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·中药制剂·
响应面分析法优化秀丽莓总糖提取工艺*
刁玉林 刘斌#
刁玉林，男，在读博士生
# 通信作者:刘斌，男，博士，教授，博士生导师，研究方向:中药(复方)有效成分(组分)发现与新药创制，E-mail:liubinyn67@ 163． com
* 国家自然科学基金资助项目(No． 81260684) ，北京中医药大学自主选题(No． 2013-jybzz-xs-113)
(北京中医药大学中药学院 北京 100102)
摘要:目的 利用响应面分析法对秀丽莓总糖提取工艺进行优化。方法 以秀丽莓水提液总糖含
量为评价指标，选取提取温度(X1)、提取时间(X2)、料液比(X3)、药材粉碎粒径(X4)及提取次数
(X5)为单因素进行考察，最终确定提取温度、提取时间及料液比为主要影响因素。在该试验基础
上选取 3 个因素的 3 个水平，根据中心组合(Box-Benhnken)试验设计原理，采用响应面分析法，以
水提液的总糖含量为响应值(Yyielded)作响应面及等高线，计算获得可反应 3 因素与总糖含量之间关
系的多元二次线性回归方程，优化设计最佳提取工艺。结果 根据计算拟合所得方程确定的最佳
提取工艺条件为:药材粉碎过 40 目筛，浸提温度 65 ℃，提取时间 2． 5 h，按料液比 1∶ 21 加水提取 1
次。按照该条件提取所得秀丽莓水提液总糖含量可达 13． 39%，与理论预测值 13． 77% 基本一致。
结论 该最佳提取条件可靠、稳定、提取率高，基本能满足工业生产的需求。
关键词:秀丽莓;糖类成分;响应面;提取工艺;优化
中图分类号:Ｒ283 doi:10． 3969 / j． issn． 1006-2157． 2014． 10． 012
Optimazation of saccharides extraction from Ｒubus amabilis by response
surface methodology*
DIAO Yu-lin，LIU Bin#
(School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102)
Abstract:Objective To approach an optimal extraction procedure of saccharides from Ｒubus amabilis by
using response surface methodoloy． Methods With the saccharides content of water extract as an
evaluation index，single-factor experiment was conducted on 5 factors respectively，including extraction
temperature (X1) ，extraction time (X2) ，solvent ratio (X3) ，crush size (X4)and extraction times
(X5)． 3 factors(X1，X2，X3)were determined to be crucial． According to the central composite
experimental design principles(Box-Benhnken) ，three different levels of each of 3 factors selected was
adopted by response surface methodology(saccharides content was chosen as response value，while
response surface and contour curves were plotted) ，in search for multiple quadratic linear regressions
between the crucial 3 factors and saccharides content． Ｒesults The optimum extraction conditions of the
saccharides from Ｒubus amabilis were calculated from the formula above as the following:powdered herbs
filtrated through 40 meshes，extraction temperature was set at 65 °C，extraction time was 2． 5 hours with
