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茶梅花瓣总RNA提取方法的比较和分析



全 文 :中国农学通报 2013,29(28):129-133
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺
利进行基因克隆、RT-PCR分析、构建 cDNA文库等分
子生物学研究的前提[1]。由于植物种类的多样性和植
基金项目:云南省自然科学基金“6种主要切花ACC合成酶和ACC氧化酶基因的克隆和分析”(2010ZC268);国家林业局948项目“无籽果实应用技术
引进”(2011-4-45);西南林业大学大型仪器设备共享基金;园林植物与观赏园艺省高校重点实验室基金。
第一作者简介:吴田,女,1980年出生,副教授,博士,主要从事植物生物技术及分子生物学方面的研究。通信地址:650224云南省昆明市盘龙区白龙
寺300号西南林业大学园林学院140号信箱,Tel:0871-3862056,E-mail:461257271@qq.com。
通讯作者:蓝增全,男,1963年出生,广东梅县人,教授,硕士,主要从事生态学和植物学方向的研究。通信地址:650224云南省昆明市盘龙区白龙寺
300号西南林业大学环科院,Tel:0871-3864016,E-mail:2351417655@qq.com。
收稿日期:2013-02-19,修回日期:2013-04-25。
茶梅花瓣总RNA提取方法的比较和分析
吴 田 1,蓝增全 2
(1西南林业大学园林学院,昆明 650224;2西南林业大学环科学院,昆明 650224)
摘 要:总RNA的纯度和完整性对植物分子生物学实验至关重要,为了探索更适合茶梅花瓣总RNA的
提取方法,本研究分别利用CTAB多级沉淀法、改良的异硫氰酸胍法、改良的热硼酸法、Trizol法和
EASY spin植物RNA提取试剂盒法等 5种方法提取茶梅花瓣总RNA,并进行了对比分析。结果发现
EASY spin植物RNA提取试剂盒法是最为简单、快速、高效的方法,该方法得到的RNA条带在琼脂糖凝
胶上有清晰的28S、18S和5S 3条带,且超微量分光光度计测量的A260/280、A260/230均在允许范围内,表明该
方法得到的RNA完整、质量高。CTAB多级沉淀法得到的RNA质量次之。本研究为今后有效开展茶梅
分子生物学研究提供技术便利,并为其他花卉植物RNA的提取提供必要的参考。
关键词:茶梅;花瓣;改良;多糖;RNA提取试剂盒
中图分类号:S663.1 文献标志码:A 论文编号:2013-0440
Comparison and Analysis of Methods of Extracting Total RNA from Petals of Camellia sasanqua
Wu Tian1, Lan Zengquan2
(1Landscape Architecture College, Southwest Forestry University, Kunming 650224;
2Environment Science and Engineering College, Southwest Forestry University, Kunming 650224)
Abstract: The purity and integrity of total RNA are essential for plant molecular biology experiments and to
get a more appropriate method of extracting total RNA of petals of Camellia sasanqua, the total RNA from
petals of Camellia sasanqua was extracted by the methods of CTAB-many-level-precipitation method,
improved isothiocyanate method, improved hot-borate method, trizol method and EASY spin plant RNA
extraction Kit method, respectively, and the five methods were contrasted and analyzed. The results showed
that the method of EASY spin plant RNA extraction Kit was the simplest, the quickest and high efficient, and
the RNA extracted by this method could be seen clearly three bands of 28S, 18S and 5S by agarose gel
electrophoresis, and the values of A260/280 and A260/230 located within bounds by NanoVue spectrophotometer,
showing the RNA extracted by this method was intact and high-quality. The quality of RNA extracted by
CTAB-many-level-precipitation method took the second place. The study provided convenient and effective
technical supports for the research on molecular biology of Camellia sasanqua, and also provided necessary
reference for the RNA extraction of other flowers.
