全 文 ：收稿日期:2001-05-23　　修订日期:2001-08-10
基金项目:湖南省自然科学基金 、 湖南省重点科技攻关计划 、 湖南农业大学青年科学基金资助项目内容之一
作者简介:黎星辉 (1962-), 男 , 湖南常德人 , 湖南农业大学茶叶研究所研究员 , 湖南省茶叶科技攻关协作项目首席专家 , 主要从事茶树遗传育种研
究。
文章编号:1000-369X (2001)02-0099-04
云南大叶茶与汝城白毛茶杂交后代
的 RAPD亲子鉴定
黎星辉1 , 施兆鹏1 , 刘春林2 , 罗军武1 , 沈程文1 , 龚志华1
(1.湖南农业大学 , 湖南长沙　410128;2.作物基因工程湖南省重点实验室 , 湖南 长沙　410128)
摘要:应用随机扩增多态性 DNA (RAPD)分子标记技术 , 对云南大叶茶 (C.sinensis)与汝城白毛茶 (C.
ptilophylla)进行人工杂交所获得的 F1 代植株进行了亲子鉴定。结果表明 , 13 个随机引物在第 1个杂交后代
(1F1)中共扩增出 80 条 RAPD谱带 , 其中 79 条能在双亲中检出 , 另 1 条为 1F1 自身的特异带 , 卡平方检验
表明在 1F1中扩增出的谱带数与亲本中各对应位点所显示的谱带数之间没有显著差异;在第 2 个杂交后代
(2F1)中共扩增出 75 条谱带 , 在第 3个杂交后代 (3F1)中共扩增出 77 条谱带 , 均能在双亲中检出;结果
说明这 3个供试杂交后代确来源于供试亲本云南大叶茶和汝城白毛茶。
关键词:汝城白毛茶;RADP;亲子鉴定
中图分类号:S571.1;Q523　　　　文献标示码:A
Parentage Identification of Filial Generation Tea
Plants from “Yunnan Daye” and “Rucheng Baimao” with RAPD Method
LI Xing_hui1 , SHI Zhao_peng1 , LIU Chun_lin2 , LUO Jun_wu1 , SHEN Cheng_wen1 , GONG Zhi_hua1
(1.Hunan Agricultural University , Changsha 410128 , China;
2.Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province , Changsha 410128 , China)
Abstract:Parentage identification of filial generation tea plants , which derived from “ Yunnan Daye Cha” (C.sinensis)
and“ Rucheng Baimao Cha” (C.ptilophylla)by artificial_made hybrid method , was carried out with RAPD method.There
were 80 bands in which 79 bands are same as their male parent or female parent and 1 band do not appear in their parents
in 1F1 from 13 primers.There were not significant difference on amount of bands between 1F1 and their parents in the same
position byχ2 test.Therewere 75 bands in 2F1 and 77 bands in 3F1 from 13 primers , and all of the bands had the parallel
bands in their male parent or female parent or both.The results showed that the 3 hybrid descendants were really derived
from “ Yunnan Daye” and “Rucheng Baimao”.
