全 文 ：西北农业学报　2007 , 16(2):90 ～ 93
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
正交设计优选铁筷子甾体皂苷成分的超声提取工艺 *
杨　健 ,苗　芳 ,赵　伟 ,高　媛 ,周　乐*
(西北农林科技大学生命科学学院 ,陕西杨凌　712100)
摘　要:研究了超声提取铁筷子中甾体皂苷的最佳工艺。采用正交设计优化铁筷子总皂苷提取工艺 ,利用大
孔吸附树脂分离方法 ,以比色法检测铁筷子总皂苷的含量。影响铁筷子超声提取的的因素为乙醇浓度>提取
时间>提取温度>溶剂量 ,其最佳提取工艺参数为提取溶剂 50%乙醇 ,溶剂量 5 倍 ,提取温度 60 ℃, 提取时
间 30 min , 铁筷子总皂苷的得率达到 3. 163 %。
关键词:正交设计法;超声提取;铁筷子
中图分类号:Q946. 49　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2007)02-0090-04
Study on the Method for Ultrasonic Extraction of Steroid
Saponins from H. thibetanus by Orthogonal Test
YANG Jian , MIAO Fang , ZHAO Wei , GAO Yuan and ZHOU Le*
(College of Life S ciences , Northwest A &F University , Yanglin g S haanxi　712100 , China )
Abstract:The optimum procedure o f ex t ract ing steroid saponins from H. thibetanus by ul trasonic ex-
t ractinon technique w as studied. The or thogonal design was adopted to optimize the alcohol ext raction
pro cess. The macropo rous resin co lumn sepa rat ion w as used. The contents of saponins f rom H. thi-
betanus were de termined by colourme tric method. The orde r of the facto rs w hich affected ext raction
w as:concentration of e thanol>ex traction time>ex t raction temperature>dosage of solvent. The op-
timum condition of ult rasonic ex t ractinon technique w as as fo llow s:when the solid dissolved in ethano l
w hich the concentra tion w as 500 mL /L;the dosage of solvent w as 5;the ext raction temperature w as
60℃;the ex traction time w as 30 min. The yield of to tal saponins w as up to 31. 63 mg /g.
Key words:Orthogonal method;Ultrasonic ext ration;H. thibetanus
　　铁筷子(Helleborus thibetanus Franch.)为
毛茛科铁筷子属多年生草本植物 ,又名嚏根草 、小
桃儿七等[ 1] 。铁筷子属植物约有 20余种 ,主要分
布在欧洲东南部和亚洲西部 , 其中 Helleborus
Thibetanus Franch. 为我国西部特产种 ,主要分
布于秦岭和大巴山区。其根茎为主要药用部位 ,
具活血散瘀 、消肿止痛 、清热解毒之功效 ,民间主
用于治疗膀胱炎 、尿道炎 、疮疖肿毒及跌打损伤
等[ 2 , 3] 。国内外的研究表明 ,铁筷子属植物含有
甾体皂苷 、黄酮 、木质素 、多糖 、氨基酸等成
分[ 4 ～ 7] 。其中铁筷子甾体皂苷因具有增大心肌收
缩力和心搏出量 、减低心律 、消除水肿与呼吸道困
难的强心作用 ,促进糖元产生以抑制乳酸生成的
胰岛素作用 ,抑制肿瘤细胞的生长 ,促进白细胞增
多以及提高人体系统免疫力等多种生理功能而受
到人们的关注[ 8 ～ 11] 。目前 ,对该属植物的研究主
要集中在阐明一些新皂苷结构与生理功能上 ,而
有关超声提取铁筷子甾体皂苷类成分的研究尚未
见报道。本试验以铁筷子中主要活性成分甾体总
皂苷为质量控制指标 ,采用 L9(34)正交试验设计
考察溶剂浓度 、溶剂量 、提取温度和提取时间对超
声提取效果的影响 ,优选出了最佳提取方案 。
* 收稿日期:2006-11-22　　修回日期:2006-12-20
作者简介:杨　健(1981 -),男 ,山东东营人 ,在读硕士 ,主要从事天然产物化学研究。
*通讯作者:周　乐(1965- ),男 ,陕西蒲城人 ,教授 ,主要从事天然产物化学研究。 Emai l:bet terzl@163. com
1　材料与方法
1. 1　仪器与材料
铁筷子系 2005年 8月采自秦岭红河谷山区 ,
自然阴干 ,粉碎备用 。
弘祥隆 HF-500B超声循环提取机(北京弘祥
隆生物技术开发有限公司);SP-2100型紫外可见
分光光度计(上海光谱仪器厂);EB-280型电子天
平(上海物理光学仪器厂)。
