全 文 ：[文章编号 ] 1000-8861(2009)05-0612-02
刺苋花粉过敏原 Prf23的表达优化及其免疫学鉴定
OptimalexpressionandimmunogicalcharacterizationofthepolenallergenPrf23 from
Amaranthusspinosus
黄飞龙(HUANGFeilong)1, 2 ,马三梅 (MASanmei)1 ,陶爱林(TAOAilin)2＊ , 王永飞 (WANG
Yongfei)1 ,赖　荷(LAIHe)2 ,邹泽红(ZOUZehong)2
作者单位:1.暨南大学生命科学技术学院生物工程学系;2.广州医学
院第二附属医院
收稿日期:2008-10-13;修回日期 2009-02-16
基金项目:国家自然科学基金(30771240)、广东省医学科研基金
(A2008284)、广州市中医药中西医结合科研课题(2008A53)、广州医
学院自然科学研究项目重点课题(0702006)资助
＊通信作者:陶爱林 ,广州医学院第二附属医院 , 广州 510260;Tel:
020-34153901;E-mail:AerobiologiaTao@163.com
　　在我国华南地区 , 刺苋(AmaranthusspinosusL.)花粉为
一种重要的吸入性过敏原 , 其过敏原组分复杂且能与人血清
中的特异性 IgE发生结合 , 从而引发 I型变态反应 [ 1] 。临床
上使用的刺苋花粉过敏原粗提液普遍难于达到质量标准化
和诊治安全性的要求。利用基因工程技术构建具有免疫原
性的重组花粉过敏原 , 无疑为脱敏治疗疫苗标准化以及过敏
原芯片的研制提供了重要基础。此前 ,我们在克隆了刺苋花
粉泛过敏原基因后 , 通过理论分析确定了其中的一个克隆
Prf23为过敏原性较低的克隆 [ 2] 。本文研究采用原核系统高
效表达刺苋花粉过敏原 Prf23的条件及免疫学鉴定结果。
1　材料与方法
1.1　实验材料　E.coliRoseta(DE3)购自 Novagen公司;羊
抗人 IgE-Peroxydase购自 Sigma;表达载体 pET44a-Prf23于广
州医学院第二附属医院过敏反应实验室构建;所有现苋花粉
过敏病人血清由广州医学院第二附属医院变态反应科提供。
1.2　重组过敏原 Prf23的诱导表达　将 pET44a-Prf23表达
质粒转化宿主大肠杆菌 Roseta,在筛选平板上挑取成功转化
的单菌落接种于 5 mL的 LB/Amp(100 μg/mL)液体培养基
中培养过夜。再将过夜培养的菌液按照 1∶100的浓度接种
至 5 mL的 LB/Amp(100 μg/mL)液体培养基中 , 37 ℃振荡
培养(转速为 200 r/min), 然后根据不同的菌密度 、诱导温
度 、诱导时间以及 IPTG浓度来优化表达重组过敏原 Prf23。
收集诱导表达后的菌液 ,分别取 1.5 mL于 12 000r/min离心
5 min获得菌体 , 加入 200 μL的 2 ×SDS上样缓冲液 , 煮样
6 min后即可上样跑胶。通过用 12.5%的 SDS-PAGE胶检测
重组菌外源基因的表达。
1.3　重组过敏原 Prf23的可溶性分析　重组蛋白的可溶性
按照文献 [ 3]中的方法进行分析。
1.4　免疫学鉴定　蛋白的免疫学鉴定按照文献 [ 4]所述方
法进行。
2　结果
2.1　重组过敏原 Prf23的表达优化　含有 pET44a-Prf23的阳
性 Roseta菌株在 IPTG诱导后 ,所表达的蛋白经过 SDS-PAGE
电泳检测, 发现在相对分子质量约 14.0×103处出现由重组菌
特异表达的目标蛋白条带, 而对照组没有此蛋白条带。
2.1.1　不同菌密度对重组菌表达效果的影响　在 0.4 ～
0.8范围的 OD600 nm中 , 以菌密度 OD600nm值达到 0.6时对重
组菌进行诱导的表达效果最好(图 1)。
M)Marker; 1)Roseta/pET44a-Prf23 withoutinduction;2-6)
Roseta/pET44a-Prf23inducedbyIPTGatOD600nmof0.4、0.5、0.6、 0.7
and0.8.