Key words:“ Rucheng Baimao Cha” (Camellia ptilophylla);RADP;Parentage identification
　　汝城白毛茶是在湖南省汝城县九龙江一带原
始次生林中发现的野生茶叶资源[ 1-2] , 闵天禄[ 3]
在张宏达系统分类[ 4 , 5]的基础上 , 将汝城白毛茶
归于毛叶茶种 (C.ptilophylla)。对汝城白毛茶
的研究表明 , 它属二倍体 , 2n=30。其叶大 , 茸
毫厚密 , 生长势强 , 持嫩性好 。主要化学品质成
份与茶 C .sinensis 相似 , 茶多酚含量高 , 与不含
咖啡碱的毛叶茶模式种显著不同的是它咖啡碱正
常 , 而茶叶碱和可可碱含量则介于茶种和毛叶茶
种之间 , 游离氨基酸含量适中 , 制成红碎茶有自
然花香 , 滋味浓强 , 化学鉴评得分高达 111.06 ,
开发的产品体现优异的茶叶特征[ 6-9] 。与已发现
的茶多酚含量>34%的其他茶叶资源[ 10] 相比 ,
它所处纬度最高 , 其抗寒性最好 , 所制红茶浓强
度优异 , 汝城白毛茶抗菌性强 , 降血脂功能
好[ 11-12] , 属湖南省的特异茶树资源 , 初步具备
红茶优异亲本种质条件 , 加强对它的研究和在育
种上的合理利用 , 将有利于茶树育种从品种内或
茶　叶　科　学　2001 , 21 (2):99-102
Journal of Tea Science
DOI :10.13305/j.cnki.jts.2001.02.005
品种间优势的利用提高到植物分类学意义上的种
间优势的利用 , 而这类种间优势的利用终将成为
获得高产 、 优质 、高抗茶树品种的可靠 、 经济 、
便捷和实际的途径 , 有望为红碎茶三 、 四套样地
区优异红茶品种的选育提供种质和技术支持 。
鉴于汝城白毛茶种质的特异性 , 作者利用云
南大叶茶 (C .sinensis)与汝城白毛茶 (C .
ptilophylla)进行人工杂交获得了 F1 代植株[ 13] 。
为了确证 F1 的种质来源 , 以便进一步深入研究 ,
特在F1 中选择杂交优势较强 、 抗寒性好 、形态
上有与父母本相似之处的单株 , 应用随机扩增多
态性 DNA (RAPD)分子标记技术来进行亲子鉴
定。
1　材料和方法
1.1　试验材料
以杂交试验的汝城白毛茶 (♂)、 云南大叶
茶 (♀)、 F1 代单株 (云南大叶茶 ×汝城白毛
茶)一芽三叶的叶片来提取基因组 DNA。
主要化学试剂:10×PCR buffer (w/mg)为
上海瑞真生物技术有限公司出品;dNTP Mix , Taq
DNA Polymerase , 和 Random Primer S1 ～ S120均为
Sangon公司所产;PGEM_7ZF (+)/Hae Ⅲ mark-
ers和 Lambda DNA/EcoR I+Hind Ⅲmarkers为MBI
公司产品 , QIAquick spin kit 购自德国 QIAGEN
Company.
1.2　试验方法
1.2.1　基因组 DNA提取 、 纯化与检验
基因 组 DNA 粗 提:称 0.5g 样品 , 加
0.3gPVP , 加液氮 , 磨碎后加 4 ml DNA提取缓冲
液 (0.1mol/L Tris_HCl , pH8.0 , 0.1 mol/L EDTA ,
pH8.0 , 0.25 mol/L NaCl , 1%SDS), 搅匀后 , 取
0.5 ml提取液转入 1.5 ml灭菌离心管 , 加入等体
积饱和酚︰氯仿 ︰异戊醇 (25∶24∶1), 摇匀 , 离
心 (13 000 r/min , 4℃, 5 min), 上清液再经氯∶
异戊醇 (24∶1)抽提后 , 离心 (13000 r/min ,
4℃, 5 min), 收集上清液 , 加入3 mol/LNaAC 至
终浓度为 0.3 mol/L , 摇匀 , 再加 2 倍体积冷无
水乙醇 , 温和倒转数次 , 将絮状 DNA 挑出 , 转
入新的试管 , 在超净工作台上吹干 , 然后加入
400 μlTE (10 mmol /LTris_HCl , pH8.0 , 1 mmol/
LEDTA , pH8.0)溶解 , 即得 DNA粗提液。
基因组 DNA纯化:在 DNA 粗提液中 , 加入
无DNA酶活性的 RNase 酶至终浓度为 10 ug/ml ,
37℃保温 30 ～ 60 min , 再加入等体积饱和酚∶氯∶
