-PCR反应体系的优化[ J] .果
树学报 , 2006 , 23(1):138-141.
[ 5] David E R , Jeffrey D V , Amy M E.High-throughput species identifica-
tion:f rom DNA isolation to bioinformatics[ J] .Molecular Ecology Notes,
2007, 7 , 199-207.
[ 6] Galice H , James A C , Wytze T S , et al.A fast and inexpensive DNA ex-
tract ion purification protocol for brown macroalgae[ J] .Molecular Ecology
Notes, 2007 , 7:191-193.
[ 7] 李晓波 , 冯波 , 张朝晖 , 等.植物药材总 DNA 提取[ J] .中草药 ,
2002, 33(7):652-654.
[ 8] Cheng Y J , GuoW W , Yi H L , et al.An efficient protocol for genomic
DNA ext raction f rom citrus species[ J] .Plant Molecular Biology Reporter ,
2003, 21(2):177a-177g.
[ 9] 陈大明 ,张上隆 ,金勇丰.一种木本果树基因组 DNA 提取方法研究
[ J] .浙江农业大学学报, 1997 , 23(6):621-624.
[ 10] Fang G , Hammar S , Grumet R.A quick and inexpensive method for re-
moving polysaccharides from plant genomic DNA[ J] .Biofeedback , 1992, 13
(1):52-54.
[ 11] 杜黎明 ,毛伟海 ,包崇来 ,等.茄子基因组 DNA 提取及 ISSR-PCR
反应体系优化[ J] .农业生物技术学报 , 2007 ,15(4):723-724.
[ 12] 徐娜 , 夏秀英 , 徐大可 ,等.越橘基因组 DNA 的快速提取及分析
[ J] .果树学报 ,2007 , 24(5):714-717.
块根芍药产红色素内生菌 XJU-PA-6的分离鉴定
阿依努尔·阿不都热合曼 ,于 ,布热比亚·艾山 ,米克热木·牙生 ,吾甫尔·米吉提＊(新疆大学生命科学与技术学院 , 新疆 乌鲁木齐 830046)
摘要:目的:从块根芍药中分离出一株产红色素的内生菌并对其进行鉴定。方法:通过 PCR方法扩增 XJU-PA-6 的 16S rD-
NA , 并与GeneBank 中已鉴定菌的 16S rDNA序列对比 ,用 N— J 方法构建系统进化树 ,用 Bootstraping法对其评估。同时结合其形态
特征 、生理生化检测 、G+C mol%含量对 XJU-PA-6 进行鉴定。并利用紫外-可见光谱法对 XJU-PA-6 产生的红色素进行分
析。结果:XJU-PA-6 的 16S rDNA 序列与 EF195349 Serratia sp.同源性为 99% , G+C mol%含量为 57.8mo1%。红色素的最大吸
收波长为 533.8nm。结论:将菌株 XJU-PA-6鉴定为粘质沙雷氏菌。 XJU-PA-6 产生的红色素初步推测为灵菌红素。
关键词:内生菌;红色素;(G+C)mol%含量;16S rDNA;块根芍药;
332008 年 18(5)　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
中图分类号:Q939　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2008)05-0033-04
Isolation and Identification of Red Pigment Producing
Bacterium XJU-PA-6 from Paeonia anomala
Aynur·Abdurahman ,YU Pin-pin ,Burabiya·Hasan ,Mukaram·Yasin , Ghopur·Mijit＊(College of Life S cience and Technology , Xinjiang University , Urumqi 830000, China)
Abstract:Objective:A red pigment-producing bacterium from Paeonia anomala was isolated and identified.Method:16S rDNA gene sequence
was amplified by PCR.PCR products was sequenced and the DNA sequence was blasted on GeneBank.Phylogenetic tree was constructed with
neighbor-joining method and the relation of XJU-PA-6 and other Serratia sp.was evaluated by using Bootstrap , Based on the results of mor-
phological , physiological and chemotaxonomic characteristics , and G+Cmol% content , the XJU-PA-6 was identified.Result:The sequence
analysis of the 16S rDNA showed that XJU-PA-6 was closely related to EF195349 Serratia sp.,with the similarity of 99%.The G+C mol%
content of XJU-PA-6 is 57.8 mol%.Conclusion:The XJU-PA-6 was identified as Serratia marcescens.
