全 文 ：收稿日期:2009-05-25;　修订日期:2009-09-18
基金项目:广西自然科学基金(No.0832271);
教育部春晖计划(No.Z2005-2-45003)
作者简介:段小群(1972-),男(汉族),湖南安仁人 ,现任桂林医学院副教
授 ,博士学位 ,主要从事药理学研究工作.
雪灵芝提取物对体外诱导肝细胞脂肪变性的影响
段小群1 ,刘永明 1 ,卢　曦1 ,龚受基 1 ,陈　薇 2
(1.桂林医学院 ,广西 桂林　541004;　2.桂林医学院附属医院 ,广西 桂林　541001)
摘要:目的 探讨雪灵芝提取物对体外诱导肝细胞脂肪变性的影响。方法 以人肝 L-02细胞作为研究对象 , 用四环素建
立肝细胞脂肪变性模型 。将实验分为诱导组 ,继续诱导组 、脱离诱导组 , 用油红 O染色观察细胞形态和细胞内脂滴的形
成情况 , 并测定细胞内甘油三酯(TG)含量的变化。结果 雪灵芝提取物(20 ～ 60 μg· ml-1)可明显降低细胞内 TG值 , 并
呈剂量依赖性。结论 雪灵芝提取物通过减少细胞内 TG的生成从而阻止肝细胞脂肪变性。
关键词:雪灵芝;　四环素;　甘油三酯
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)03-0554-02
EffectsofArenariakansuensisExtracts(AKS)onHepatocyteSteatosisInducedbyTetra-
cyclineinvitro
DUANXiao-qun1 , LIUYong-ming1 ,LUXi1 ,GONGShou-ji1 ,CHENWei2
(1.DepartmentofPharmacology, GuilinMedicalColege, Guilin541004, China;2.TheAfiliatedHospitalof
GuilinMedicalColege, Guilin541001 , China)
Abstract:ObjectiveTostudytheefectsofArenariakansuensisextracts(AKS)onhepatocytesteatosisinducedbytetracycline
invitro.MethodsSteatosismodelofhepatocytesestablishedbyaddingtetracyclinetothegrowingL-02 celstrain.Lipiddrop-
letsinthehepatocyteswereobservedbyoilredstainingandthecontentoftriglyceride(TG)inhepatocyteswasmeasuredwithan-
alyzedkit.ResultsAKS(20 ～ 60μg· ml-1 )concentrationdependentlydecreasedthelevelofTG inhepatocytes.
ConclusionAKScanpreventhepatocytefattydegenerationviainhibitingTGproduction.
Keywords:Arenariakansuensis(AKS);　Tetracycline;　TG
　　非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliverdisease, NAFLD)
是一种无过量饮酒史(每周饮酒折合酒精量小于 40 g)、以肝实
质细胞脂肪变性和脂肪储积为特征的临床病理综合征 [ 1] 。随着
人民物质生活水平的提高 ,生活方式和饮食结构发生了显著的改
变 , 再加上科学技术的飞跃发展 , 发现和被检测到的 NAFLD患者
逐年升高。由于 NAFLD是肝硬化 、肝癌的重要病因 [ 2 , 3] , 所以对
其进行深入地研究具有十分重要的意义。
雪灵芝(Arenariakansuensis, AKS)系石竹科蚤缀属多年生草
本植物 , 藏药名为阿仲嘎保 ,分布于西藏 、青海 、四川 、甘肃 , 是一
种极为宝贵的藏药资源 ,有悠久的药用历史 [ 4] 。以全草入药 ,性
味甘寒 , 有清热解毒 、利胆退黄 、通淋止痛的作用 , 主治流感 、黄
疸 、肺炎 、筋骨疼痛 、淋病等 ,还具有抗缺氧功效 [ 5]和对酒精性肝