异戊醇 (25∶24∶1)抽提 , 离心 (13 000 r/min ,
4℃, 5 min), 上清液再经氯仿︰异戊醇 (24∶1)
抽提后 , 离心 (13 000 r/min , 4℃, 5 min), 收
集上清液 , 加入 3 mol/LNaAC 至终浓 度为
0.3 mol/L , 摇匀 , 加2倍体积冷无水乙醇 , 温和
倒转数次 , 将絮状 DNA 挑出 , 转入新的试管 ,
用 70%乙醇洗涤三次后 , 在超净工作台上吹干 ,
然后 , 用 QIAquick spin kit 纯化 (按说明书操
作), -20 ℃保存。
基因组 DNA 检验:取 20 μl 纯化的 DNA 以
灭菌超纯水稀释 100倍 , 在 Beckman DU_640紫外
分光光度计上读取 260nm和 280nm的 OD值 , 以
确定 DNA纯度和浓度。在1×TAE缓冲液中 , 取
10μlDNA纯品在 1.0%琼脂糖凝胶上电泳 (电压
2 ～ 5v/cm , 终浓度为 0.6 μg/ml 的溴化乙锭染
色), 然后在 Gel DOC—1000 凝胶分析系统中观
察检验 DNA片段大小 。将纯化的 DNA配制成浓
度为 20 ng/μl的模板 DNA。
1.2.2　RAPD_PCR分析
PCR反应液总体积 30μl , 反应体系为:10×
Taq Buffer (含 Mg2+), 各 0.2 mmol/L 的 dNTPs ,
0.15 μmol/L 引物 , 1.5 U Taq DNA聚合酶 , 40 ng
模板 DNA , 加 22 μl矿物油 , 以防止水分蒸发。
RAPD_PCR扩增在 PTC—100TM 型热循仪上
进行 , 程序如下:94℃预变性 180 s;92℃变性
50 s;35℃退火 50 s;72℃延伸 100 s , 40个循
环;72℃后延伸 5 min;4℃冷却20 min 。
1.2.3　电泳和检测
在1×TAE 缓冲液中 , 用 1.9%琼脂糖凝胶
电泳检测 PCR产物 , 琼脂糖凝胶中溴化乙锭终
浓度为 0.6 μg/ml , 120伏进样 , 80伏分离 , 然后
在Gel Doc 1000 凝胶分析系统中采集和处理信
息。
2　结果和讨论
从Sangon公司 100 个 10碱基的随机引物中
筛选出 13 个 (S4 、 S8 、 S18 、 S24 、 S25 、 S45 、
S55 、 S67 、 S72 、 S73 、 S82 、 S83 、 S89), 对杂交
母本云南大叶茶 (♀)、 杂交父本汝城白毛茶
(♂)以及3个 F1 代单株 (1F1 , 2F1 , 3F1)进行
扩增 , 各引物的扩增结果如表 1所示 。第 1株杂
交后代 (1F1)共扩增出 80条 RAPD谱带 , 其中
在双亲扩增位点中均可检出的谱带有 54 条 , 占
谱带总数的 67.50%, 单独在母本扩增位点检出
的谱带有 7条 , 占谱带总数的 8.75%, 单独在父
100 茶　叶　科　学 21卷
本扩增位点检出的谱带有 18条 , 占谱带总数的
22.50%, 另出现的 1条为1F1自身的特异带 , 卡
平方检验表明在 1F1中扩增出的谱带数与亲本中
各对应位点所显示的谱带数之间没有显著差异 。
第2株杂交后代 (2F1)共扩增出 75条谱带 , 其
中在双亲扩增位点中均可检出的谱带有 53条 ,
占谱带总数的 70.67%, 单独在母本扩增位点检
出的谱带有 9条 , 占谱带总数的 12.00%, 单独
在父本扩增位点检出的谱带有 13条 , 占谱带总
数的 17.33%。第 3株杂交后代 (3F1)共扩增出
77条谱带 , 其中在双亲扩增位点中均可检出的
谱带有 51条 , 占谱带总数的 66.23%, 单独在母
本扩增位点检出的谱带有 7 条 , 占谱带总数的
9.09%, 单独在父本扩增位点检出的谱带有 19
条 , 占谱带总数的 24.68%。结果说明这三株 F1
子代材料在遗传基础上来源于云南大叶茶和汝城
白毛茶。图版 1 列出了 S18 、 S24 、 S55 、 S73 、
S83 、 S89六个引物的扩增图谱。
表 1　杂交 F1 代 PCR扩增带数与来源
Table1 Amount of bands of F1 and their origin by PCR
引物
Primer
碱基序列 5 ※3