21 times of water (w /v)and extracted once． Under these conditions，the content of saccharides from
Ｒubus amabilis was up to 13． 39%，which was in accordance with the theoretical prediction 13． 77% ．
Conclusion The extraction condition optimized was reliable，stable and effective，which can meet with
the requirement of industrial production．
107
第 37 卷第 10 期 2014 年 10 月
Vol． 37 No． 10 Oct． 2014
北京中医药大学学报
Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine
Key words:Ｒubus amabilis;saccharides;extraction;response surface methodology;optimization
秀丽莓(Ｒubus amabilis Focke)为悬钩子属药用
植物之一，主产于湖北、河南、山西、陕西、甘肃、青
海、四川等省，其干燥茎，味苦、甘、微辛，消化后味
甘、酸，效柔性温，为常用藏药，属药食同源植物。藏
区常将其叶做茶饮，果实食用，具有清热解毒、提高
机体免疫的作用 ［1］，临床常用于预防和治疗流感、
肺热咳嗽、气喘、胃溃疡等。本课题前期研究发现该
植物富含无机盐、氨基酸、脂肪酸及糖等营养成分
［2 － 4］，提示该植物的保健功效具有广阔的开发前景，
但目前未见该植物糖类成分研究的报道。因此，深
入研究秀丽莓糖类成分并研究活性成分的药效、机
制以及建立相应质量标准，首先需要对其总糖的提
取工艺进行研究和评价，从而为大量制备活性糖类
成分、建立相应质量标准奠定基础。本文开展该植
物中响应面法 ［5 － 6］优化总糖成分提取工艺的研究，
旨在获得糖含量最高的水提液，为秀丽莓糖类成分
的开发提供一定的试验支持。
1 材料与仪器
秀丽莓药材采自青海互助北山，经青海省药品
检验所藏药室主任罗桂法副主任药师和北京中医药
大学刘春生教授鉴定为蔷薇科悬钩子属秀丽莓(Ｒ．
amabilis Focke)的干燥茎。浓硫酸及苯酚均为分析
纯;葡萄糖标准品购于 Sigma公司。
UV-2000 型分光光度计(上海龙尼柯仪器有限
公司) ;恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司) ;
Adventurer分析天平(美国 Ohaus Corp．) ;旋转蒸发
仪(上海亚荣生化仪器厂)。
2 方法与结果
2． 1 标准曲线的制备
标准葡萄糖样品于 60 ℃真空干燥 2 h，精确称
取 5 mg 配制成 50 mL 标准葡萄糖溶液，分别吸取
0． 2、0． 4、0． 6、1． 0、1． 2、1． 4、1． 6、1． 8 mL，各以水定
容至 2 mL，各加入 6%苯酚水溶液 1 mL与浓硫酸 5
mL，静置 10 min摇匀，室温放置 20 min后于 490 nm
下测定吸光度(A)。取 2 mL 水以相同操作反应后
溶液作为参比，横坐标为糖含量(W/μg) ，纵坐标为
A值，绘制标准曲线 ［7］。计算得回归方程为:A =
0． 006 78 W + 0． 015 49，r = 0． 999 5(n = 8) ，结果表
明糖含量在 20． 43 ～ 186． 2 μg 范围内线性关系
良好。
2． 2 供试溶液制备
精确称取 5 g 经粉碎过筛后的干燥药材粉末，
按设计比例加入去离子水，称重，在设计温度下提
取，提取结束后静置，放冷，再称定重量，用水补足减
失的质量，以四层纱布过滤，得供试溶液，备用。
2． 3 样品含量测定
样品 A1 测定:将供试溶液稀释 100 倍后，按
“2. 1 标准曲线的制备”项下操作进行测定。样品
A0 测定:将供试溶液稀释 100 倍后，加入 1 mL水与
浓硫酸 5 mL，测定。计算有效吸光度值 Aeff = A1 －
A0，将 Aeff代入回归方程计算得糖含量，并最终计算
得水提液的总糖含量。
2． 4 单因素试验对水提液总糖含量的影响
2． 4． 1 提取温度(X1)考察 取 5 份经粉碎过 40
目筛的秀丽莓粉末，按料液比 1∶ 20 加入去离子水，
分别于 20、40、60、80、100 ℃下提取 1 次，时间 2 h，
按“2． 2 供试溶液制备”与“2． 3 样品含量测定”项下
操作并计算糖含量。结果表明:随着温度的升高，水
提液的糖含量逐渐升高，在 60 ℃时达最高值，之后
