全 文 ：基于 RAPD标记分析葱属 7个栽培品种的遗传多样性
刘良科 ,欧立军 ,蒋向辉 ,陈志鑫　(怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室 ,湖南怀化 418008)
摘要　[目的 ]利用RAPD标记分析葱属 7个栽培品种的遗传多样性。 [方法]采取改良 CTAB法提取植物的总DNA,从 68个RAPD引
物中筛选出 25条具有多态性且扩增稳定的引物用于品种的 DNA多态性分析 ,采用优化后的 RAPD的PCR反应体系进行PCR扩增 ,利
用MEGA4软件进行各品种间UPGMA聚类分析。 [结果]从 25个引物中共扩增出 245条 DNA带 ,其中 99条为多态性带。根据聚类分
析 ,葱属 7个栽培品种可分为 2类:汉中冬韭、阜丰 1号和豫韭 2号为 1类;其他 4个为 1类 ,其中怀化大蒜和南宁大蒜、连葱 6号和杭州
分葱各为 1小类;7个品种的相似系数范围为 80.2% ～ 99.8%。该聚类结果与依据表型特征的传统分类的结果一致。 [结论 ]该研究为
准确地进行葱属植物种质资源的鉴定 、筛选和利用提供了科学依据。
关键词　葱属;RADP标记;遗传多样性;聚类分析
中图分类号　S633　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)35-17382-02
AnalysisonGeneticDiversityof7CultivarsofAliumbasedonRAPDMarkers
LIULiang-keetal　(KeyLaboratoryofHunanProvinceforStudyandUtilizationofEthnicMedicinalPlantResources, HuaihuaUniversity,
Huaihua, Hunan418008)
Abstract　[ Objective] Thepurposewastoanalyzethegeneticdiversityof7cultivarsofAlliumbasedonRAPDmarkers.[ Method] Thetotal
DNAinplantwasextractedbyimprovedCTABmethodand25 RAPDprimerswithpolymorphismandstableamplificationwereselectedfrom
68 RAPDprimerstoanalyzeDNApolymorphismof7 cultivarofAllium.PCRamplificationwasmadebyPCRreactionsystemofoptimized
RAPD.TheUPGMAclusteranalysisonvariousvarietieswasconductedbyMEGA4 software.[ Result] 245 DNAbandswereamplifiedout
from 25primers, amongwhich, 99werepolymorphismbands.Accordingtoclusteranalysis, 7cultivarsofAliumweredividedto2classes:A.
tuberosumcv.HangzhongWinterLeek, A.tuberosumcv.FufengNo.1leekandA.tuberosumcv.HenanNo.2 leekbelongedtoaclass;the
othersbelongedtoaclassincluding2 branches, inwhich, A.sativumcv.HuaihuagarlicandA.sativumcvNanninggarlicbelongedtoa
branch;A.cepacv.LiancongNo.6onionandA.fistulosumvar.caepitusumcv.HangzhouSpringshalotbelongedtotheotherbranch.The
similaritycoeficientsin7cultivarsofAliumwerefrom 80.2%to99.8%.Theresultofclusteranalysiswasconsistentwiththetraditional
classificationbasedonmorphologictraits.[ Conclusion] Thisstudyprovidedthescientificbasisforaccurateidentification, screeningandutili-
zationofAliumplantgermplasmresource.