损伤有保护作用 [ 6] 。本实验研究了雪灵芝提取物对四环素诱导
的脂变细胞的影响 , 为进一步开发雪灵芝保健产品提供理论依
据。
1　材料与仪器
1.1　仪器 CO2培养箱(美国 FormascientificInc公司),倒置显微
镜(日本 Olympus公司), 酶联免疫检测仪 Model-450(美国 Bio
-Rad公司), 旋转蒸发器(RE-52型 , 上海亚荣仪器厂生产)。
1.2　试剂 雪灵芝 , 由西藏阿仲嘎保生物制品有限公司提供;
1640培养液购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司;血
清购自海克隆生物化学制品(北京)有限公司;四环素(实验室
用)购自生工生物工程(上海)有限公司;油红 O购自美国 Sinma
公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒购自美国 Amersco公司;甘
油三酯(TG)测定试剂盒购自浙江东欧生物工程有限公司。
2　方法
2.1　肝细胞培养 人正常肝细胞株 L-02, 购自中国科学院上海
生命科学研究所 ,用含 10%胎牛血清 1640培养基传代培养。
2.2　雪灵芝提取物的制备 将 KAS全草粉碎 , 以 6倍量的 95%
乙醇加热回流提取 3次 , 1 h/次 ,合并提取液 ,浓缩干燥得 AKS乙
醇提取物。 残渣挥干乙醇 , 用 6倍量的蒸馏水加热回流提取 3
次 , 1h/次 , 合并提取液 ,浓缩干燥得 AKS水提取物。
2.3　四环素浓度的确定 将处于对数生长期的 L-02细胞调整
浓度为 5×104个 /ml培养于 96孔板中 , 分别加入不同浓度的四
环素(见表 1), 用 MTT[ 7]比色法测定细胞增殖情况(以吸收度
OD值表示)。结合细胞形态观察 , 选择对细胞活性影响小 ,不会
导致细胞裂解死亡的浓度作为诱导细胞形成脂肪变性的最佳浓
度。
2.4　雪灵芝提取物浓度的确定 将处于对数生长期的 L-02细
胞调整浓度为 5×104个 /ml培养于 96孔板中 , 分别加入不同浓
度的雪灵芝提取物(见表 2), 用 MTT比色法测定细胞增殖情况
(以吸收度 OD值表示)。结合细胞形态观察 ,将对细胞活性影响
小 , 不会导致细胞裂解死亡的浓度定为最高给药浓度。
2.5　肝细胞脂变模型的建立 将处于对数生长期的 L-02细胞
分为两组 , 即:对照组 、诱导组 , 使每组细胞浓度均为 5 ×104个 /
ml。对照组:用正常培养基培养;诱导组:每毫升正常培养基中加
四环素 12μg培养。在各实验条件下培养 48h, 收集细胞冻融液 ,
严格按照 TG试剂盒规定操作 , 测定其中 TG的含量。制备油红
O染色 [ 8]标本 ,观察细胞脂滴数的变化。
2.6　雪灵芝提取物对肝细胞脂变模型的影响 将处于对数生长
期的 L-02细胞分为 3组 , 使每组细胞浓度均为 5×104个 /ml。
诱导组:损伤同时加药治疗 48 h;继续诱导组:先损伤 48 h,再在
损伤的同时加药治疗 48h;脱离诱导组:先损伤 48 h, 再加药治疗
48h。每组内均设有空白对照 、模型 、阳性对照及高 、中 、低 3个剂
量组 , 在各实验条件下收集细胞冻融液 , 严格按照 TG试剂盒规
定操作 ,测定其中 TG的含量。 用 100μg· ml-1烟酸作为阳性对
照药。
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 3期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.3
2.7　数据处理 所有数据均以 x±s表示 , 采用方差分析进行统
计处理。
3　结果
3.1　四环素作用浓度的确定 观察细胞形态发现 , 正常肝细胞为
多边形 , 胞膜完整界限清楚 , 细胞浆丰富。四环素 15 μg· ml-1组
细胞数量与正常细胞相比基本不变 ,低倍镜下可见部分细胞形态
有少许变化 , 但漂浮坏死细胞较少。 30 μg· ml-1组细胞增大变
圆 , 数量有减少。 120 μg· ml-1组细胞多呈圆形或椭圆形 , 数量
大大减少 , 细胞膜不完整 ,有破损(图 1 ～ 3)。 MTT实验检测结果
提示:四环素浓度超过 30 μg· ml-1时吸收度(OD值)下降明显 ,