随提取温度的增加，该值无显著增加。观察水提液
性状发现，水提液色泽随温度升高而加深，且以较低
温度提取所得水提液较难过滤，同时，温度可能对糖
的结构与活性有较大影响，综合考虑后选取 55 ～ 65
℃为温度考察范围。
2 ． 4 ． 2 提取时间(X2)考察 取 5 份经粉碎过
40 目筛的药材粉末，按料液比为 1 ∶ 20 加入去离
子水，于 60 ℃下提取 1 次，时间分别为 0 ． 5、1 ． 0、
1 ． 5、2 ． 0、2 ． 5 h，按“2 ． 2 供试溶液制备”与“2 ． 3
样品含量测定”项下操作并计算糖含量。结果表
明:提取时间的延长并没有使水提液的糖含量持
续升高，而是在 2 h 达最高值，延长提取时间糖含
量有所降低，说明糖类成分已基本提取完全，延
长时间反而会促进药材对已溶出糖的吸附。因
此，为了节省能源并缩短生产周期，选取 1 ． 5 ～
2 ． 5 h 为提取时间考察范围。
2． 4． 3 料液比(X3)考察 取 6 份经粉碎过 40 目
筛的药材粉末，按料液比 1 ∶ 16、1 ∶ 18、1 ∶ 20、1 ∶ 22、
1∶ 24、1 ∶ 26 分别加入去离子水，于 60 ℃下提取 1
次，时间为 2 h，按“2． 2 供试溶液制备”与“2． 3 样品
含量测定”项下操作并计算糖含量。结果表明:溶
剂的增多会促进糖类成分的溶出，随着料液比的升
高，糖含量逐渐升高，至 1∶ 20 时溶出完全，随后溶剂
的增多使溶液稀释，提取液糖含量下降。
207 北京中医药大学学报 第 37 卷
2 ． 4 ． 4 粉碎粒径(X4)考察 取 5 份经粉碎分别
过 20、40、60、80、100 目筛的药材粉末，按料液比
为1 ∶ 20加入去离子水，于 60 ℃下提取 1 次，时间
为 2 h，按“2 ． 2 供试溶液制备”与“2 ． 3 样品含量
测定”项下操作并计算糖含量。结果表明:粒径
的减小可促进糖类成分溶出，使水提液中糖含量
逐渐增加，达 40 目后糖含量不随粉碎粒径减小
而显著增加，表明药材中糖类成分已溶解完全，
故选取 40 目为宜。
2． 4． 5 提取次数(X5)考察 取 3 份经粉碎过 40
目筛的药材粉末，按料液比为 1∶ 20 加入去离子水，
于 60 ℃下提取 1 次，时间为 2 h，分别提取 1、2、
3 次，按“2． 2 供试溶液制备”与“2． 3 样品含量测
定”项下操作并计算糖含量。结果表明:3 次提取后
所得水提液中总糖含量分别为 13． 031%、14. 008%
及 14． 085%，即第 2、3 次提取可使水提液中的糖含
量分别仅增加 0． 977%及 0． 077%，综合考虑生产成
本后认为提取一次为宜。
2． 5 响应面分析法优化工艺
根据 Box Benhnken 的中心组合试验设计原
理，综合单因素试验的基础上，选择提取温度、提
取时间、料液比 3 个影响因素，确定药材粉末过
40 目筛，且提取一次的条件，以秀丽莓水提液的
糖含量为考察指标，进行响应面试验以确定最佳
提取工艺，并进行最优条件下的验证试验。本实
验以响应面分析软件 Design-Expert 8 ． 056 设计试
验，因素水平见表 1。响应面分析方案及试验结
果见表 2。
表 1 响应面试验因素水平
Table 1 Levels and factors adopted in response surface
methodology (ＲSM)experiment
因素 Factors
水平 Level
－ 1 0 1
X1提取温度 Extraction Temperature (℃) 55 60 65
X2提取时间 Extraction Time (h) 1． 5 2． 0 2． 5
X3料液比 Solvent Ｒatio (g /mL) 1∶ 18 1∶ 20 1∶ 22
表 2 响应面分析试验设计方案及试验结果
Table 2 Design and results of response surface methodology experiment
标准
偏差
Std
试验编号
Experimental
Number
因素 1
Factor 1 (X1)
水平
Level
温度
Temperature (℃)
因素 2
Factor 2 (X2)
水平
Level
时间
Time (h)
因素 3
Factor 3 (X3)
水平
Level
料液比
Solvent ratio (g /mL)
总糖含量
Saccharides
Content(%)
14 1 0 60 0 2． 0 0 20 11． 94
6 2 1 65 0 2． 0 － 1 18 11． 46
2 3 1 65 － 1 1． 5 0 20 11． 41
12 4 0 60 1 2． 5 1 22 12． 48
3 5 － 1 55 1 2． 5 0 20 10． 75
