全 文 ：茶 叶 科 学 2004，24（1）：33—36
Journal of Tea Science

收稿日期：2004-02-18 修订日期：2004–03–15
基金项目：湖南省自然科学基金、湖南省重点科技攻关计划、江苏省省高技术研究计划资助项目内容
作者简介：黎星辉（1962-），男，湖南常德人，南京农业大学研究员，从事茶学教学和研究工作。
文章编号： 1000—369X（2004）01—033—04
汝城白毛茶种群个体间亲缘关系的 RAPD分析
黎星辉 1，刘春林 2，施兆鹏 2，罗军武 2，沈程文 2，龚志华 2，陈暄 1
（1 南京农业大学，江苏 南京 210095；2 湖南农业大学，湖南 长沙 410128）
摘要：采用 RAPD 技术，对汝城白毛茶种群个体间的亲缘关系进行了分析。研究结果：汝城白毛茶种群个体单
株扩增的谱带数最多时为 13条，最少时为 10条；DNA多态性最高为 92.31%，最低为 70.00%，平均为 85.40%。
结果表明汝城白毛茶种群呈现丰富的遗传多样性。汝城白毛茶种群单株间的遗传距离最小为 0.0882，最大为
0.5791。聚类分析结果表明汝城白毛茶种群中有些单株聚类很近，遗传基础比较一致，有些聚类较远，显示其丰
富的遗传多样性。研究发现种群单株间的遗传变异呈现连续性，当结合距离 I 为 0.14 时，汝城白毛茶种群可分
为 6个类型，这与其表观形态类型相符。本文运用分子生物学方法证明汝城白毛茶的核心种质基因群在汝城县白
毛茶示范场得到了有效保护。
关键词：茶学；汝城白毛茶；RAPD；亲缘关系；资源保护
中图分类号：S571.1; Q523 文献标识码：A

Analysis of Genetic Relationships Among “Rucheng
Baimao Cha” Plants with RAPD Method
LI Xing-hui1, LIU Chun-lin2, SHI Zhao-peng2, LUO Jun-wu2, SHEN Cheng-wen2
GONG-zhihua2, CHEN-xuan1
(1.Nanjing Agricultural University, Nangjing 210095, China; 2. Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)
Abstract: The genetic relationships of the individual plants among the “Rucheng Baimao Cha” population were
studied with the RAPD method. The results were as follows: The maximum number of PCR bands of the individual
plants among the “Rucheng Baimao Cha” population was 13，and the minimum number was 10. The maximum DNA
polymorphism amplified by RAPD-PCR was 92.31%, while the minimum was 70.00%; the average was 85.40%. This
result showed the abundant genetic diversities. The maximum genetic distances among individual plants of the
“Rucheng Baimao Cha” population was 0.5791; the minimum one was 0.0882. The result from the DNA molecular
dendrogram showed that the variation among individual plants of“Rucheng Baimao Cha” population was continuous.
The cluster analysis by UPGMA showed that the “Rucheng Baimao Cha”population could be divided into 6 groups.
This result matched the morphologic characteristics of the population. From the DNA molecular dendrogram it was
showed that the key germplasm groups were protected in the Rucheng Baimao Cha Demonstration Farm in Rucheng
county, Hunan province, P. R. China.
Key words: Tea science, Rucheng Baimao Cha(Camellia pubescens); RADP; Genetic relationshipson; Resource protection


汝城白毛茶是红碎茶四套样地区的一个
特异茶叶植物资源。因其突出的育种价值，在
湖南优质茶树资源中占有独特的地位。在以异
花授粉方式长期演化而形成的汝城白毛茶种
DOI:10.13305/j.cnki.jts.2004.01.006
茶 叶 科 学 24卷

