全 文 ：CC’环组成 , CD4D1 domain的口袋状结构做为关键
表位参与稳定 CD4与 MHCⅡ相互作用 [ 6] 。近些年
来 ,人们一直在努力研制一些小分子化合物 ,试图模
拟或阻止这一表面口袋结构 [ 7、8] 。本实验所用药物
J2就是基于 CD4分子的 domain1结构通过计算机
辅助药物设计技术获得的一类新型小分子非肽类化
合物之一[ 9] 。 J2的体外实验中初步证实了其具有
良好的抑制 CD4分子与 MHCⅡ分子结合的作用 ,可
达到阻断抗原提呈的目的 。我们的实验也进一步证
明了 J2具有抑制 T细胞增殖 ,影响炎性因子分泌的
免疫抑制作用。总之 , J2做为一种新型的免疫抑制
剂具有良好的应用前景。
参考文献:
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Proc [ J] . N at l. Acad. S ci. U. S. A. , 1997, 94(1):73
(收稿日期:2006-12-29;修回日期:2007-01-10)
(本文编辑　魏　萍)
文章编号:1008-9926(2007)02-0084-04　　中图分类号:R943　　　文献标识码:A
蕨麻素冻干脂质体的制备及理化性质的研究①
张雅铭② ,侯陆星③ ,蔡光明
(②解放军第 302医院　全军中药研究所　北京　100039;③首都师范大学　化学系　北京　100037)
摘　要:目的　制备蕨麻素冻干脂质体注射剂并研究其理化性质。方法　采用薄膜超声分散法并冷冻干燥来制备蕨麻素脂
质体 , 用葡聚糖凝胶(Sephadex G-50)微型柱离心法测定包封率。结果　制得的蕨麻素脂质体包封率为 56. 62%, 粒径范围为
71. 70 ～ 166. 47nm , 透射显微镜下观察脂质体为粒径均匀的球类或近球状小囊泡。结论　蕨麻素脂质体处方和制备工艺稳定
可行 , 重现性好。
关键词:蕨麻素;脂质体;薄膜超声分散法;理化性质
Preparation and Characterization of JM S liposom es
①
ZHANG Ya-M ing② , HOU Lu-X ing③ , CA IGuang-M ing
(②PLA Institute of Ch ineseM ateriaM edica, 302Hospital of PLA , Beijing　100039　China)
(③Department of Chem istry, CapitalN orma lUnive rsity , Be ijing　100037　China)
ABSTRACT:Ami To prepa re and cha racterize JM S liposomes. M ethods the liposomes w ere p repared w ith th in
84 　解放军药学学报　第 23卷第 2期　　蕨麻素冻干脂质体的制备及理化性质的研究　　　　　　　　　张雅铭　　
①
②
基金项目:“十五 ”国家科技攻关计划 “西部开发科技行动 ”重大项目 , No. 2004BA901A25
作者简介:张雅铭(1978-),女 ,山西太原人 ,在读硕士。研究方向:中药现代化与新型给药系统。 E-m ai l:yam ing_52@126. com
　　通讯作者:蔡光明(1953-), 男 ,湖南浏阳人 , 研究员 , 硕士生导师。研究方向:新药研发及质量标准。 Tel:(010)66933323;E-mai l:
cgm1004@ vip. sina. com
film evapo ra tion and probe ultrasonic technique before being treated furthe r by lyophilization. The entrapment effi-
ciency w as de term ined by Sephadex G-50m inicolumn cen trifugationme thod . Results The en trapmen t e fficiency o f
the liposomesw as 56. 62%. The range o f size distribution of the liposomes w as 71. 70 ～ 166. 47nm. The result o f e-
lec tron m icrography and the size distribution show ed that the JMS liposomes w ere sm all spherica l o r near-spherica l
vesicles. Conclusion The se lected fo rmation and preparation of JMS liposomes is practicable and reproducible.