对细胞增殖影响力较大(表 1), 再根据相关文献 [ 9]报道 , 选择
12 μg· ml-1作为四环素造模剂量。
图 1　正常细胞(100×)
图 2　15μg· ml-1组(100×)　　　　图 3　 30μg· ml-1组(100×)
表 1　MTT法检测四环素对肝细胞生长活性的影响( x±s)
组别 剂量 C/μg· ml-1 OD值 细胞活性变化(%)
空白对照 - 1.098±0.068 100.0
四环素 7.5 0.990±0.023 90.2
15 0.963±0.016 87.7
30 0.820±0.034 74.7
60 0.763±0.037 69.5
120 0.602±0.058 54.8
　　n=5
3.2　雪灵芝提取物的浓度确定 MTT检测结果提示(表 2), 当
AKS醇提物浓度超过 80 μg· ml-1时 ,吸光度(OD值)下降明显 ,
对细胞增殖影响较大 , AKS水提物出现了浓度越高 , 细胞增殖能
力及活性越强的特点。再结合预试结果 ,将雪灵芝提取物的实验
浓度定为 20, 40, 60 μg· ml-1。
表 2　MTT法检测雪灵芝提取物对肝细胞生长活性的影响( x±s)
组别 剂量 C/μg· ml-1 OD值 细胞活性变化(%)
空白对照 - 1.098±0.068 100
AKS醇提物 20 1.085±0.043 98.8
40 1.046±0.031 95.3
80 0.977±0.033 89.0
160 0.846±0.059 77.0
320 0.548±0.047 49.9
AKS水提物 20 1.102±0.033 100.4
40 1.139±0.012 103.7
80 1.165±0.016 106.1
160 1.742±0.188 158.7
320 2.654±0.176 241.7
　　n=5
3.3　油红 O染色光学显微镜观察 正常 L-02细胞 , 细胞内仅
可见点状散在红色脂肪滴(图 4), 经 12 μg· ml-1四环素离体诱
导 48h后 , 细胞内出现大量聚集成颗粒状的红色脂肪滴(图 5)。
而正常 L-02细胞经 60 μg· ml-1雪灵芝提取物与 12 μg· ml-1
四环素共同培养 48 h后 ,细胞内脂滴与模型细胞相比有所减少
见图 6 ～ 7。
　图 4　正常细胞(100×)　　　　　图 5　模型细胞(100×)
　图 6　AKS水提物(100×)　　　　　图 7　AKS醇提物(100×)
3.4　肝细胞内 TG含量的测定 实验结果表明(见表 2), 各组加
四环素的模型细胞比不加任何药物的正常对照细胞胞浆内的 TG
值明显升高 , 加入烟酸的阳性对照细胞与模型细胞相比细胞内
TG含量明显降低。
各组给予雪灵芝提取物处理后 , 细胞内 TG值均出现了明显
的降低。继续诱导组细胞内 TG值与模型细胞相比 , 差异明显(P
<0.05), 脱离诱导组细胞内 TG值降低最为明显 ,说明只要停止
向培养液中加造模药 ,细胞内累积的甘油三酯可以自行降低 , 这
与治疗脂肪肝首要在于去除病因的理论是一致的。 AKS醇提物
在 3组实验中均表现出较好的降脂作用(高剂量与模型组比较 ,
P<0.01),且各剂量之间存在着一定的量效关系。 AKS水提物
在 3组实验中 , 中剂量(40 μg· ml-1)的降脂作用强于高 、低剂量
组(P<0.01)。
表 3　AKS对脂变细胞 TG含量的影响( x±s)
组别 剂量C/μg· ml-1
TG/mmol· L-1
脱离诱导组 同步组 继续诱导组
正常 - 2.27±0.56■ 2.66±0.23■■ 2.37±0.33■
模型 - 2.96±0.40 3.61±0.22 2.79±0.20
烟酸 100 2.51±0.27■ 2.65±0.33■■ 2.45±0.43
AKS醇提物 20 3.33±0.35 3.32±0.18 2.94±0.19
40 2.62±0.35 2.90±0.19■■ 2.53±0.22
60 1.98±0.26■■ 2.60±0.22■■ 2.23±0.40■■AKS水提物 20 3.23±0.28 3.44±0.19 3.00±0.13
40 2.11±0.62■■ 2.66±0.36■■ 2.16±0.28■■
60 2.78±0.30 3.16±0.20■ 2.52±0.36
　　与模型组比较 , ■P<0.05, ■■P<0.01;n=5
