全 文 ：河南农业科学，2015，44(3) :97-99
Journal of Henan Agricultural Sciences doi:10． 15933 / j． cnki． 1004-3268． 2015． 03． 022
收稿日期:2014 － 09 － 03
基金项目:山东省高等学校科技计划项目(J10LC74，J13LF53) ;潍坊科技学院博士基金项目(W13K010) ;山东半岛蓝色经济工
程研究院科研计划项目(Sdlgy2013y013)
作者简介:夏海波(1983 －) ，男，山东潍坊人，讲师，硕士，主要从事植物病害生物防治研究。E － mail:xhb0536@ 163． com
* 通讯作者:潘好芹(1982 －) ，女，山东潍坊人，副教授，博士，主要从事植物病害及真菌资源利用研究。
E － mail:never423@ 163． com
虎尾兰叶斑病病原鉴定及其对多菌灵的敏感性测定
夏海波，潘好芹* ，李艳青
(潍坊科技学院，山东 寿光 262700)
摘要:为明确虎尾兰叶斑病致病病原，采集典型病叶进行病原菌的分离、纯化，利用形态学与分子
生物学方法进行鉴定，并测定了病原菌对多菌灵的敏感性。结果表明，引起虎尾兰叶斑病的病原菌
为拟轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides (Sacc．)Nirenberg) ，属于半知菌亚门丝孢纲镰刀菌属。多
菌灵对该菌的有效中质量浓度(EC50)为 3． 11 μg /mL，说明多菌灵对虎尾兰叶斑病菌有较好的抑制
效果。
关键词:虎尾兰;叶斑病;病原;rDNA － ITS;多菌灵;敏感性
中图分类号:S436． 8 文献标志码:A 文章编号:1004 － 3268(2015)03 － 0097 － 03
Pathogen Identification of Leaf Spot on Sansevieria trifasciata and
Sensitivity Determination of the Pathogen to Carbendaizm
XIA Haibo，PAN Haoqin* ，LI Yanqing
(Weifang University of Science and Technology，Shouguang 262700，China)
Abstract:The pathogen of leaf spot on Sansevieria trifasciata was isolated from the typical diseased leaves
and identified based on morphology and molecular methods． The sensitivity to carbendaizm of the pathogen
was also detected． The results showed that the pathogen was Fusarium verticillioides (Sacc．)Nirenberg，
which belonged to genus Fusarium class Hyphomycetes of Deuteromycotina． The EC50 of carbendaizm to
the fungus was 3． 11 μg /mL，showing that carbendaizm had a better control effect on leaf spot of Sansevie-
ria trifasciata．
Key words:Sansevieria trifasciata;leaf spot;pathogen;rDNA-ITS;carbendaizm;sensitivity
虎尾兰(Sansevieria trifasciata)又名千岁兰、虎
皮兰，为百合科虎尾兰属多年生草本观叶植物［1］，
常见栽培品种有金边虎尾兰、短叶虎尾兰、金边短叶
虎尾兰、银脉短叶虎尾兰等［2］。其外形坚挺直立，
叶色靓丽，且栽培方式多样，易于养护，具有较高的
观赏和经济价值。同时，虎尾兰对甲醛、苯等具有较