Key words:endophytic bacterium;red pigment ;(G+C)mol%;16S rDNA;Paeonia anomala
收稿日期:2008-03-27;修回日期:2008-05-14
基金项目:国家自然科学基金项目资助(30560004)
作者简介:阿依努尔·阿不都热合曼(1976-)女 ,新疆人 , 硕士生 ,
Email:aynurjuhi@yahoo.com.cn;＊通讯作者:吾甫尔·米吉提(1958-),
男 ,教授 , 硕导 ,发表论文 30余篇 , Emai l:gmijit2001@yahoo.com.cn。
　　色素可分为天然色素和人工合成色素两类 , 其在食品和
化妆品生产中的应用非常广泛[1] 。随着医学毒理和生物学研
究的不断深入 ,发现允许使用的人工合成色素中 , 大多数种类
对人体有不同程度的伤害 ,尤其是致癌 、致畸 、致突变已引起
人们的高度重视。为此 , 天然色素已逐渐取代合成色素[ 2] 。
因动植物材料生长繁殖受季节 、气候 、产地等因素的影响 , 原
料不足 , 从中提取的色素价格昂贵 , 应用受到局限 ,而利用微
生物资源生产天然色素 , 克服以动植物为原料生产天然色素
的诸多缺点 ,并且易于工业化。因此 ,采用微生物生产天然色
素将逐渐成为天然色素来源的主流[3] 。
灵菌红素是 1929 年由 Amak 等研究 Serratia 生长时发现 ,
包括 prodigiosin、prodigiosin 25 -C 、metacycloprodigiosin(MP)des-
methoxyprodigiosin 和 uncedylprodigiosin(UP)等 , 是由一些放线
菌 、沙雷氏菌及其它细菌产生的次级代谢产物 , 具有抗细菌 、
抗真菌 、抗疟疾 、免疫抑制和抗肿瘤等活性[ 4-6] 。对灵菌红素
性质的研究国内已有多篇文献报道 , 但这些产灵菌红素的细
菌多自海水或土壤中分离 , 而对内生菌类特别是块根芍药内
生菌类灵菌红素的系统研究却未见报道。本研究首次从新疆
块根芍药(Paeonia anomala)中分离到的产红色素内生菌 XJU-
PA-6 进行了研究 , 为灵菌红素作为药物和天然色素资源的开
发利用提供理论基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　供试材料:块根芍药(Paeonia anomala), 2006 年 7 月上
旬采自新疆塔城地区塔尔巴哈台山。
1.1.2　试剂
胶回收试剂盒购于上海华舜生物工程公司;PCR试剂盒
购自宝生物工程(大连)有限公司 , 十二烷基苯磺酸钠为化学
纯 , 其余化学试剂均为分析纯。 扩增引物:L:5 -CG-
GACGGGTGAGTAATGTCT - 3 ;R:5 - CTTCTTTTGCAAC-
CCACTCC-3 ,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.1.3 仪器:PERKIN-ELMER LAMBDA 17 紫外可见分光光度
计;低速离心机 , 上海安亭科学仪器厂;旋转蒸发器 , 上海亚荣
生化仪器厂;恒温摇床(THZ-80);冷冻离心机(Heraeus , Ger-
man);梯度 PCR 仪(Biorad Mycycler);凝胶成像仪(Alphalmag-
er200 , USA);高效液相色谱仪(HP1100 , USA)。
1.1.4　培养基
LB 培养基 、PDA培养基 、MEA 培养基 、YM 培养基 、配方参
考[ 7] 。
1.2　方法
1.2.1　内生菌的分离:内生菌的分离采用碾碎法[ 8] 。
1.2.2　菌株生物学特性研究
根据常见细菌鉴定方法对分离细菌进行形态大小 、革兰
氏染色 、鞭毛染色 、细菌生长条件及生理生化特性研究[ 9] 。
1.2.3　XJU-PA-6 菌株 16S rDNA序列分析
用 CTAB法[ 10] 所提取的菌株基因组 DNA 为模板 。 PCR