Key words: Camellia sasanqua; petals; improved; polysaccharide; RNA extraction kit
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
物组织所含成分的复杂性,不同植物或同种植物不同
组织所适宜的 RNA 提取方法千差万别 [2]。茶梅
(Camellia sasanqua)是山茶科、山茶属常绿灌木,因其
花型兼具茶花和梅花的特点,故称茶梅,其花色艳丽,
花期长,是著名赏花植物。茶梅花瓣中富含蛋白质、脂
类化合物及多糖类物质 [3],这在很大程度上提高了
RNA提取的难度,导致至今为止国内外鲜有茶梅RNA
提取的报道。
目前,用于提取花瓣 RNA的方法主要有 Trizol
法、CTAB法、异硫氰酸胍法、试剂盒法等,前人的研
究表明,不同提取方法对不同花瓣RNA的提取效果不
同[4]。目前花瓣RNA提取较为成功的报道仅限于非洲
菊[5]、月季[6]、芍药[7]、百合[8-9]等少数花卉。本研究中笔
者分别对比分析了CTAB多级沉淀法、改良的异硫氰
酸胍法、改良的热硼酸法、Trizol法和EASY spin植物
RNA提取试剂盒法等 5种方法提取茶梅花瓣总RNA
的效果,以期得到提取快速、简易且高质量的RNA,为
今后有效开展茶梅分子生物学研究提供技术便利,并
为其他花卉植物RNA的提取提供必要的参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用的茶梅采摘于西南林业大学树木园,
为盛开花朵的花瓣。花枝采样后立即带回实验室,剪
下花瓣立即用液氮速冻,放入-80℃冰箱保存待用。
1.2 药品及用具器皿的处理
Trizol试剂购自美国 Invitrogen公司,EASYspin植
物RNA提取试剂盒(RN09)购自北京艾德莱生物公司,
其他药品均为国产分析纯,购自北京鼎国公司。配制
试剂均用0.1% DEPC处理并灭菌的水。离心管、枪头
用0.1%DEPC水浸泡过夜,高压灭菌30 min,烘箱中彻
底烘干备用。所有玻璃器皿、研钵、研棒等用0.1 mol/L
NaOH浸泡 6 h并清洗干净,用锡箔纸包好后置于
180℃烘箱8 h。电泳槽用0.1 mol/L NaOH处理过夜并
清洗干净。
1.3 总RNA的提取方法
1.3.1 Trizol法 取 0.1 g花瓣,液氮迅速研磨,转入
1.5 mL离心管,立即加入1 mL Trizol,涡旋振荡1 min,
冰浴5 min,4℃ 13000 g离心5 min,上清转入新的离心
管,加入等体积的氯仿、异戊醇(体积比 24:1)混合液
抽提,4℃ 13000 g离心 5 min,取上清,加 2/3体积的异
丙醇,颠倒混匀,冰浴5 min。4℃ 13000 g离心10 min,
除去上清,于沉淀中加入 1 mL 75%乙醇洗涤沉淀 2
次,将沉淀于超净工作台晾干后加入50 μL DEPC水溶
解。
1.3.2 CTAB多级沉淀法 取0.1 g花瓣,液氮迅速研磨,
转入 1.5 mL离心管,加入 600 μL 65℃预热的 2×CTAB
抽提液和20 μL β-巯基乙醇,涡旋振荡1 min,65℃温育
10 min,加入等体积Tris饱和酚(pH 9.5)混匀,65℃保温
5 min,期间取出涡旋振荡数次。取出放至室温,常温
下 13000 g离心 10 min。取上清,加入等体积的氯仿、
异戊醇(体积比 24:1)混合液抽提,常温下 13000 g,离
心 10 min。取上清,加入 2/3体积的异丙醇,上下颠倒
混匀,室温静置 10 min。4℃ 13000 g,离心 10 min,除
去上清,在沉淀中加入 500 μL水溶解,加 2.5 mol/L
LiCl沉淀 RNA,混匀,冰浴 2 h。4℃ 13000 g,离心
10 min,除去上清,在沉淀中加入 500 μL水溶解,加入
50 μL 3 mol/L NaAC(pH 5.3),加入 1 mL 无水乙
醇,-20℃沉淀 30 min。4℃ 13000 g,离心 10 min,除去
上清,用75%乙醇洗涤2次,将沉淀于超净工作台晾干
后加入50 μL DEPC水溶解。
1.3.3 改良异硫氰酸胍法 取 0.1 g花瓣,液氮迅速研
磨,转入1.5 mL离心管,加入800 μL 4 mol/L异硫氰酸
胍,80 μL 10% SDS,20 μL β-巯基乙醇摇匀,涡旋振荡
1 min,4℃ 13000 g离心 5 min,上清转入新的离心管,
加入等体积的氯仿、异戊醇(体积比 24:1)混合液,1/4
体积2 mol/L NaAC (pH 4.8),充分混匀,4℃ 13000 g离
心10 min,上清转入新的离心管。加入2/3体积的异丙
醇,上下颠倒混匀,颠倒混匀,冰浴 30 min。 4℃
13000 g离心 5 min,收集沉淀,除去上清,用 75%乙醇
洗涤 2次,将沉淀于超净工作台晾干后加入 50 μL
DEPC水溶解。
1.3.4 改良的热硼酸盐法 在研钵中加入20 mg交联聚