好的吸收、净化效果，被称为“天然清道夫”［1］，成为
家庭居室、商场酒店、办公场所等室内盆栽观赏植物
的新宠。
目前，对虎尾兰的研究主要集中在虎尾兰的栽
培管理［2-3］、繁殖技术［4-6］、对甲醛等有害物质的吸
收［7-9］及虎尾兰病虫害防治方面［10-11］，对虎尾兰病
害病原鉴定及病原抗药性研究较少。本试验针对虎
尾兰叶斑病采集典型样本，分离纯化病原菌，借助形
态学和分子生物学方法进行病原鉴定，明确其分类
地位，同时测定其对常用药剂多菌灵的敏感性水平，
以期为该病害防治提供指导。
1 材料和方法
1． 1 供试材料
供试菌株:从花卉市场、家庭种植的虎尾兰采集
叶斑病典型症状叶片，带回实验室进行病原菌的分
河南农业科学 第 44 卷
离、纯化。分离获得菌株保存于潍坊科技学院微生
物实验室。
供试药剂:50%多菌灵可湿性粉剂(江苏蓝丰
生物化工股份有限公司)。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 病原菌的分离与纯化 虎尾兰叶斑病病原
菌分离采用组织分离法。选取病叶病健交界处切成
0． 5 cm 左右的小块，先在 75%乙醇中表面消毒数
秒，后用 0． 1%升汞溶液消毒 30 s，将消毒后的病组
织在灭菌水中清洗 3 次，接入 PDA 平板中，每个培
养皿接入 4 ～ 5 个小块。置于 25 ℃恒温培养箱中培
养 3 d，待病原菌长出后，挑取菌落边缘菌丝，移入新
的 PDA平板，进行病原菌的纯化。
1． 2． 2 病原菌形态及培养性状观察 将纯化后的
病原菌接种到 PDA 平板上，25 ℃培养 3 d，观察菌
落形态、颜色等。挑取少量菌丝制作玻片，观察病原
菌的菌丝、分生孢子及分生孢子梗形态特点，参考
《常见镰刀菌鉴定指南》［12］进行病原菌鉴定。
1． 2． 3 病原菌 rDNA － ITS 序列分析 采用 CTAB
法［13］提取病原菌基因组 DNA，用真菌通用引物
ITS1(5 － TCCGTAGGTGAACCTGCGG － 3)和 ITS4
(5 － TCCTCCGCTTATTGATATGC － 3)进行 rDNA －
ITS扩增［14］。ITS 扩增选用 50 μL 反应体系:5 μL
10 × PCＲ Buffer，4 μL dNTP，引物 ITS1 和 ITS4(25
μmol /L)各 1 μL，2 μL DNA模板，0． 5 μL Taq 酶(5
U /L) ，36． 5 μL ddH2O。反应条件:94 ℃ 预变性
2 min;94 ℃变性 1 min，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸
1 min，30 个循环;72 ℃延伸 10 min。扩增产物用
1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
PCＲ产物经 Easy Quick Gel Extraction Kit(北京
全式金生物技术有限公司)回收后，克隆到 pEASY －
T3 载体并转化感受态大肠杆菌 DH5α 培养过夜。
挑取单菌落于 LB培养液中培养。以培养的菌液为
模板，进行 PCＲ检测。将含有目的片段的克隆送博
尚生物技术公司进行测序。
将所测菌株的 rDNA － ITS 序列在 GenBank 数
据库中进行同源性比较。
1． 2． 4 病原菌对多菌灵的敏感性测定 将灭菌的
PDA培养基溶化，冷却至 40 ℃ 左右时加入多菌灵
药剂母液，配制成多菌灵终质量浓度分别为 0． 1、1、
10、50 μg /mL的培养基，倒平板备用。
将病原菌接种到 PDA 平板上，25 ℃培养 3 d，
用打孔器打取直径 5 mm 的菌饼，分别接种到上述
含药 PDA平板中央，以不含药的 PDA 平板为对照
(CK) ，于 25 ℃恒温培养箱中培养 3 d，十字交叉法
测量各菌落直径，计算生长抑制率。每个处理重复
5 次。
生长抑制率 = (对照菌落直径 － 处理菌落直
径)/(对照菌落直径 －菌饼直径)× 100%。
1． 2． 5 数据分析 采用 DPS v7． 05 进行数据处理，
获得毒力回归方程和有效中质量浓度(EC50)。
2 结果与分析
2． 1 虎尾兰叶斑病症状