4　讨论
本实验采用四环素制备肝细胞脂变模型 ,四环素属于抗生素
类化学药物 ,该药脂溶性较好 , 具有肝毒性 ,能很好地渗透到大多
数组织和体液中 ,且较易进入细胞内 [ 10] 。四环素引起脂肪肝的
机制是抑制体内蛋白质的合成 , 特别是肝的载脂蛋白的合成 , 使
肝内 VLDL分泌发生障碍 , 从而不能使肝内 TG运出肝细胞外 , 脂
质以脂滴的形式聚于细胞内置网和高尔基复合体内。脂质及 TG
含量增加 ,肝脏脂质过氧化反应也增强 , 肝组织学检查显示 ,肝细
胞产生明显的小泡性脂肪变性 ,符合非酒精性脂肪肝病理学研究
结果 [ 11] 。其抑制蛋白质作用机制可能通过抑制肝细胞线粒体
DNA复制或干扰 DNA转录 , 使 mRNA合成减少 , 从而使 mRNA
翻译成载脂蛋白的量减少。 通过抑制肝内 TG的转运及肝细胞
线粒体对脂肪酸的 β -氧化 , 从而诱发肝细胞脂肪变性。
本实验将雪灵芝提取物作用于离体细胞模型 , 共分为 3组:
诱导组 ,损伤同时加药治疗 2 d;继续诱导组 ,先损伤 2d再在损伤
同时加药治疗 2 d;脱离诱导组 , 先损伤 2d再加药治疗 2d。诱导
组可以考察药物对脂肪肝的预防与减轻作用 ,继续诱导组和脱离
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.3 时珍国医国药 2010年第 21卷第 3期
诱导组可以考察有化学损伤因素存在或曾经服用肝毒性药物造
成肝损害后 , 药物对肝细胞的治疗与保护作用。由脱离诱导组实
验结果可知 , 一些高脂血症的患者不用马上服用降脂药 , 首先应
该停止使用或接触具有肝毒性的化学物质 ,通过中药保健品或单
纯饮食疗法即可获得痊愈。
目前对 NAFLD的治疗临床上多采用西药治疗 , 主要分为:
HMG-COA还原酶抑制剂 、胆汁酸螯合剂 、苯氧芳酸类 、烟酸类
等。西药对于高脂血症患者具有起效快 、作用强的特点 , 但这些
药物对人体均有不同程度的毒副作用 ,长期服用经常会出现不良
反应 , 而采用传统中药治疗脂肪肝 ,能有效防止并发症 ,减少由药
物引起的不良反应 , 研究和开发降脂中药有良好的前景和重要的
意义。
雪灵芝中已经阐明结构的 19种化合物大部分是脂溶性较高
的 [ 12] 。其中三萜皂苷 、环肽 、生物碱(β -咔波啉)、阿魏酸被认为
是雪灵芝中重要的活性成分。近年来, 三萜皂苷 、环肽类化合物在
抗肿瘤 、免疫调节 、抗病毒 、抗菌等方面的作用 ,已引起了广泛的关
注 [ 13] 。本实验对雪灵芝醇提和水提物进行了研究 ,认为雪灵芝醇
提物具有明显的降低脂变肝细胞内甘油三酯的作用 , 进一步研究
雪灵芝中的有效成分 ,可以开发出新的有价值的降脂药物。
参考文献:
[ 1] 　范建高.酒精性和非酒精性脂肪肝性肝病 [ J] .中华肝脏病杂志 ,
2003, 11(11):692.
[ 2] 　FarelGC, LarterCZ.Non-alcoholicfatyliverdisease:fromsteatosis
tocirrhosis[J] .Hepatology, 2006, 43(2):S99.
[ 3 ] 　HaiS, KuboS, ShutoT, etal.Hepatocelularcarcinomaarisingfromnon
-alcoholicsteatohepatitis:reportoftwocases[ J].SurgToday, 2006,
36(4):390.
[ 4 ] 　李　明 ,伍贤学 ,成　丽.藏药雪灵芝研究进展 [ J] .中草药 , 2007,
38(11):附 1.
[ 5 ] 　张　丽 , 黎　霞 ,黄叶梅.雪灵芝对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护
作用 [ J] .四川师范大学学报(自然科学版), 2007, 30(3):395.
[ 6 ] 　赵　鹏 ,李　彬 ,姚思宇 ,等.雪灵芝对酒精性肝损伤保护作用的实
验研究 [ J] .中华中西医杂志 , 2004, 17(4):1901.
[ 7 ] 　马金霞.MTT比色法用于肿瘤细胞体外药物敏感性试验的检测
[ J] .临床检验杂志 , 2002, 20(2):104.
[ 8 ] 　杜卓民.实用组织学技术 [ M] .第 2版.北京:人民卫生出版社 ,
1998:318.