条件:94℃ 5min , 94℃ 1min , 58℃ 2min , 72℃ 2min , 35 个循环 ,
72℃ 7min , 4℃终止反应。 PCR产物由大连宝生物工程有限公
司测序。用 Blastn 比较菌株 16S rDNA与 GenBank 中已登录的
序列 , 调出与菌株 16S rDNA 同源并且已经鉴定的菌种 16S rD-
NA序列 , 并通过软件 MEGA 3.1 采用 N-J 法构建系统进化
树。
1.2.4　XJU-PA-6 菌株基因组的提取和(G+C)mol%测定
用 CTAB 法提取基因组 DNA ,用高效反相液相色谱仪来测
定 XJU-PA-6 菌株基因组的(G+C)mol%含量 。高效液相色
谱仪为日本岛津 LC-6AD 高效液相色谱仪 , 岛津 SPD-lOAvp
紫外检测器 , Class-VP数据处理工作站 , KromasilC18 柱(5μm ,
250mm×4.6mm i.d), 流速 1ml min , 检测波长 260nm。移动相
为 10%甲醇 , 90% 20mmol/ L磷酸二氢钾溶液(pH 5.6)[ 11] 。
1.2.5　色素的提取
将在 MEA 固体培养基上培养 2d 的细胞用蒸馏水冲洗下
来 ,其中加 150ml乙酸乙酯 , 用分液漏斗收集有机层 , 用饱和
NaCl溶液洗脱 2 次后 ,使其烘干[12] 。
1.2.6　色素吸收光谱测定
用 PERKIN-ELMER LAMBDA 17 紫外可见分光光度计于
360nm～ 800nm 处对色素醇溶液进行光谱扫描 , 测定色素最大
吸收峰值。
2　结果与分析
2.1　内生菌分离结果
根据颜色和形态的差异 , 在培养基上共分离出 11 株内生
细菌 , 并编号为 XJU-PA-1 ～ XJU-PA-11 ,其中菌株 XJU-
PA-6 能够产生红色素。
2.2　XJU-PA-6菌株的生物学特性
该菌株大小为 0.9μm×1.3μm ,短杆状 , 两端纯圆 , 革兰氏
阴性细菌 ,无芽孢 , 有荚膜 , 无鞭毛 , 无运动。菌落呈圆形 、光
滑 、湿润 ,表面隆起呈金属光泽 , 边缘不整齐 , 生长温度 28℃～
38℃, pH 5～ 9。有轻微异味 ,菌落呈紫红色 , 色素不扩散到培
养基中。 革兰氏阴性 , 兼性好氧;XJU-PA-6 主要生理生化
特征见表 1。
2.3　16S rRNA 基因序列分析
菌株 XJU-PA-6 的 16S rRNA 基因序列全长为 1 250bp ,
此序列已在 GeneBank 中注册 , 注册号为 EU339294 , 将其与从
GenBank 等数据库中调取的与沙雷氏菌相关菌株的 16S rDNA
序列进行比较 , 所构建的系统进化树见图 3。系统进化树显
示 ,菌株 XJU-PA-6 与 EF195349 Serratia sp.构成一个分支 ,
16S rRNA 序列的同源性达到 99%。
2.4　XJU-PA-6的(G+C)mol%测定
通过高效反相液相色谱图(图 3)及碱基的毫摩尔数可以
34　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年 18(5)
测得 XJU-PA-6的(G+C)mol%含量为 57.8mo1%。
表 1　XJU-PA-6菌株主要生理生化特征
Table 1　Physiological and biochemical properties of XJU-PA-6
实验名称 XJUPA-6 S.marcescens
V-P + +
氧化酶 - -
接触酶 + +
明胶液化 + +
鸟氨酸脱羧酶 + +
精氨酸水解酶 - -
赖氨酸脱羧酶 + +
Tween 80 + +
甘露醇 + +
麦芽糖 + +
丙二酸 - -
吲哚产生 - -
葡萄糖 + +
蔗糖 + +
L-阿拉伯糖 + +
鼠李糖 - -
肌醇 + +
山梨醇 + +
淀粉酶 - -
硝酸盐还原 + +
+:阳性反应;-:阴性反应。 +:positive reaction;-:negative reaction.