如图 1 所示，叶片发病初期形成浅褐色斑点，后
逐渐扩大形成 5 ～ 10 mm 褐色圆形或长圆形病斑，
边缘红褐色，表面凹陷;病斑散生，有时病斑连片，导
致叶片枯死。近茎基部病斑扩展后可引起叶片基部
腐烂，严重时整株折倒。
图 1 虎尾兰叶斑病病害症状
2． 2 病原菌培养性状
该病原菌在 PDA平板上于 25 ℃恒温培养箱中
培养 3 d后，菌落圆形，表面粉状，表生大量气生菌
丝。菌落中部浅红色，边缘白色(图 2)。菌丝无色，
具隔膜，分枝。产生小型分生孢子的锥形分生孢子
梗无色，(20 ～ 28)μm ×(2 ～ 3)μm;产生大型分生
孢子的分生孢子梗生于菌丝侧枝，端部具 2 ～ 3 个瓶
状小梗，(20 ～ 23)μm ×(3． 5 ～ 4)μm。分生孢子 2
种类型:一种小型孢子，无色，链状，棍棒形或卵形，
多无隔膜，(6 ～ 12)μm ×(1． 5 ～ 2)μm;一种大型孢
子，无色，单生，镰刀形，具 3 ～ 7 个隔膜，(30 ～ 55)
μm ×(2． 5 ～ 3． 5)μm。
A．菌落特征;B．分生孢子及分生孢子梗
图 2 病原菌形态特征
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第 3 期 夏海波等:虎尾兰叶斑病病原鉴定及其对多菌灵的敏感性测定
2． 3 病原菌 rDNA － ITS序列测定与分析
用通用引物 ITS1 / ITS4 对病原菌基因组 DNA
进行 PCＲ扩增，得到了大小介于 500 ～ 750 bp 的单
一条带(图 3)。经序列测定，扩增产物大小为 546
bp。将获得的序列在 NCBI 上进行 BLAST 分析，其
与拟轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides (Sacc．)Ni-
renberg)的一致性为 100%。根据菌株的形态特征，
结合序列分析结果，鉴定该病原菌为拟轮枝镰刀菌，
属于半知菌亚门丝孢纲镰刀菌属。
M． DL2000 plus Marker;1．病原菌扩增产物;CK．阴性对照
图 3 病原菌rDNA － ITS扩增产物
2． 4 病原菌对多菌灵的敏感性
采用菌丝生长速率法测定虎尾兰叶斑病菌对多
菌灵的敏感性。由表 1 可见，随着 PDA 培养基中所
含多菌灵药剂质量浓度的增加，病原菌菌落直径明
显减小，生长抑制率逐渐升高。当多菌灵质量浓度
为 10 μg /mL时，菌落直径仅 2． 58 cm，生长抑制率
达到 57． 11%。根据病原菌生长抑制率获得多菌灵
对病原菌的毒力回归方程，计算多菌灵对虎尾兰叶
斑病菌的 EC50为 3． 11 μg /mL，说明多菌灵对虎尾兰
叶斑病菌有较好的抑制效果。
表 1 虎尾兰叶斑病菌对多菌灵的敏感性
项目
药剂质量浓度 /(μg /mL)
0(CK) 0． 1 1 10 50
菌落平均直径 / cm 5． 30 4． 18 3． 28 2． 58 1． 64
生长抑制率 /% 24． 12 42． 68 57． 11 76． 49
毒力回归方程 y = 4． 771 7 + 0． 463 8x (r = 0． 997 4)
3 结论与讨论
虎尾兰叶斑病是虎尾兰繁育、栽培过程中经常
发生的一种病害，影响其观赏价值和经济价值。关
于虎尾兰叶斑病病原鉴定的报道较少，现有报道仅
从形态学方面进行了鉴定［11］。真核菌类的 rDNA －
ITS具有高度保守性，并易于扩增，作为真菌的首选
DNA条形码已被广泛用于真菌的物种鉴定［15］。本
研究利用形态特征与分子生物学方法相结合，对虎
尾兰叶斑病病原进行鉴定，确定其为拟轮枝镰刀菌
(Fusarium verticillioides)。
在病原鉴定的基础上，进行了多菌灵对虎尾兰
叶斑病菌的室内毒力测定，明确多菌灵对叶斑病的
防治效果较好，EC50为 3． 11 μg /mL，为虎尾兰栽培
过程中叶斑病的防治提供了指导。本试验仅测定了
病原菌对多菌灵的敏感性，尚需进一步测定其对甲
基托布津等其他常用杀菌剂的敏感性，以期指导虎
尾兰生产过程中杀菌剂的合理使用，避免或延缓病
原菌抗药性的产生。
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