Keywords　Alium;RAPDmarker;Geneticdiversity;Clusteranalysis
基金项目　怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室
资助项目。
作者简介　刘良科(1963-),男 ,侗族 ,湖南会同人 ,教授 ,从事植物分
子细胞遗传学研究。
收稿日期　 2009-08-17
　　葱属(AliumL.)属于百合科(Liliaceae)葱族 (Alieae),
是百合科中种类最多的一属 ,全世界约有 700多种 ,多分布
于北温带。我国有 138种 , 11变种 ,主要分布在东北 、西北和
西南地区。由于葱属的属下分类的界限无统一标准 ,从而导
致种的数目不断增加 ,国内外学者对葱属植物的种类尚无一
致的观点。由于缺乏明显的总体形态学共有衍征 ,因而亚属
等的划分具有很大的人为性 ,关于其属下系统及系统发育和
进化问题尚存在不少分歧。许多学者认为属下分类群的区
别特征都以一些细微的形态学差异组合而成 ,有时这些特征
在蜡叶标本上几乎无法观察到或难以确认 ,因此该属的分类
学问题一直是一个难题 [ 1] 。RAPD、SRAP、RFLP等分子标记
技术既可对葱属植物进行种内遗传多样性分析和系统发育
分析 ,也可建立每种葱属植物的 DNA分子指纹图谱 [ 1-3] ,从
而为该属的属下分类提供重要的依据 , 这有利于更加准确
地研究葱属植物自然的属下系统和亲缘关系 ,为人们更好地
利用葱属植物提供科学依据。
1　材料与方法
1.1　材料　试验材料及来源见表 1。
1.2　方法
1.2.1　 DNA提取。该试验采取改良的十六烷基三甲基溴
化铵(CTAB)法 [ 4]提取植物总 DNA。
1.2.2　随机引物选择。随机引物采用美国 Operon公司设计
的 68个随机引物 ,通过预备试验 ,选取了 25个引物用于对
葱属 7个栽培品种基因组 DNA的随机扩增 ,部分引物及序
列见表 2。
表 1　试验材料及来源
Table1　 Thetestmaterialsandtheirorigin
编号No.
中文品种名Chinesename
种名和品种名Nameofspeciesandcultivars
来源Origin
1 连葱 6号 A.cepacv.LiancongNo.6onion. 广西南宁
2 汉中冬韭 A.tuberosucv.Hangzhongwinterleek. 陕西汉中
3 阜丰 1号 A.tuberosucv.FufengNo.1leek 安徽阜阳
4 豫韭 2号 A.tuberosucv.HenanNo.2leek 河南开封
5 怀化大蒜 A.satevumcv.Huaihuagarlic 湖南怀化
6 南宁大蒜 A.satevumcv.Nanninggarlic 广西南宁
7 杭州分葱 A.fistulosumvar.caepitusumcv.HangzhouSpringshalot 浙江杭州
1.2.3　PCR扩增。采用优化后 RAPD的 PCR反应体系:30
～ 50 ng/μlDNA2.0μl, 25mmol/L10×Bufer(加 MgCl2)2.5
μl, 2 U/μlTaqDNApolymerase0.4μl, 10mmol/LdNTPMIX
0.5μl,引物 1.5 μl, ddH2 O18.1 μl,进行 PCR扩增。反应程
序:94℃预变性 3min;然后 94℃ 45 s, 36℃ 45s, 72 ℃ 45s,
40个循环;最后 72 ℃延伸 10min。PCR产物经 0.5 mg/L溴
化乙锭的 0.8%的琼脂糖凝胶电泳后用 Tanon4100型凝胶处
理系统照相 ,记录电泳结果。
1.2.4　数据处理。根据电泳结果记录清晰可重复的 RAPD
带 ,在相同迁移位置 ,扩增条带存在时赋值为 A,否则赋值为
G。计算葱属品种间的遗传相似系数 ,即根据公式 F=
责任编辑　张杨林　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(35):17382-17383, 17385
(2 X1, 2 /X1 +X2 )×100%计算不同品种间的相似系数 ,其中
F表示相似系数 , X1, 2为品种 1和品种 2共同具有的分子量
相同的 DNA谱带数 , X1为品种 1的 DNA扩增谱带数 , X2为