[ 9 ] 　苏宝亮 , 陈　真 , 徐厚明 , 等.肝细胞脂肪变性模型形态的研究
[ J] .中国医科大学学报 , 2004, 35(4):365.
[ 10]　戴自英.实用抗菌药物学(第 2版)[ M] .上海:上海科技出版社 ,
1998:199.
[ 11]　王崇国.传染病辨病专方治疗 [ M] .北京:人民卫生出版社 , 2000:
133.
[ 12]　雷　宁 ,张文山 ,杜树山.蚤缀属植物的种群分布 、化学及药理研
究进展 [ J] .中国中医药信息杂志 , 2004, 11(10):929.
[ 13]　JiaAQ, TanNH, ZhaoYX, etal.TwonewcyclopeptidesfromAre-
nariaoreophila(Caryophylaceae)[ J] .Helvchimacta, 2003, 86(3):
756.
收稿日期:2009-07-06;　修订日期:2009-10-15
基金项目:科技部国际合作项目(No.2006DFA33530);国家自然科学基金项目(No.30870986);贵州省科技厅项目(No.J-[ 2007] 2092, 2087)
作者简介:闫秀明(1982-),女(汉族),河南许昌人 ,贵阳医学院在读硕士研究生 ,主要从事阿尔茨海默氏病的中药治疗机制研究工作.
＊通讯作者简介:官志忠(1951-),男(汉族),贵州贵阳人 ,现任贵阳医学院教授 ,博士学位 ,主要从事老年性痴呆发病机制及地方病研究工作.
灯盏细辛活性部位
对神经细胞 α3尼古丁受体蛋白水平的影响
闫秀明 ,邓　婕 ,齐晓岚 ,黄　勇 ,王永林 ,官志忠＊
(贵阳医学院 ,贵州 贵阳　550004)
摘要:目的 研究灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物不同活性部位对神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中尼古丁乙酰胆碱能
受体 (Nicotinicacetylcholinereceptor, nAChR)蛋白水平的影响及其对抗 β -淀粉样蛋白(Aβ)细胞毒性的作用机制 , 以
探讨其在阿尔茨海默氏病(Alzheimersdisease, AD)治疗中的作用。方法 选用一定浓度的灯盏细辛不同部位及 Aβ25 ～ 35
处理 SH-SY5Y细胞 , 用比色法测定培养细胞 MTT还原率 , 蛋白质印迹法测定尼古丁受体 α3亚单位蛋白水平。结果 灯
盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物不同部位中 ,经凝胶柱分离的第一区段 、该区段经反相硅胶柱分离的低极性部位及乙酸乙
酯萃取后再以正丁醇获得的萃取物 ,经凝胶柱分离的第四区段经反相硅胶柱分离出的低极性部位能上调 SH-SY5Y细
胞中 α3nAChR蛋白水平;同时能减弱 Aβ 25 ～ 35的细胞毒性作用。结论 灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物分离部位可能是
中药灯盏细辛的重要的活性部位 ,在阿尔茨海默氏病的治疗中可能起到一定作用。
关键词:灯盏细辛;　神经母细胞瘤细胞;　α3尼古丁受体;　β -淀粉样蛋白;　阿尔茨海默病
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)03-0556-03
InfluenceoftheActivePartsExtractedfromHerbaErigerontisontheProteinLevelofα3
NicitinicReceptorSubunitinHumanNeuroblastomaSH-SY5YCells
YANXiu-ming, DENGJie,QIXiao-lan,HUANGYong,WANGYong-lin,GUANZhi-zhong＊
(DepartmentofMolecularBiology, GuiyangMedicalUniversity, Guiyang550004, China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheefectoftheactivepartsextractedfromHerbaErigerontisontheproteinlevelofα3 nic-
itinicreceptorsubunitinhumanneuroblastoma(SH-SY5Y)cellsandagainsttheneurotoxicityinSH-SY5Ycelsinducedby
beta-amyloidpeptide(A).MethodsTheSH-SY5Ycellsweretreatedbyacertainsafeconcentrationoftheactivepartsex-
tractedfromHerbaErigeronitis, andexposedtoAβ25 ～35.MTTreductionwasdetectedbyphotomatricassay, andtheproteinlevelofα3 nAChRsubunitwasdetectedbyWestern-blotting.ResultsTheactivepartsextractedfromHerbaErigerontisstimulated
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 3期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.3