KEYWORDS:JM S;Liposome;Membrane-sonicme thod;Physico-chem ical property
　　蕨麻为蔷薇科委陵菜属植物鹅绒委陵菜
(Poten tilla anserina L.以下称 JM),藏名为卓老洒
尊 ,为藏医常用药 ,主产于青海及甘肃甘南地区 ,由
其根茎部提取的活性部位为蕨麻素 (蕨麻总皂苷类
成分 ,以下简称 JM S), 系统的药效实验研究发现
JM S具有抑制乙肝病毒 ,保肝降酶 ,提高免疫力 ,增
强肝脏解毒和代谢等作用 [ 1 ～ 4] 。其中由 JM S中分
离得到的主要化合物成分蕨麻苷 (其化学名称为
2α, 3β , 19β-三羟基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸-28-O-β-
D-吡喃半乳糖苷 ,简称为 JMG)属国内外首次发现
的新化合物成分 [ 5] ,是 JM S中的主要活性成分之
一 。
由于 JM S在水中溶解度较低 ,将其制成脂质体
可以解决其难溶性问题 ,以达到提高药物载药量的
目的。脂质体具有容易被肝 、脾等网状内皮系统吞
噬等特点而主要在肝脏等部位富集 , 起到被动靶向
的效果 ,从而提高药物的生物利用度。本文就注射
用 JM S冻干脂质体的制备工艺及其理化性质进行
了考察 。
1　材料
1. 1　试药 　 JM S(JMS含量 >90%, 解放军第 302
医院全军中药研究所制备 );JMG对照品 (纯度 >
98%,解放军第 302医院全军中药研究所制备 );
Sephadex G-50(sigma公司);注射用大豆卵磷脂 (上
海太伟药业有限公司 ,批号 20060314);胆固醇 (平
顶山市东珠生物制品有限公司 ,批号 20060211);甲
醇为色谱醇;其它试剂为分析纯 。
1. 2　仪器　Agilen t1100高效液相色谱仪 (美国惠
普公司 );A gilen t Prep-C18 S calar C olumns(4. 6mm ×
100mm , 5μm);SENCO R系列旋转蒸发器 (上海申
生科技有限公司 );NANOPHOX动态光散射纳米粒
度分析仪 (德国 Sympatec公司 );JEM-1230透射电
子显微镜(JEOL);JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机 (宁
波新芝科器研究所 );LD4-2离心机 (北京医用离心
机厂 );LG J-18型冷冻干燥机 (北京四环科学仪器
厂 );METTLER TOLEDO DELTA 320 pH计 。
2　方法与结果
2. 1　 JM S脂质体处方优化的选择　采用薄膜-超声
法制备 JM S脂质体 ,考虑到众多因素对脂质体质量
的影响 ,以 JM S脂质体的包封率为评价指标 ,确定
影响包封率的 4个主要因素 ,每个因素取 3个水平 ,
按 L9(34)安排正交试验 ,见表 1、2、3。
表 1　正交因素-水平设计表
Tab1　The factor-level tab le o f orthogona l des ign
水平
因素
A:磷脂的浓
度(W /V)
B:胆固醇∶
磷脂(W W/ )
C:药物的
含量(m g)
D:有机溶剂
的体积(m l)
1 3% 1∶3. 5 6 5
2 2. 5% 1∶4 5. 5 10
3 2% 1∶5 5 15
表 2　正交试验结果
Tab2　The results of L 9(34) orthogonal design
试验号 A B C D 包封率(%)
1 1 1 1 1 50. 2
2 1 2 2 2 46. 8
3 1 3 3 3 42. 7
4 2 1 2 3 44. 4
5 2 2 3 1 40. 8
6 2 3 1 2 30. 5
7 3 1 3 2 41. 9
8 3 2 1 3 31. 8
9 3 3 2 1 30. 5
k1 139. 701 136. 500 112. 500 121. 500
k2 115. 701 119. 400 121. 701 119. 199
k3 104. 199 103. 701 125. 400 118. 899
k1 46. 567 45. 500 37. 500 40. 500
k2 38. 567 39. 800 40. 567 39. 733
k3 34. 733 34. 567 41. 800 39. 633
R 11. 834 10. 933 4. 300 0. 867
表 3　方差分析结果
Tab3　Resu lts o fANOVA
因素 偏差平方和 自由度 F值 F临界值 显著性
A 218. 722 2 162. 136 19. 000 P <0. 05
B 179. 416 2 132. 999 19. 000 P <0. 05
C 29. 416 2 21. 806 19. 000 P <0. 05
D 1. 349 2 1. 000 19. 000
　　F
0. 05
(2, 2)=19. 00,选择 R值最小的 D项作为误差的近似估计。
85 　解放军药学学报　2007年 4月　第 23卷　第 2期　　　P harm J Ch in P LA　Vo l 23　 No2　Apr2007　　　　　
由表 2的正交表直观分析和表 3的方差分析结
果表明:影响 JMS脂质体包封率的主次因素为 A >