品种 2的 DNA扩增谱带数。各品种之间的遗传距离 P=1-
F。根据遗传距离并利用 MEGA4软件进行各品种间 UPGMA
聚类分析。
表 2　试验所用部分引物及序列
Table2　Partialprimersandtheirsequences
引物 Primers 序列 Sequence 引物 Primers 序列Sequence 引物 Primers 序列 Sequence
SBS-A01 CAGGCCCTTC SBS-A15 TTCCGAACCC SBS-S09 CTCACCGTCC
SBS-A02 TGCCGAGCG SBS-A16 AGCCAGCGAA SBS-S10 TGTCTGGGTG
SBS-A03 AGTCAGCCAC SBS-A17 GACCGCTTGT SBS-S11 AAAGCTGCGG
SBS-A04 AATCGGGCTG SBS-A18 AGGTGACCGT SBS-S12 TGTCATCCCC
SBS-A05 AGGGGTCTTG SBS-A19 CAAACGTCGG SBS-S13 AAGCCTCGTC
SBS-A06 GGTCCCTGAC SBS-A20 GTTGCGATCC SBS-S14 TGCGTGCTTG
SBS-A07 GAAACGGGTG SBS-S01 TTCGAGCCAG SBS-S15 GACGGATCAG
SBS-A08 GTGACGTAGG SBS-S02 GTGAGGCGTC SBS-S16 CACACTCCAG
SBS-A09 GGGTAACGCC SBS-S03 GGGGGTCTTT SBS-S17 TTCCCCCCAG
SBS-A10 GTGATCGCAG SBS-S04 CCGCATCTAC SBS-S18 TGAGTGGGTG
SBS-A11 CAATCGCCGT SBS-S05 GATGACCGCC SBS-S19 GTTGCCAGCC
SBS-A12 TCGGCGATAG SBS-S06 GAACGGACTC SBS-A14 TCTGTGCTGG
SBS-A13 CAGCACCCAC SBS-S07 GTCCCGACGA SBS-S08 TGGACCGGTG
2　结果与分析
2.1　 PCR扩增结果　筛选出的 25个 10 bp寡核苷酸随机
引物对 7个葱属品种的总 DNA样本进行扩增 ,共得到 245条
扩增 DNA片段 ,其中有 99条表现出多态性 ,占总条带数的
40.40%,无多态性谱带数 146条。不同引物扩增出的 DNA
带数差异较大 ,其变化范围为 0 ～ 10条 ,平均每个引物可扩增
9.8条 ,扩增片段长度都在 100 ～ 2 000 bp。图 1为引物 SBS-
A03、SBS-A13的 RAPD扩增图谱。
注:A为SBS-A03;B为SBS-A13。 1～ 7为 7个葱属品种的检测结果。
Note:A, SBS-A03;B, SBS-A13;1-7arethedetectionresultsofsevencultivarsofAlium.
图 1　引物 SBS-A03和 SBS-A13的 RAPD产物图谱
Fig.1　RAPDproductswiththeprimersofSBS-A03andSBS-A13
2.2　聚类分析结果　根据 DNA扩增结果计算出各品种间
的相似系数 ,其分布范围在 80.2% ～ 99.8%。其中汉中冬
韭 、阜丰 1号和豫韭 2号两两之间的相似系数最大 ,分别为
99.8%、99.0%、98.9%;怀化大蒜和南宁大蒜之间的相似系
数为 97.7%(表 3)。
表 3　 7个葱属品种的相似系数
Table3　Similarityindexamong7cultivarsofAlium %
品种
Cultivars 1 2 3 4 5 6 7
1 100.0
2 82.0 100.0
3 81.5 99.8 100.0
4 81.1 99.0 98.9 100.0
5 96.6 82.5 83.1 81.9 100.0
6 96.4 81.8 81.9 80.4 97.7 100.0
7 96.7 80.9 80.2 82.6 95.7 95.5 100.0
　注:1～ 7分别为表 1对应的 7个葱属品种编号。下同。
　Note:1-7arethenumberofthesevencultivarsofAliuminTable1.The
sameasbelow.