Base sequence 5 ※3 1F1 (♀, ♂, ♀+♂) 2F1 (♀, ♂, ♀+♂) 3F1 (♀, ♂, ♀+♂)
S4 GGACTGGAGT 6 (0 , 1 , 5) 7 (1, 1 , 5) 6(0 , 1, 5)
S8 GTCCACACGG 8 (1 , 1 , 5) 8 (1, 2 , 5) 8(1 , 2, 5)
S18 CCACAGCAGT 4 (0 , 1 , 3) 2 (0, 0 , 2) 2(0 , 0, 2)
S24 AATCGGGCTG 5 (0 , 1 , 4) 6 (1, 1 , 4) 8(1 , 4, 3)
S25 AGGGGTCTTG 3 (1 , 0 , 2) 4 (2, 0 , 2) 4(2 , 0, 2)
S45 TGAGCGGACA 3 (0 , 0 , 3) 3 (0, 0 , 3) 3(0 , 0, 3)
S55 CATCCGTGCT 12 (0 , 4 , 8) 10 (1 , 2 , 7) 12 (1 , 4 , 7)
S67 GTCCCGACGA 4 (1 , 1 , 2) 2 (0, 0 , 2) 2(0 , 0, 2)
S72 TGTCATCCCC 7 (0 , 3 , 4) 7 (0, 3 , 4) 7(0 , 3, 4)
S73 AAGCCTCGTC 10 (1 , 2 , 7) 9 (1, 1 , 7) 9(1 , 1, 7)
S82 GGCACTGAGG 6 (0 , 0 , 6) 6 (0, 0 , 6) 6(0 , 0, 6)
S83 GAGCCCTCCA 8 (1 , 2 , 5) 7 (1, 1 , 5) 6(0 , 1, 5)
S89 CTGACGTCAC 4 (2 , 2 , 0) 4 (1, 2 , 1) 4(1 , 3, 0)
合计 80 (7 , 18 , 54) 75 (9 , 13 , 53) 77 (7 , 19 , 51)
图 1　基因组 DNA的 RAPD分析图谱
Fig.1　RAPD analysis diagram of the genomic DNA of F1 and the parents
Note:1_male parent , 2_1F1 , 3_2F1 , 4_3F1 , 5_female parent.
101　2 期 黎星辉等:云南大叶茶与汝城白毛茶杂交后代的 RAPD亲子鉴定
　　田中淳一 、梁月荣等利用 RAPD技术对 “丰
绿” 、 “茗绿” 、 “开炉” 、“晚绿” 等自然杂交材料
进行了亲本鉴定 , 因 RAPD标记表现共显性 , 从
而肯定了 RAPD标记技术在茶树亲子鉴定中的有
效性[ 14、15、16 、17] 。在本试验中 , F1 出现了亲本没
有的特异谱带 , 可能是亲本杂交时染色体交换所
引起的 , 茶树为异花授粉植物 , 经长期演化 , 本
身为高度杂合体 , 在减数分裂时 , 各非同源染色
体之间可能自由组合在一个子细胞里 , 15对染
色体共有 215种组合 , 而且 , 染色体的非姊妹染
色单体之间的片段还可能出现各种形式的交换 ,
使其富于遗传变异的多样性。本实验中极个别在
亲本中出现的谱带在子代中没有表现 , 也可能是
这个原因 , 从理论上来说 , 当子代样本足够多
时 , 亲本所有的谱带在子代中都能表现 。
RAPD分子标记本身还存在着弱带难于准确
统计的缺陷 , 在实验通常从三个方面来克服 , 首
先 , 操作要精到熟练 , 出现问题要进行重复实验
予以检验;其次 , 对引物要进行筛选 , 排除因弱
带引起估算误差的引物;再者 , 可以设计实验进
行判别 , 即将 F1 中亲本没有的特异谱带克隆 ,
作为探针 , 然后与父母本 DNA 进行 Southern 杂
交 , 以阳性杂交结果作为 F1 确实来自该亲本的
依据 。
根据闵氏茶组植物分类系统 , 云南大叶茶与
汝城白毛茶的杂交属于茶组植物内的种间杂交 ,
具有较大的育种学意义。最近 , 陈亮等根据形态
学 、细胞学和生物化学的研究进展 , 将茶组植物
分成 5种 3变种[ 18] , 据此分类系统 , 云南大叶
茶与汝城白毛茶的杂交则属于茶组植物内的变种
间杂交 。可以预计 , 无论茶组植物分类系统如何
改进和变化 , 随着分子生物技术的不断发展 , 象
汝城白毛茶这样的优异资源的利用 , 在茶树育种
工作中将发挥越来越重要的作用。
参考文献:
[ 1] 刘贵芳.汝城大叶白毛茶野生资源的考察 [ J] .中国茶叶 ,
1983, (2):14-15.