薯蓣皂苷元对照品(中国药品生物制品检定
所);LSA-30 大孔吸附树脂(西安蓝晓科技有限
公司);乙醇 、甲醇 、香草醛 、高氯酸等试剂均为国
产分析纯 。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　标准曲线的制作　以薯蓣皂苷元为标样 ,
香草醛-高氯酸为显色剂 ,528 nm 为测定波长 ,参
照文献[ 13]进行 。
1. 2. 2　铁筷子总皂苷的提取　取经过石油醚脱
脂预处理的铁筷子干燥根茎粉末 20 g ,加入适量
乙醇 ,采取间歇式超声提取方法进行提取 ,超声功
率为 1 000 W 左右 ,超声间隔时间为 2 s ,超声频
率 20 kHz 。提取液过滤 ,收集滤渣加入乙醇相同
条件重复提取 1次 ,合并 2次提取液减压回收溶
剂 ,充分干燥得提取物干浸膏 。
1. 2. 3　铁筷子总皂苷含量测定　精确称量1. 2. 1
项下制取的干膏 2. 5 g ,加 40 mL 水溶解 ,上经过
预处理的 15 g(湿态)LSA-30大孔吸附树脂 ,流
速 2. 0 BV /h。先用去离子水洗至α-萘酚试验检
测不再出现紫色环为止;然后用 95%乙醇进行洗
脱 ,流速 1. 0 BV /h ,至洗脱液浓缩后 Liebe rmann
反应检测呈阴性为止。收集乙醇洗脱液 ,水浴蒸
干 ,残渣加适量甲醇溶解并定容于 250 mL 容量
瓶中 ,得样品溶液。于 528 nm 波长处进行比色
测定 ,并依下式计算铁筷子总皂苷提取量:
铁筷子总皂苷提取量(mg)=比色液中总皂苷含
量(mg /mL )×250×(提取物干浸膏总重/2. 5)。
2　结果与分析
2. 1　标准曲线的确立
以吸光度 A为纵坐标 ,标准品浓度 C为横坐
标 ,对各管测定结果进行线性回归 ,其线性方程为
A=32. 248C - 0. 0199(r= 0. 9979),表明薯蓣皂
苷元在 0. 0 030 ～ 0. 0 180 mg /mL 浓度范围内呈
良好线性关系。
2. 2　单因素对铁筷子总皂苷提取量的影响
2. 2. 1　乙醇浓度对总皂苷提取量的影响　由图
1可以看出 ,随着乙醇提取溶剂中含水量的增加 ,
总皂苷提取量呈明显的上升趋势;为获得较大的
提取量 ,应选择含水较多的醇 。但也应当看到 ,当
乙醇浓度降至 50%时 ,总皂苷提取量随乙醇提
取溶剂中含水量的增加变化不大 ,且溶剂极性过
大 ,会导致提取液黏度上升和色素干扰增大 ,给后
处理带来麻烦。因此 , 综合考虑 , 选择 95%、
70%、50%乙醇作为正交试验的因素水平 。
2. 2. 2　液料比对总皂苷提取量的影响　以 50%
乙醇作为提取溶剂(以下同),试验 5∶1 ～ 25∶1
五种物料比。由图 2可以看出 ,总皂苷提取量随
液料比的变化趋势不明显。因此 ,从节约溶剂用
量和能耗考虑 ,取液料比 5∶1 、10∶1 、15∶1 为
正交试验因素水平。
2. 2. 3　提取温度对总皂苷提取量的影响　从图
3可以看出 ,温度的升高有利于总皂苷提取量增
高 ,但增幅不明显。如果提取温度过高不仅铁筷
子皂苷的生物活性有可能会受到破坏 ,而且会带
来大量无谓的能源消耗。因此 ,综合考虑能效比 ,选
择 20℃、40℃、60℃作为正交试验的因素水平。
图 1　乙醇浓度对总皂苷提取量的影响
Fig. 1　 Effect of concentration of EtOH on
extraction of total saponins
图 2　液料比对总皂苷提取量的影响
Fig. 2　Effect of liquid to solid ratio on
extraction of total saponins
91 2 期　　　　　　　　　　杨　健等:正交设计优选铁筷子甾体皂苷成分的超声提取工艺
图 3　提取温度对总皂苷提取量的影响
Fig. 3　Effect of temperature on
extraction of total saponins
2. 2. 4　提取时间对总皂苷提取量的影响　由图
4可知 ,超声浸提时间越长 ,得率越高 。当时间超
过 30 min ,总皂苷提取量增幅明显变小 ,即再延
长浸提时间 ,提取量也不会再有较大增加 。综合
考虑能源消耗和提取成本 , 浸提时间不宜延长。
因此 ,取 10 min 、20 min 、30 min 作为正交试验的
因素水平 。
图 4　提取时间对总皂苷提取量的影响
Fig. 4　Effect of time on extraction
2. 3　正交试验
为了全面考察影响因素 ,根据单因素试验结
果 ,决定选取采用 4 因素 3 水平 ,即 L9(34)正交
表进行[ 6] 正交试验 ,试验因素见表 1 。按照表 2
条件进行超声提取 ,每个处理重复 3 次。分别采
用极差法和 F 检验法对表 2 的正交试验结果进
行差异分析和显著性检验 , F检验结果见表 3。
表 1　从铁筷子中提取皂苷的试验因素及水平设置
Table 1　Factors and levels in the extraction of saponins from H. thibetanus
水平
Levels
A (乙醇浓度) /%
Con cen t rat ion of EtOH
B(溶剂量) /倍
Dosage of solvent
C (提取温度) /℃
T emperatu re
D (提取时间) /min
Time
1 50 5 20 10
2 70 10 40 20
3 90 15 60 30
表 2　从铁筷子中提取皂苷的 L9(34)正交试验设计及结果
Table 2　Results of orthogonal test of L9(34) in the extraction of saponins from H. thibetanus
试验号
No.