　　MEGA4.0软件处理 DNA图谱得到聚类分析图(图 2)。
聚类分析结果表明 , 7个品种分为 2支。其中汉中冬韭和阜
丰 1号聚类再与豫韭 2号相聚为一支 ,怀化大蒜和南宁大蒜
先聚类再与连葱 6号 、杭州分葱相聚为另一支。由此可将这
7个葱属品种分为两大类:韭菜单独一类;另一类包括洋葱 、
蒜和葱 。
3　讨论
(1)汉中冬韭 、阜丰 1号和豫韭 2号是韭的 3个栽培品
种 ,来自不同的省区 ,它们两两之间的相似系数最大 ,分别为
99.8%、99.0%、98.9%,这说明韭在驯化栽培过程中基因变
异较小 ,基因比较保守 ,受环境影响也较小 ,从而表现出遗传
差异不大。同样 ,怀化大蒜和南宁大蒜是蒜的 2个栽培品
种 ,相似系数为 97.7%。
　　(2)周颂东等建议将中国葱属植物分为 6亚属级 ,在部
分亚属级下 ,可以再分组。根据周颂东的建议 ,韭隶属于根
茎亚属 ,洋葱 、蒜和葱隶属于蒜亚属 [ 2] 。该研究中 ,连葱 6号 、
(下转第 17385页)
1738337卷 35期　　　　　　　　　　　　　　　　刘良科等　基于 RAPD标记分析葱属 7个栽培品种的遗传多样性
GhDREB基因的济麦 19-379转基因小麦株系的植株都扩增
出与阳性对照一样的条带 ,且带纹清晰。说明该方法提取到
的基因组 DNA能十分有效的进行 PCR扩增 ,完全适用于后
续分子生物学研究。
注:M为 Mark;P为阳性对照;16为水;15为非转化植株对照;1～
14为济麦 19-379转基因小麦株系。
Note:M.Marker;P.Positivecontrol;16.Water;15.Non-trans-
formedplantcontrol;1-14.TransgenicwheatlinesofJimai
19-379.
图 2　转基因小麦株系PCR扩增电泳图谱
Fig.2　PCRamplifiedelectrophoretogramoftransgenicwheat
lines
3　讨论
3.1　材料的选择与保存　前人的研究证明 ,对于大多数植
物而言 ,健康的嫩叶是试验最佳的样本来源 。因为健康的嫩
叶不仅含有较少的代谢物 ,同时细胞数量也更多 ,而如果选
择成熟或老化的叶片组织 ,多糖 、多酚等代谢物质相应增加 ,
会给基因组 DNA的提取带来困难 ,也会影响下游试验 。但
对小麦而言 ,笔者经过反复试验对比发现 ,在提取基因组
DNA时对材料的要求不是很严格 ,只要是健康的绿叶 ,无论
选择嫩叶或是老叶提取出来的 DNA无论从质量上还是得率
上差别都不是很大。
3.2　操作步骤　提取 DNA的过程中有很多因素能导致使
DNA降解。因为 DNA分子量较大 ,机械张力或高温很容易
DNA分子发生断裂。因此 ,在实际操作过程中应尽可能轻
缓 ,尽量避免过多的溶液转移及剧烈震荡等 ,以减少机械张
力对 DNA的损伤。同时要避免过高的温度 ,以保证 DNA的
完整性 。
与传统的 CTAB法相比 ,改良的 CTAB法所需材料量
少 ,无需称量 ,直接用离心管夹取;研磨直接在离心管中进
行 ,不必先在研钵中研磨然后再转移到离心管里 ,能有效减
少材料损失;氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提也由原来的抽提 3次
变为现在的抽提 1次 ,但所提取的 DNA无论从质还是量上
与抽提 3次相比并无太大差别。试验结果证明 ,当需要提取
的样本量很大 ,而所需的 DNA量较少 ,用这种改良的 CTAB
法提取小麦叶片总 DNA,可以缩短操作周期 、节省时间 ,并且
需要材料量少 、成本低 、得率高 、纯度好 ,可用于 PCR等分子
生物学研究的需要。
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(上接第 17383页)
注:图下方 0～ 1.5为遗传距离。
Note:0-1.5belowthefigureisthegeneticdistance.
图 2　7个葱属品种的UPGMA聚类结果
Fig.2　UPGMAclusteringresultsof7cultivarsofAliumbased
onRAPDmarkers
怀化大蒜 、南宁大蒜 、杭州分葱聚为一大类 ,这与周颂东等的
建议相符。
　　(3)该研究表明 ,利用 RAPD标记能够在 DNA水平上进
行葱属植物不同品种之间遗传关系的分析 ,而且方法简便 、
迅速;可以在分子水平上进行植物品种的鉴定和亲缘关系分
析 ,为准确地进行葱属植物种质资源的鉴定 、筛选和利用提
供依据;可以为葱属植物的科学分类提供新的分子标记。
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