15 6 0 60 0 2． 0 0 20 11． 89
13 7 0 60 0 2． 0 0 20 12． 18
5 8 － 1 55 0 2． 0 － 1 18 8． 88
10 9 0 60 1 2． 5 － 1 18 11． 05
1 10 － 1 55 － 1 1． 5 0 20 9． 78
17 11 0 60 0 2． 0 0 20 12． 39
4 12 1 65 1 2． 5 0 20 13． 32
9 13 0 60 － 1 1． 5 － 1 18 9． 13
11 14 0 60 － 1 1． 5 1 22 10． 69
7 15 － 1 55 0 2． 0 1 22 10． 22
8 16 1 65 0 2． 0 1 22 13． 08
16 17 0 60 0 2． 0 0 20 12． 16
对提取温度、料液比、提取时间作如下变换 X1
= (T – 60 )/ 5，X2 = (t – 2． 0 )/ 0． 5，X3 = (
z – 20 )/ 2，以 3 次试验所得糖含量的平均值为响
应值(Yyielded) ，在试验设计与试验结果(表 2)中，1、
6、7、11 为中心试验，用来估计试验误差，其余组为
析因试验。采用 Design-Expert 8． 056 软件处理所得
307第 10 期 刁玉林等 响应面分析法优化秀丽莓总糖提取工艺
响应面分析结果见图 1 ～图 3(彩图见插页 4)。对
响应值与各因素进行回归拟合，得回归方程:
Yyielded = － 136． 934 95 + 1． 631 99 X1 + 3． 521 90
X2 + 8． 395 94 X3 + 0． 095 X1X2 + 7． 125 × 10
－3 X1 X3
－ 0． 030 5 X2 X3 － 0． 014 361 X1
2 － 1． 741 1 X2
2 －
0． 209 76 X3
2。回归方程中各变量对指标(响应值)
影响的显著性，由 F检验来判定，概率 P(F ＞ Fα)
的值越小，则相应变量的显著程度越高。回归模型
系数的检验结果见表 3。
表 3 回归模型系数的检验结果
Table 3 Test of coefficient of quadratic regression model
来源
Source
平方和
Sum of squares
自由度
df
均方
Mean square F P(F ＞ Fα)
模型 Model 26． 46 9 2． 94 46． 42 ＜ 0． 000 1＊＊＊
X1(温度 Temperature) 11． 63 1 11． 63 183． 65 ＜ 0． 000 1＊＊＊
X2(时间 Time) 5． 43 1 5． 43 85． 70 ＜ 0． 000 1＊＊＊
X3(料液比 Solvent ratio) 4． 43 1 4． 43 69． 98 ＜ 0． 000 1＊＊＊
X1 X2 0． 23 1 0． 23 3． 56 0． 101 3
X1 X3 0． 020 1 0． 020 0． 32 0． 589 2
X2 X3 3． 721 E － 003 1 3． 721 E － 003 0． 059 0． 815 6
X1
2 0． 54 1 0． 54 8． 58 0． 022 2*
X2
2 0． 80 1 0． 80 12． 61 0． 009 4＊＊
X3
2 2． 97 1 2． 97 46． 81 0． 000 2＊＊＊
残差 Ｒesidual 0． 44 7 0． 063
失拟性 Lack of Fit 0． 28 3 0． 093 2． 27 0． 222 3
纯误差 Pure Error 0． 16 4 0． 041
Cor Total 26． 91 16
注:* P ＜ 0． 05 ＊＊P ＜ 0． 01 ＊＊＊P ＜ 0． 001。
Note:* P ＜ 0． 01 ＊＊P ＜ 0． 01 ＊＊＊P ＜ 0． 01．
由表 3 可见，各因素中一次项，二次项都是高度
显著或显著的，因此各具体试验因子对响应值的影
响不是简单的线性关系。经分析计算后得标准差值
为 0． 25，均值为 11. 34，相关系数 Ｒ2 为 0． 983 5，
Ｒadj
2 值为 0． 962 3，C． V． %值为 2． 22，说明响应值
(总糖含量)的变化有 98． 35%来源于所选变量，即
提取温度、提取时间和料液比。因此，回归方程可一
定程度上描述各因素与响应值之间的真实关系，可
参考该回归方程确定最佳提取工艺条件。
根据以上数据分析确定最佳条件为提取温度
65 ℃，以料液比 1 ∶ 20． 93(实际试验中料液比为
1∶ 21)加水提取 1 次，时间为 2． 5 h，以此条件可提取
获得最高糖含量的水提液，预测含量为 13． 78%。
2． 6 最佳工艺验证
为了验证最佳提取工艺，在该条件下提取 3 批