[ 2] 叶创兴.山茶属三新种 [ J] .中山大学学报 (自然科学版),
1987 , (1):17-20.
[ 3] 闵天禄.山茶属茶组植物的订正 [ J] .云南植物研究 , 1992,
(2):115-132.
[ 4] 张宏达.茶树的系统分类 [ J] .中山大学学报 (自然科学
版), 1981 , (1):87-99.
[ 5] 张宏达.茶叶植物资源的订正 [ J] .中山大学学报 (自然科
学版), 1984 , (1):1-12.
[ 6] 贵芳 , 黎星辉 , 黄惠华 , 等.汝城白毛茶的研究与开发利用
[ J] .湖南农学院学报 , 1991, 17 (增):551-556.
[ 7] 陈兴琰 , 陈国本 , 唐明德 , 等.湖南主要茶树群体种质资源
的研究 [ J] .茶叶通讯 , 1989, (1):34-39 , (2):3-9.
[ 8] 黎星辉 , 陈兴琰 , 唐明德 , 等.湖南毛叶茶资源的评价 [ J] .
云南植物研究 , 1998 , 20 (2):90-93.
[ 9] 张宏达 , 叶创兴 , 张润梅 , 等.中国新发现的茶树资源─可
可茶 [ J] .中山大学学报 (自然科学版), 1988 , (3):131-
133.
[ 10] 虞富莲 , 俞永明 , 李名君 , 等.茶树优质资源的系统鉴定与
综合评价 [ J] .茶叶科学 , 1992 , 12 (2):95-125.
[ 11] 黄祖法 , 唐明德 , 温群英.茶叶的抑菌效果研究初报 [ J] .
茶叶通讯 , 1991 , (1):19-21.
[ 12] 黎星辉 , 宋双良 , 朱忠洪 , 等.汝城白毛茶对中老年人高血
脂症的降脂作用 [ J] .茶叶科学 , 1997 , 17 (2):235-23.
[ 13] 黎星辉.茶树远缘杂交研究初报 [ J] .经济林研究 , 1997,
15 (3):39-42.
[ 14] 田中淳一 , 齐藤格久 , 山口聪.RAPD marker にょる茶の品
种识别 [ J] .茶叶研究报告 , 1994 , 79 (别册):32-33.
[ 15] 田中淳一 , 太田さㄑら, 武田善行 , 等.DNA マー カーヶら
みた炉开まの亲种性とチセ育种への利用の可能性 [ J] .
茶叶研究报告 , 1998 , 87 (别册):42-43.
[ 16] 田中淳一 , 山口聪.Use of RAPD markers for the identification of
parentage of tea cultivars [ J] .野菜.茶叶试验场研究报告 ,
1996 , B(茶业) 9:31-36.
[ 17] 梁月荣 , 田中淳一 , 武田善行.应用 RAPD 分子标记分析
“晚绿” 品种的杂交亲本 [ J] .茶叶科学 , 2000 , 20 (1):
22-26.
[ 18] 陈亮 , 虞富莲 , 童启庆.关于茶组植物分类与演化的讨论
[ J] .茶叶科学 , 2000 , 20 (2):89-94.
102 茶　叶　科　学 21卷