图 1　菌株 XJU-PA-6以及从 GenBank等数据库中调集的相关菌种
构建的以 16S rDNA序列为基础的系统发育树
Fig.1　Neighbo-Joining tree constructed showing the phylogenetic relation-
ships among XJU-PA-6 and other related strains downloaded f rom GenBank
2.5　色素光谱特征
XJU-PA-6菌株红色素的吸收光谱:经紫外分光光度计
的扫描 ,可见 XJU-PA-6 菌株在 533.8nm 波长处具有最大吸
收峰值(图 4)。
3　讨论
粘质沙雷氏菌是灵菌红素的重要来源 , 近年来的研究表
明灵菌红素具有很强的抗肿瘤及免疫抑制活性 , 具有一定的
开发利用价值。近年来 ,陶金莉[ 13]和 Yu hong wei等[14 , 15] 在灵
菌红素产量的提高方面做了大量工作。但是 , 目前灵菌红素
的药理功效 、药理机制以及毒副作用等方面都尚未解决 ,这些
图 2　标准碱基溶液分离图谱
Fig.2　Separate map of standard bases
图 3　XJU-PA-6碱基分离图
Fig.3　Separate map of bases from XJU-PA-6
图 4　色素醇溶液的紫外吸收光谱
Fig.4　Red pigment s absorption spectra
问题都大大地限制了灵菌红素实际应用。因此 , 要使灵菌红
素得到广泛的应用 , 这些方面都有待深入研究。
实验所分离到的菌株 XJU-PA-6 的 16S rRNA 经序列分
析表明 , 该菌与沙雷氏菌属的相似性为 87%,初步鉴定为沙雷
氏菌属;进一步通过形态学 、生化特征和(G+C)mol%含量 , 将
其最终鉴定为粘质沙雷氏菌。 菌株 XJU-PA-6 产生的红色
素的紫外可见光图谱与文献中报道的灵菌红素的紫外吸收图
谱基本一致[ 16] , 易溶于甲醇和丙酮 , 不溶于水 , 根据这些特点
初步确定该色素为灵菌红素。 XJU-PA-6 的获得不仅为开
发出廉价 、安全的天然色素奠定了菌种基础 , 而且为进一步研
究灵菌红素的药理功效 、药理机制提供了实验材料。
参考文献:
[ 1] 马同锁 ,袁红楼 ,赵士豪 ,等.一株产色素土壤小单孢菌 SP-15的筛
选及其色素的提取和理化性质研究[ J] .食品工程 , 2006, 2:48-50.
[ 2]于华忠 ,李国章 ,唐克华 ,等.一种细菌红色素的基本特性研究[ J] .
现代食品科技 , 2005 , 21(1):66-68.
[ 3] 王君 ,张宝善.微生物生产天然色素的研究进展[ J] .微生物学通报 ,
2007, 34(3):580-583.
[ 4] Shieh W Y , Chen Y W , Chaw S M , et al.A red , facultatively anaerobic ,
352008 年 18(5)　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
marine bacterium isolated from sea water[ J] .International Journal of Sys-
tematic and Evolutionary Microbiology , 2003 , 53:479-484.
[ 5] Pandey R , Chander R , Sainis K B.A novel prodigiosin-like immunosup-
pressant from an alkalophilic Micrococcus sp.[ J] .Int Immunopharmacol ,
2003 , 3(2):159-167.
[ 6] 刘同军 ,杨海龙 ,唐华.灵菌红素的研究进展[ J] .食品与药品 , 2007 ,
9(8):47-50.