图 1　不同菌密度对重组菌表达效果的影响
Fig1　ExpressionofrecombinantallergenPrf23in
differentOD
600nmvalue
2.1.2　不同温度和时间诱导刺苋花粉过敏原 Prf23的表达
　低温(25℃)诱导可大幅提高重组过敏原 Prf23的表达量
(图 2)。重组过敏原 Prf23的表达量在诱导 6 h后达到最佳
(图 2),随着时间延长蛋白表达量逐渐减少。
2.1.3　不同 IPTG浓度诱导重组刺苋花粉过敏原 Prf23的表
达　在 25℃条件下 ,不同浓度的 IPTG对 Roseta表达宿主的
诱导以其终浓度为 0.5 mmol/L时的效果最为理想(图 3)。
2.2　重组过敏原 Prf23的可溶性分析　裂解重组菌 , 离心
裂解菌液 , 将所得到的沉淀与上清液分别进行 SDS-PAGE
电泳分析 , 结果显示重组刺苋花粉过敏原 Prf23主要以可溶
形式存在于上清液中(图 4)。
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　·短篇报道· 　　 　　　　　　　　　　　　　　　　免疫学杂志　第 25卷　第 5期　2009年 9月　DOI :10.13431/j.cnki.immunol.j.20090162
2.3　重组过敏原 Prf23的免疫原性检测　用确诊的 6名刺
苋花粉过敏患者的血清对重组刺苋花粉过敏原 Prf23进行过
敏原性检测 , 同时再以 2名非刺苋花粉过敏患者血清作为阴
性对照。 Westernblot试验表明重组花粉过敏原 Prf23存在
较高的过敏原性(图 5)。
M)prestainedproteinmarker;1-3)bindingwithpositiveserumIgE
frompatientsalergictoAmaranthusspinosus;4)negativeserum.
图 5　刺苋花粉过敏原 Prf23的 Westernblot
Fig5　WesternblotingofrecombinantpollenallergenPrf23
3　讨论
刺苋花粉过敏原 Prf23 是一种肌动蛋白抑制蛋白
(Profilin)[ 4] 。为了提高重组刺苋花粉过敏原的表达量及其
可溶性 , 本研究尝试了多种方法。发现当菌密度 OD600nm值
达到 0.6时 , 加入终浓度为 0.5 mmol/L的 IPTG、于 25 ℃下
诱导 6 h可明显提高重组刺苋花粉过敏原 Prf23的表达量 ,
与此前我们表达豚草及葎草花粉泛过敏原所采用的条件 [ 4]
明显不同。重组过敏原主要在胞内以可溶形式存在。通过
使用对刺苋花粉过敏的患者血清进行 Westernblot检测 , 结
果显示重组刺苋花粉过敏原 Prf23能与刺苋花粉过敏患者血
清中的特异性 IgE结合 , 由此证明重组花粉过敏原 Prf23具
有过敏原性。
重组花粉过敏原在抗原性改造 、表达产量 、质量控制以
及安全性方面都具有良好的发展优势 ,适合用于构建高质量
和标准化的花粉疫苗。本文通过高效表达重组刺苋花粉过
敏原为该过敏原的过敏原性改造及其过敏性疾病的特异性
诊治奠定了基础。
[关键词 ] 　刺苋;花粉;Prf23;过敏原
[中图分类号 ] 　R392.8　　　[文献标志码 ] B
[参考文献 ]
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(编辑　侯　瑞)
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　免疫学杂志　第 25卷　第 5期　2009年 9月　　 　　　　　　　　　　　　　　　　·短篇报道·