乙烯吡咯烷酮(PVPP)和0.1 g花瓣,液氮迅速研磨成粉
末后转移至预先加入 2 mg DTT、10 μL乙基苯基聚乙
二醇 (NP-40)和 20 g 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP-40)的
1.5 mL离心管。在该离心管中加入 1 mL 80℃的提取
缓冲液(0.2 moL/L脱水四硼酸钠,30 mmoL/L EDTA·
Na·2H2O,10 g/L SDS,10 g/L脱氧胆酸钠盐),振荡混
匀。加入 40 μL蛋白酶K(20 μg/mL),盖好管盖,平放
于转速 100 r/min、温度为 42℃的气育摇床上振荡 1 h。
样品放至室温,加入 80 μL 2 mol/L的KCl,混匀,置于
4℃条件下1 h。4℃ 13000 g离心20 min,取上清,加入
1/3体积的 8 mol/L的 LiCl (4℃),混匀,于 4℃过夜保
存。4℃ 13000 g离心 20 min,去除上清液,RNA沉淀
于管底。加入1 mL 2 mol/L LiC1 (4℃),轻柔振荡,4℃
13000 g离心20 min,除去上清,重复1次该步骤。用1 mL
10 mmol 的 Tris-HCl (pH 7.5)充分溶解沉淀。 4℃
13000 g离心 20 min,去沉淀,取上清。加入 100 μL
·· 130
吴 田等:茶梅花瓣总RNA提取方法的比较和分析
2 mol/L的KAC (pH 5.5),4℃ 30 min。4℃ 13000 g离
心 20 min,取上清,加 2.5倍体积的无水乙醇,摇
匀,-20℃ 0.5 h。4℃ 13000 g离心 20 min,去上清,留
RNA沉淀。1 mL 75%乙醇清洗沉淀 2次。将沉淀于
超净工作台晾干后加入50 μL DEPC水溶解。
1.3.5 EASY spin植物RNA提取试剂盒法 按试剂盒操
作步骤进行。
1.4 RNA样品质量检测
为检测样品的纯度和质量,取1 μL RNA样品用超
微量分光光度计(NanoVue,英国)测定A260/280、A260/230和
RNA样品浓度,该仪器可以直接读数,迅速且精确。
纯RNA的A260/280为 1.8~2.2,小于 1.8表明蛋白杂质较
多,大于 2.2表明RNA已经降解;以A260/230作为参考值
估计去盐的程度,A260/230应大于 2。取 3 μL样品,加
2 μL 6×RNA上样缓冲液,用 1%琼脂糖凝胶(加入 1×
核酸染料GoldView,Takara公司)电泳,120 V电压电
泳20 min,在凝胶成像分析系统下拍照,以检测样品的
完整性。
1.5 总RNA的纯化
采用的脱氧核糖核酸酶Ⅰ(Takara公司)除去
RNA中可能残存的基因组DNA,按照使用说明书步
骤进行。
1.6 cDNA的合成及检测
为了进一步验证所抽提RNA的完整性,用 1.4中
检测的较高质量的 RNA进行反转录,使用 Qiagen
cDNA第一链合成试剂盒,按照说明书步骤进行操作,
得到所需要的 cDNA模板。根据在NCBI检索得到的
茶梅查尔酮合成酶基因序列(GU722500),设计 1对特
异性引物(F:CCAAGGCCATCAAAGAATGG 和 R:
GGAAATAAGCCCAGGAACAT),PCR产物理论值为
497 bp。PCR反应采用 25 μL体系,含有 1×buffer(含
Mg2 +),0.25 mmol/L dNTPs,0.2 μmol/L F和 R引物,
1 U Taq酶,50 ng cDNA模板,不足体积用无菌超纯水
补足。PCR扩增程序为95℃ 3 min;94℃ 45 s,53℃ 45 s,
72℃ 60 s运行 32个循环;72℃充分延伸 10 min,4℃暂
存。将PCR产物在 1%琼脂糖凝胶(加入 1×核酸染料
GoldView)上进行电泳,在凝胶成像分析系统下拍照,
回收亮带,克隆到 pMD18-T载体上,由北京华大中生
科技发展有限公司测序。Taq酶、dNTPs、回收试剂盒、
克隆载体 pMD18-T等分子生物学常规试剂购自
Takara生物公司。
2 结果与分析
2.1 RNA不同提取方法的比较
电泳结果(图1)显示,Trizol法和改良的热硼酸盐
法没有得到电泳可见的28S、18S RNA条带;改良的异
硫氰酸胍法和CTAB多级沉淀法能得到RNA,而且量
比较大,但有弥散条带,且A260/230均大于 2.2(表 1),说
明RNA存在降解,表明用这2种方法提取的RNA质量
不高;EASY spin植物RNA提取试剂盒法得到的RNA
条带在琼脂糖凝胶上有清晰的 28S、18S和 5S 3条带,
且超微量分光光度计测量的A260/280、A260/230均在允许范
围内,表明该方法得到RNA完整、质量高。
2.2 反转录效果检测
为进一步检测提取的RNA质量,分别用CTAB多
级沉淀法、EASYspin植物RNA提取试剂盒法、改良异
硫氰酸胍法提取的RNA进行反转录,得到 cDNA模
板,用F和R作为引物,用PCR进行特异性扩增。结果
表明,改良异硫氰酸胍法不能得到PCR产物,剂盒法、