[ 7] 钱存柔 ,等.微生物学实验教程[ M] .北京:北京大学出版社 , 2003
-03:215.
[ 8] 张洪涛 ,徐田枚 ,艾山江 , 等.新疆有毒煅麻内生菌的分离及 AP-
PCR与 ERIC-PCR分析[ J] .中国微生态学杂志 , 2007, 19(3):25-27.
[ 9] 东秀珠 ,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[ M] .北京:科学出版社 ,
2001:94-387.
[ 10] 林加涵 ,魏文铃 , 彭宣宪.现代生物学实验(下册)[M] .北京:高等
教育出版社 , 2001:98-103.
[ 11] 邓爱华 , 王宁 ,易霞 ,等.反相高效液相色谱法测定 Bacillus claussi
的 DNA G+Cmol%[ J] .生物技术 , 2006 , 16(4):42-45.
[ 12] Bindu Ajithkumar , Vasudevan P.Ajithkumar , Ryozo Iriye , et al.Spore
-forming Serratia marcescens subsp , Sakuensis subsp.nov., isolated from a
domestic wastewater treatment tank[ J] .International Journal of Systematic
and Evolutionary Microbiology , 2003, 53:253-258.
[ 13] TAO J L Wang X D , Shen Y L , et al.Strategy for the improvement of
prodigiosin production by a serratia marcescens mutant through fed-batch fer-
mentation[ J] .World J Microbiol Biotechnol , 2005 , 21:969-972.
[ 14] Wei Y H , Yu W J , Chen W C .Enhanced undecylprodigiosin production
from Serratia marcescens SS-1 by medium formulation and amino-acid sup-
plementation[ J] .Journal of Bioscience and Bioengineering, 2005 , 100(4):
466-471.
[ 15] Wei Y H , Chen W C.Enhanced production of prodigiosin-like pigment
from Serratia marcescens SMR by medium improvement and oil-supplementa-
tion strategies[ J] .Journal of Bioscience and Bioengineering, 2005 , 99(6):
616-622.
[ 16] Lewis SM , Corpe WA.Prodigiosin -producing bacteria from marine
sources[ J] .Applied Micro , 1963 , 12(1):13-17.
一株产纤维素酶细菌的筛选鉴定
胡爽1 , 2 ,王炜2 ,3＊ ,詹发强2 ,杨红兰1 , 2 ,山其木格1 , 2(1.石河子大学农业生物技术重点实验室 ,新疆 石河子 832003;2.新疆农科院微生物研究所 , 新疆 乌鲁木齐 830091;
3.新疆特殊环境微生物工程技术研究中心 , 新疆 乌鲁木齐 830091)
摘要:目的:从青贮饲料中分离筛选产纤维素酶的细菌。方法:用刚果红染色法和羧甲基纤维素酶活力测定法对分离所得的
细菌进行筛选。结果:筛选到 1 株产纤维素酶能力较强的菌株 ,编号为ws-6。对该菌进行形态观察 、生理生化鉴定和 16S rDNA
序列测定 ,鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。结论:该菌最适生长 pH 5.0 ～ 7.0 , 最适生长温度 35℃, 产 CMC 酶活力达
2.55U mL。
关键词:产纤维素酶细菌;筛选;鉴定
中图分类号:Q93-331　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2008)05-0036-03
Studies on Screening of Bacteria Producing Cellulase
HU Shuang
1 , 2 ,WANG Wei2 , 3＊ ,ZHAN Fa-qiang2 , YANG Hong-lan1 , 2 ,SHANQi Mu-ge1 , 2
(1.Key Laboratory of Agricultural Technology , Shihezi University ,Shihezi 832003 ,China;2.Institute of M icrobiology , Xinjiang Academy of Agricultural
Science , Urumqi 830091 ,China;3.Xinjiang Engineering Research center for Microbiology of Extreme Habitat , Urumqi 830091 , China)
Abstract:Objective:To isolate a Cellulase producing bacteria from silage.Method:Through Congo red method and CMCase activity determining
method , a strain with powerful ability of cellulase was isolated and determined.Result:A strain with powerful ability of cellulase , which Number
is ws-6 , was obtained.Through the observation of the morphology , the physiological and biochemical identification and the 16 S rDNA sequenc-
ing analysis , the strain was identified as Bacillus licheniformis.The optimum pH for the bacteria is 5.0 ～ 7.0 , the optimal growth temperature is
35℃, its CMCase activity is up to 2.55U mL.Conclusion:The further study over the strain shows that it can be applied to silage preparation and
improve the nutritional value of silage.