A B C D
总皂苷提取量 /mg Ext ract ion of total saponins
X 1 X 2 X3
1 1 1 1 1 576. 6 605. 5 640. 3
2 1 2 2 2 643. 0 602. 8 638. 9
3 1 3 3 3 639. 4 602. 0 652. 4
4 2 1 2 3 556. 5 495. 2 523. 6
5 2 2 3 1 484. 1 537. 8 494. 5
6 2 3 1 2 500. 9 482. 1 515. 6
7 3 1 3 2 413. 6 395. 4 446. 2
8 3 2 1 3 434. 5 394. 3 399. 1
9 3 3 2 1 402. 5 378. 2 363. 9
K 1 5600. 9 4652. 9 4548. 9 4483. 4
K 2 4590. 3 4629. 0 4604. 6 4638. 5
K 3 3627. 7 4537. 0 4665. 4 4697. 0
R 657. 7 38. 6 38. 8 71. 2
表 3　影响铁筷子中皂苷提取的四因素方差分析结果
Table 3　Variance analysis of four factors which influenced saponins extraction
方差来源 S ou rse 离差平方和 SS 自由度 DF 方差 MS F P
A 216349. 2 2 108174. 6 169. 29 <0. 01
B 832. 2 2 416. 1 0. 65 >0. 05
C 754. 5 2 377. 3 0. 59 >0. 05
D 2707. 5 2 1353. 8 2. 12 >0. 05
E(误差) 11501. 6 18 639. 0
F 0. 05(2 , 18)=3. 55;F0. 01(2 , 18) =6. 01。
92 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
　　由表 2 中的 R 值可以看出 , 4 种因素对总皂
苷提取率的影响程度依次为 A >D>C>B ,其中
A 因素的影响远大于其他 3种因素 。从表 2还可
以看出 ,超声提取铁筷子甾体皂苷的最佳试验方
案为 A 1B1C3D3 ,即以 50%乙醇为溶剂 ,溶剂用量
5倍 ,提取温度 60℃,提取时间 30 m in。表 3的 F
检验结果表明 ,乙醇浓度(A 因素)对总皂苷提取
率具有十分显著的影响 ,而溶剂用量(B 因素)、提
取温度(C 因素)和提取时间(D 因素)在所考察的
范围内则影响不显著 。
2. 3　最佳工艺检验结果
按优选的最佳工艺条件 ,重复 3 次提取铁筷
子样品 ,测定铁筷子样品中总皂苷的提取率达到
3. 163%, RSD 2. 28%。
3　讨论
传统的萃取提取过程 ,能量首先无规则地传
递给萃取剂 ,然后萃取剂扩散进入基体物质 ,再从
基体溶解或夹带多种成分扩散出来 ,遵循加热-渗
透-溶解-渗透出的模式 ,萃取的选择性和效率都很
差。而超声提取主要通过空化细胞破碎作用促进
固相物质向液相传递 ,大大提高了提取效率;其有
别于常规的传质作用 ,故溶剂用量和温度在超声
提取中作用不显著。因超声提取的效率很高 ,短
时间即可实现比较完全的提取 ,故本试验在进行
因素设置的时候 ,并未考虑提取次数的影响 。为
考察最佳工艺的合理性 ,在重复验证试验中 ,增加
一组提取 3 次的比较试验 。结果发现其与提取 2
次相比 ,提取率略有提高 ,但无统计学意义。从节
省乙醇消耗 、缩短工时和提高效率考虑 ,选用提取
2次 ,每次 30 min。
大孔吸附树脂为一种有机高聚吸附剂 ,具有
选择性吸附有机化合物的能力[ 14 , 15] 。本试验所采
用的 LSA-30型树脂是一种非极性树脂 ,对甾体
皂苷类成分的吸附选择性强 ,解吸率高 ,应用于甾
体皂苷类成分的富集纯化有较好的效果;相对传
统的正丁醇萃取法具有纯化效果好 ,操作简便等
优点 。
目前国内尚无铁筷子皂苷类成分的标准对照
品 ,故笔者选择了结构与铁筷子皂苷类成分接近
的薯蓣皂苷元为对照品 ,虽然测量结果会有一定
出入 ,但由于它们的基本骨架结构和显色原理一
致 ,故在暂无标准品的情况下 ,仍不失为一种较佳
的选择 。
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