B >C >D ,其中 A、B、C的影响有显著意义 , D因素
无显著意义 。确定最佳制备工艺为 A1 B1C3D 1 ,即磷
脂的用量为 3%,磷脂与胆固醇的质量比为 3. 5∶1,
药物的含量为 5mg,氯仿与甲醇的用量为 5m l。
2. 2　JM S脂质体的制备　称取处方量 JM S,大豆卵
磷脂和胆固醇用氯仿和甲醇 (2∶1)溶解 ,转移至 1
000m l的茄形瓶中 , 40℃恒温水浴中 ,用旋转蒸发仪
减压蒸馏除去有机溶剂 ,在瓶壁上形成均匀类脂薄
膜 ,将适量浓度的甘露醇和葡萄糖的水溶液加入茄
形瓶中 ,轻摇 ,将类脂膜洗脱并水合成脂质体初悬
液 ,置探头式超声至半透明胶体溶液 ,微孔滤膜滤
过 ,滤液分装后冷冻干燥。
2. 3　HPLC法测定 JMS脂质体的含量　本试验以
制剂中主要化合物成分 JMG含量来指示 JM S的含
量 ,采用 HPLC法测定脂质体中 JMG的浓度。
2. 3. 1　色谱条件 　色谱柱:Ag ilent Prep-C18 Sca lar
Columns;流动相:甲醇-水 (60∶40);柱温:室温;流速:
1. 0m l /m in;紫外检测波长:208nm;进样量:10μl。
2. 3. 2　对照品储备液的制备　精密称取 JMG对照
品 100mg置 25m l容量瓶中 ,加流动相溶解并稀释
至刻度 ,摇匀 ,置于 4℃冰箱备用。
2. 3. 3　专属性试验　精密量取空白脂质体及 JMS
脂质体溶液各 0. 5m l,以甲醇破乳定容至 10m l,分别
进样分析;精密量取 JMG对照品储备液适量 ,用流
动相稀释至适当浓度 ,进样分析 ,结果 JMG峰的保
留时间为 8. 3m in,空白脂质体在 JMG峰处无假阳性
峰 ,即 JM S脂质体中其他成分对 JMG含量测定没有
影响。
2. 3. 4　线性关系考察 [ 6] 　精密量取 JMG对照品储
备液稀释成 0. 050、0. 10、0. 20、0. 50、1. 00、2. 00mg
m l
- 1 ,分别进样 10μl,记录峰面积。以峰面积对进样
浓度进行回归处理 ,得方程为:
Y =3 302. 5X +1. 490 9, r =0. 999 9
结果表明:JMG在 0. 050 ～ 1. 0mg m l-1内线性
关系良好。
2. 3. 5　精密度试验　取 JMG对照品溶液 ,重复进
样 5次 ,结果 5次峰面积 RSD为 0. 7%,取 JM S脂质
体样品溶液 ,重复进样 5次 ,结果峰面积 RSD为 1.
1%。
2. 3. 6　重建后脂质体溶液稳定性试验　 JM S冻干
脂质体重建后密封室温放置 ,于 0、1、2、4、6、8h进样
10μl测定峰面积 ,结果表明 JM S冻干脂质体重建后
在 8h内基本稳定 ,以峰面积计算 , RSD为 0. 7%。
2. 3. 7　加样回收率试验 　精密量取已知浓度的
JM S脂质体溶液 (20060602)6份 ,分别加入 JMG对
照品溶液适量 , 以甲醇破乳定容至适当浓度 , 按
2. 3. 1项色谱条件测定回收率 ,结果见表 4。
表 4　 JM S脂质体回收率的测定结果
Tab4　R esults of recovery in JM S liposom es
编号 样品含量
(mg)
加入量
(m g)
测定量
(m g)
回收率
(%)
–x
(%)
RSD
(%)
1 0. 262 0. 201 0. 459 98. 0
2 0. 254 0. 201 0. 457 101. 0
3 0. 258 0. 201 0. 456 98. 5 99. 1 1. 6
4 0. 261 0. 201 0. 456 97. 0
5 0. 257 0. 201 0. 460 101. 0
6 0. 259 0. 201 0. 458 99. 0
2. 3. 8　JM S脂质体的含量测定　精密量取重建后
JM S冻干脂质体 0. 5m l,以甲醇破乳定容至 10m l,按
2. 3. 1项色谱条件测定 JM S脂质体中 JMG的含量 ,
结果见表 5。
表 5　 JM S脂质体中 JMG的含量测定结果( n =3)
Tab5　Determ ination results of JMG in JM S liposom e( n =3)
批号 JMG (mg m l- 1) RSD (%)
060916 1. 974 0. 9
060917 2. 002 1. 1
060918 1. 983 0. 8
2. 4　 JM S脂质体包封率的测定
2. 4. 1　包封率的测定方法　以葡聚糖凝胶微型柱
离心法测定包封率 ,洗脱液为脂质体制备时的水合
介质 。
取 5m l注射器针筒 ,填过滤膜作衬片 ,装入适量
充分溶胀的 Sephadex G-50, 2 000 r /m in离心 3m in,
除去多余的水分 ,制得微型柱备用 。精确定量加入
0. 5m l JM S脂质体 , 500 r /m in离心 5m in,收集离心
液 ,加入 0. 5m l洗脱液 ,按上述操作重复数次 ,合并
洗脱后得到的脂质体溶液 ,用甲醇稀释定容于一定
浓度 ,按 2. 3. 1项色谱条件测定包封在脂质体中
JMG的含量 。
2. 4. 2　柱回收率试验　精密量取 JMG对照品储备
液 6份 , 加入空白脂质体中 ,得标准混合液 (其中
JMG的浓度为 1mg m l-1),移取 0. 5m l上柱 ,按 2. 4.