CTAB多级沉淀法均能得到PCR产物,扩增片段大小
与设计引物的预期片段大小一致,约500 bp(图2)。切
下条带,回收,克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明
条带大小为 497 bp,与发表的茶梅查尔酮合成酶基因
序列(GU722500)一致,说明该方法提取的总RNA适于
后续的实验。
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 M
1:改良异硫氰酸胍法;2:EASYspin植物RNA提取试剂盒法;
3:CTAB多级沉淀法;4:Trizol法;5:热硼酸盐法;M:marker 2000
图1 5种方法提取的茶梅花瓣RNA电泳图
提取方法
Trizol法
改良的热硼酸盐法
CTAB多级沉淀法
改良的异硫氰酸胍法
试剂盒法
A260/280


1.78
2.02
2.29
A260/230


2.38
2.43
2.08
RNA浓度/(ng/μL)


3431
3511
2109
表1 5种方法提茶梅花瓣RNA质量及浓度比较
·· 131
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
3 结论与讨论
由于大部分植物花瓣组织中富含多糖、多酚、类黄
酮等次生代谢物,当细胞破碎后,这些物质会与RNA
相互作用,以不同方式干扰RNA的提取,而且细胞破
碎后细胞内的RNA酶会对体系中的RNA进行降解,
因此,植物花瓣RNA较难提取[10]。本研究表明,试剂
盒法效果最佳,得到的 RNA浓度达 2109 ng/μL,且
A260/280值为2.29、A260/230值为2.08,不论是浓度还是质量都
最佳,能进行反转录,满足后续的试验要求;其次是CTAB
多级沉淀法,得到的RNA浓度较高,达3431 ng/μL,但
A260/280值为1.78(小于1.8),表明蛋白杂质较多,且从图
1第3泳道的电泳结果发现有拖带现象,说明存在一定
的降解,后续基因克隆的条带较弱(图 2第 3泳道)来
看,进一步表明可能因为该方法提取的RNA的部分降
解及纯化不够而降低了反转录的效率;改良异硫氰酸
胍法虽然能提取 RNA,但 RNA有降解,且反转录的
cDNA模板不能用于后续的基因克隆;而Trizol法、改
良的热硼酸盐法未提取得到RNA。
本实验用Trizol法提取RNA在沉淀步骤,得到了
大量的透明胶状物,推测是这些物质是茶梅花瓣中丰
富的多糖。多糖理化性质与RNA相似,提取过程中往
往与RNA形成难溶的沉淀 [11],而除去多糖的时RNA
很容易被一起去除[12],造成RNA产量的减少,或者根
本无法得到RNA。因此,Trizol法方法不适合茶梅花
瓣的RNA提取。热硼酸法提取植物组织RNA最早由
提出 [13],经过多次改良应用于多种植物的 RNA 提
取[14-16],但在本实验中虽然没有得到一些不明胶状物,
但也没有得到茶梅的RNA,说明该方法的一系列步骤
虽然较好地去除了多糖,但可能因为该方法实验操作
步骤繁多,RNA得率逐步减少,而且可能茶梅中
RNase活性比较高,在RNA得率少的基础上又逐渐降
解RNA,最终导致无法得到可用的RNA。CTAB多级
沉淀法和改良异硫氰酸胍法虽然得到了一些RNA,但
可能也是因为操作步骤繁多,导致了RNA的一部分降
解。
本实验用了多种试剂提取RNA均没有得到较为
理想的RNA后,又多次尝试不同的RNA试剂盒,如
TransZOL Plant RNA提取试剂盒(北京,全式金生物技
术有限公司)、TransZOL UP试剂盒(北京,全式金生物
技术有限公司)、RNA simple总RNA提取试剂盒(北
京,天根生化科技有限公司)等,但均未能得到RNA,
而EASYspin植物RNA提取试剂盒可以在较短的时间
内获得高质量的RNA,说明该试剂盒中存在有效去除
多糖物质的成分,而该成分是其他试剂盒中所缺少
的。这也充分证明了植物材料RNA提取的复杂性。
综上所述,EASYspin植物RNA提取试剂盒法提取方
法简单、提取量大、RNA质量高,适合茶梅RNA的提
取,充分显示了此方法在茶梅花瓣RNA提取上的优越
性,因此,在实验经费允许的前提下,该方法是首选的,
次之可选的方法是CTAB多级沉淀法。茶梅RNA方
法的获得为茶梅的基因克隆、mRNA表达分析等分子
生物学实验提供了技术支持。
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2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3
1:改良异硫氰酸胍法;2:EASYspin植物RNA提取试剂盒法;
3:CTAB多级沉淀法;M:marker 2000
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·· 132
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