Key words:cellulase-producing bacteria;screening;identification
收稿日期:2008-04-25;修回日期:2008-05-12
基金项目:国家“ 973”计划(“秸秆资源生态高值化关键过程的基础研
究” , 2004CB719704);农业微生物菌种资源整理 、整合及共享试点项目
(2005DKA21201-20);国家农业科技成果转化资金项目(“青贮饲料
微生物添加剂技术成果转化” , 2006GB2G400336)资助
作者简介:胡爽(1983-),女 ,在读硕士 ,研究方向:微生物发酵工程 ,
Email:hsf fe@163.com;＊通讯作者:王炜(1965-), 男, 研究员 , 研究方
向:微生物工程 , Email:whangwei0718@126.com。
　　纤维素是自然界中所有植物的主要组分 , 由于其存在很
多的高能氢键难以水解 ,因此很难被人类或动物直接利用[ 1] 。
纤维素酶是能够降解纤维素生成葡萄糖的一类酶的总称 , 是
一个由多种水解酶组成的复杂酶系[2] 。
纤维素酶已被应用到饲料加工业中 , 用于纤维素物质的
预处理 , 如谷物的去壳 , 青贮饲料的处理等 , 从而提高动物的
消化能力[ 1] 。但由于其加工 、纯化工序繁杂 , 成本较高 , 因而
影响了它在饲料工业中的广泛应用。
目前对产纤维素酶菌株筛选方面的研究较多 , 但多为霉
菌 ,由于霉菌为好氧型微生物 , 而饲料发酵大部分是在厌氧环
境中进行的 ,不利于霉菌的应用[ 3] 。因此对兼性厌氧型产纤
维素酶的细菌进行研究是很重要的[ 4] 。本文旨在报道一株产
纤维素酶细菌的筛选 、鉴定 , 以期能应用到青贮饲料的制作
中。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
新疆乌苏窖藏两年以上且未加任何添加剂的青贮饲料 ,
材料柔软 、松散 、较完整 , 未发现有霉变 , 呈淡黄色 , pH 3.8 左
右。
1.1.2　试剂
DNA Marker、CTAB 购自大连宝生物工程有限公司 , 琼脂糖
(Biowest Agarose)购自上海生物技术有限公司;SDS 、EB 购自
Sigma公司;溶菌酶(Lysozyme)购自上海生物工程有限公司;琼
脂糖(Biowest Agarose)购自北京三博生物工程有限公司;其它
化学试剂均为分析纯。
1.1.3　仪器
SPX-250 型生化培养箱(上海跃进医疗器械厂);SW-CJ
-2FD型双人单面净化工作台(苏州净化),MLS-3020 高压蒸
汽灭菌锅(新德医疗器械有限公司);DK-8D电热恒温水槽
(上海精宏实验设备有限公司);pHS-3C 酸度计(上海雷磁仪
器厂);TV lens C-0.45X显微成像仪(日本 Nikon);E360K 离
心机(德国 eppendorf);, AEL-160 岛津电子天平(日本岛津自
动化设备有限公司);Mastercy cler ep PCR仪(德国 Eppendorf)。
1.1.4　培养基
(1)筛选培养基
蛋白胨 10g , 氯化钠 10g , 酵母粉 5g , 羧甲基纤维素钠 10g ,
琼脂 15g , 水1 000ml ,调 pH 至 6.0 , 121℃高温灭菌 25min。
36　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年 18(5)