秀丽莓过 40 目筛的粉末，分别提取 1 次，测定水提
液中总糖含量，结果表明:3 批药材水提液的总糖含
量分别为 13． 17%、13． 47% 及 13． 51% (ＲSD =
1. 38%) ，平均含量为 13. 39%，与预测总糖含量值
13． 78%的差值为 0． 38%(相对偏差 2． 78%) ，表明
该提取条件可靠、稳定、提取率高，基本能满足工业
生产的需求。
3 讨论
单因素考察结果表明，秀丽莓水提液的总糖含
量与 5 个考察因素中的提取温度(X1)、提取时间
(X2)及料液比(X3)有很大相关性，为主要影响因
素。而药材粉碎粒径(X4)考察项下，水提液总糖含
量在经 40 目筛过滤后即可达最高值，且随药材粉碎
粒径的减小无显著增加;在提取次数(X5)考察项
下，提取次数的增加不会引起含量的显著增加，提取
1 次即可。因此，综合分析后确定需对提取温度、提
取时间及料液比 3 个主要影响因素进行考察。
根据 Box Benhnken的中心组合试验设计原理，
综合单因素试验的基础上，选择提取温度(X1)、提
取时间(X2)、料液比(X3)3 个因素的 3 个水平，采
用响应面分析法，以水提液的总糖含量为响应值
(Yyielded)作响应面及等高线，计算获得可反应 3 因素
(下转第 711 页)
407 北京中医药大学学报 第 37 卷
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檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
)
(上接第 704 页)
与总糖含量之间关系的多元二次线性回归方程为:
Yyielded = － 136． 934 95 + 1． 631 99 X1 + 3． 521 90 X2
+ 8． 395 94 X3 + 0． 095 X1X2 + 7． 125 × 10
－3 X1 X3 －
0． 030 5 X2 X3 － 0． 014 361 X1
2 － 1． 741 1 X2
2 －
0． 209 76 X3
2(Ｒ2 = 0． 983 5，Ｒadj
2 = 0． 962 3，C． V． %
=2． 22) ，优化设计获得最佳提取工艺为:提取温度
65 ℃，以料液比 1 ∶ 20． 93(实际试验中料液比为
1∶ 21)加水提取 1 次，时间为 2． 5 h，以此条件提取所
得水提液的糖含量为 13． 39%，与预测值 13． 78%基
本一致。表明该条件准确、稳定，重现性好。
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大学出版社，1999:6．
(收稿日期:2014-04-15)
117第 10 期 陈岩岩等 多药效学指标结合 HPLC优选晕定方中天麻、葛根提取工艺
13 料液比 19- 00* 57.00 JH 提取坦度 55.00 57.00 59.00 61.00 63.00 65.00 Ratio 18. 00^55.00 Tcwpexature CC) 提取 fi度 Tcaj>i;raturc (C)
A 因素间响应面；B 等值线。A response surface diagram� B contours.
图2提取温度与料液比对糖含量影响交互作用
Fig. 2 Interaction of extraction temperature and solvent ratio on the yield of
sacchari des
A 因素间响应面；B 等值线。A response surface diagram� B contours.
图3提取时间与料液比对糖含量影响交互作用
响应面分析滅化秀丽莓总糖提取工艺 • •
Optimazation of saccharides extraction from Rubus amabilis
by response surface methodology
(正文见第 704 Refer toP704)
ature (^C)
55. 00 57. 00 59. 00 61. 00 63. 0.0 65. 00
XJ提取fi度 Temperature CC>
A 因素间响应面；B 等值线。A response surface diagram� B contours.
图1提取温度与提取时间对糖含量影响交互作用
Fig.1 Interaction of extract ion temperature and extraction time on the
yield of sacchar ides
F i g. 3 Interaction of extracti on t ime and so[vent rat i o on the yield of saccharides