1项的方法进行操作 ,收集离心液 ,用甲醇稀释定容
至适当浓度 ,按 2. 3. 1项的色谱条件进样分析 ,计算
回收率 ,结果见表 6。
2. 5　包封率和载药量的计算
　　包封率(%)=n /m ×100%
86 　解放军药学学报　2007年 4月　第 23卷　第 2期　　　P harm J Ch in P LA　Vo l 23　 No2　Apr2007　　　　　
　　其中 n为被包封于脂质体中 JMG的含量 , m为
脂质体混悬液中 JMG的含量 ,测得 3个批号脂质体
的包封率分别为 52. 13%、51. 82%、53. 41%;载药
量分别为 12. 92%、12. 16%、12. 59%。
表 6　柱回收率结果(n =6)
Tab 6　The recovery o f JMG w ith
the addition of blank lipo som es( n =6)
样品量
(m g)
过柱前 JMS的
含量(mg)
过柱后 JMS的
含量(m g)
回收率
(%)
–x
(%)
RSD
(%)
0. 500 0. 498 0. 479 96. 2
0. 500 0. 503 0. 490 97. 5
0. 500 0. 502 0. 482 96. 1 96. 8 0. 8
0. 500 0. 496 0. 482 97. 2
0. 500 0. 505 0. 495 98. 1
0. 500 0. 497 0. 477 95. 9
2. 6　脂质体显微形态的观察　取 JMS脂质体溶液
适量 ,将其涂在有支持膜的铜网上 ,用磷钨酸进行负
染 ,自然晾干 ,用透射电镜观察其形态。 JM S脂质体
在透射电镜下基本圆整均匀 ,呈球状 ,属于胶体分散
系 。 JM S脂质体重建后的透射电镜照片见图 1。
图 1　 JM S脂质体的透射电镜照片(×300 000)
F ig 1　Transm ission electron m icroscopy of JMS liposom es(×300 000)
2. 7　脂质体粒径分布　取冻干前后脂质体溶液适
量 ,并稀释至适当浓度 ,以 NANOPHOX相关光谱仪
测定冻干前后脂质体的粒径大小和分布 ,见图 2。
测得冷冻干燥前 JM S脂质体的粒度分布范围:x10 =
90. 11nm , x50 =128. 17 nm , x90 =165. 19nm跨距 =0.
585 8;冷冻干燥之后 JM S脂质体的粒度分布范围:
x10 =71. 70nm , x50 =119. 12nm , x90 =166. 47nm 跨距
=0. 795 6。
3　讨论
3. 1　JM S系从蕨麻中提取的皂苷类活性部位 ,溶解
性较差 ,将其制成脂质体可以有效地解决其难溶性
问题 ,提高其生物利用度 。由于脂质体分散系的不
稳定性 ,如药物的渗漏 、粒子的聚集以及磷脂在液态
下的氧化 、水解等原因 ,采用薄膜超声分散法并冷冻
干燥制备 JMS冻干脂质体 ,临用前加分散介质 ,重
建后的脂质体均匀 、有乳光 ,且制备方法简单 ,重现
性好 。由于加入冻干保护剂 ,有效地防止在冷冻干
燥过程中药物的渗漏及粒子间的相互聚集 ,使 JM S
脂质体冻干前后粒径无显著变化 。
A冻干前　B冻干后
图 2　冻干前后 JM S脂质体的粒径分布图
F ig2　Size distribution of JM S
l ipo som e before and a fter lyophill iza tion
3. 2　本文采用葡聚糖凝胶微型柱测定包封率 ,由预
试验的结果表明 ,葡聚糖凝胶微型柱离心法可以将
脂质体和游离药物完全分开 。测定过程中加样时应
注意将样品完全滴加在凝胶柱上 ,若滴在柱壁上 ,导
致包封率的测定值不准确 。运用此方法测定包封
率 ,操作简单易行 ,使游离药物和脂质体分离比较完
全 ,缩短了脂质体的洗脱时间。有关 JM S脂质体的
稳定性及系统药效学研究将另文发表。
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(收稿日期:2006-11-26;修回日期:2006-12-14)
(本文编辑　梁爱君)
87 　解放军药学学报　2007年 4月　第 23卷　第 2期　　　P harm J Ch in P LA　Vo l 23　 No2　Apr2007