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群中，个体基因组 DNA 的状况直接反映种群
内植株个体的遗传差异。本试验采用 RAPD技
术对汝城白毛茶种群的 28 个单株个体进行了
分析，旨在探讨汝城白毛茶种群内植株个体的
遗传差异和亲缘关系，为汝城白毛茶的资源保
护、分类和茶树育种提供分子生物学依据。
1. 材料和方法
1.1 试验材料
提取基因组 DNA: 汝城白毛茶采自汝城
县白毛茶示范场，随机抽取 28 株单株，分别
采集枝条并按 No.1-No.28 编号，在实验室取
枝条上的一芽二叶分别提取基因组 DNA。
主要化学试剂：10×PCR buffer(w/mg)为
上海瑞真生物技术有限公司出品 ; dNTP Mix,
Taq DNA Polymerase，和 Random Primer S1～
S100 均为 Sangon 公司所产；PGEM-7ZF(+)
/Hae Ⅲ markers 和 Lambda DNA/EcoR
I+Hind Ⅲmarkers为 MBI公司产品，QIAquick
spin kit 购自德国 QIAGEN Company.
1.2 试验方法
1.2.1基因组 DNA 提取、纯化与检验
基因组 DNA 粗提：称 0.5 g样品，加 0.3 g
PVP，加液氮，磨碎后加 4 ml DNA 提取缓冲
液(0.1 mol/L Tris-HCl, pH8.0, 0.1 mol/L EDTA,
pH8.0, 0.25 mol/L NaCl, 1% SDS)搅匀，取 0.5
ml提取液转入 1.5 ml 灭菌离心管，加入等体积
饱和酚︰氯仿︰异戊醇（25︰24︰1），摇匀，
离心(13000 r/min,4℃,5min),上清液再经氯仿︰
异戊醇(24︰1)抽提后，离心（13 000 r/min, 4
℃, 5 min）, 收集上清液，加入 3 mol/L NaAC
至终浓度为 0.3 mol/L, 摇匀，再加 2倍体积冷
无水乙醇，温和倒转数次，将絮状 DNA挑出，
转入新试管，在超净工作台上吹干，然后加 400
μl TE(10 mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 1 mmol/L
EDTA, pH8.0)溶解，即得 DNA粗提液。
基因组 DNA 纯化：在 DNA粗提液中加入
无DNA酶活性的 RNase酶至终浓度 10 μg/ml,
37℃保温 30～60 min,再加入等体积饱和酚︰
氯仿︰异戊醇（25︰24︰1）抽提，离心（13000
r/min,4℃ , 5 min），上清液再经氯仿︰异戊醇
（24︰1）抽提后，离心（13000 r/min,4℃ , 5
min）,收集上清液，加入 3mol/L NaAC至终浓
度为 0.3 mol/L, 摇匀，加 2倍体积冷无水乙醇，
温和倒转数次，将絮状 DNA挑出，转入新的
试管，用 70%乙醇洗涤三次后，在超净工作台
上吹干，然后，用 QIAquick spin kit纯化(按
说明书操作)，-20℃保存。
基因组 DNA 检验：取 20 μl纯化的 DNA
以灭菌超纯水稀释 100倍，在 Beckman DU-640
紫外分光光度计上读取 260 nm 和 280 nm 的
OD值，以确定 DNA纯度和浓度。在 1×TAE
缓冲液中，取 10 μl DNA 纯品在 1.0%琼脂糖
凝胶上电泳（电压 2～5 v/cm, 凝胶含终浓度为
0.6 μg/ml 的溴化乙锭），然后在 Gel DOC—
1000 凝胶分析系统中观察检验 DNA 片段大
小。将纯化的 DNA 配制成浓度为 20 ng/μ l
的模板 DNA。
1.2.2 RAPD-PCR分析
PCR反应液总体积 30 μ l, 反应体系为：
10×Taq Buffer(含 Mg2+)，各 0.2 mmol/L 的
dNTPs, 0.2μmol/L 引物，引物的碱基序列见
表 1，1.0U Taq DNA聚合酶，40 ng模板 DNA，
加 22 μ l 矿物油 ,以防止水分蒸发。
扩增方法为：在 PTC—100TM 型热循仪
上进行，程序如下：94℃预变性 180 s；92℃
变性 50 s；35℃退火 50 s；72℃延伸 100 s，
40个循环；72℃后延伸 5 min；4℃冷却 20 min。
1.2.3电泳和检测
在 1×TAE 缓冲液中，用 1.9%琼脂糖凝
胶电泳检测 PCR 产物，琼脂糖凝胶中溴化乙
锭终浓度为 0.6μg/ml，120伏进样， 80伏分
离，然后在 Gel Doc 1000 凝胶分析系统中采
集和处理信息。
1.2.4 数据处理
用 PGEM-7ZF(+) /Hae Ⅲ markers 和
Lambda DNA/EcoR I+Hind Ⅲmarkers 作分子
1期 黎星辉，等：汝城白毛茶种群个体间亲缘关系的 RAPD分析

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量标记，以比照反应产物在凝胶上的对应位
置，显带者记为“1”，不显带者记为“0”。
将 0、1 矩阵图输入计算机。
任意两个样本之间的遗传距离根据公式 D
＝－lnF来计算，其中，F 为两个样本的简单相
似系数，F=2NXY/（NX+NY），NXY 是个体
X 和个体 Y 的 PCR 扩增分子量大小相同的
DNA片段条数，NX、NY分别是样本 X、样本
Y的 PCR扩增产物的 DNA片段总数。
根据遗传距离,利用 UPGMA(Unweighted
Pair Group Method with Arithmetic Mean) 聚
类分析方法构建分子系统树。
2. 结果和分析
2.1 基因组 DNA 的提取质量
汝城白毛茶所含茶多酚等次生代谢产物
的浓度较高，按常规方法提取的基因组 DNA
质量不高，需要进一步用 QIAquick spin kit纯
化处理粗提的 DNA，经基因组模板 DNA的吸
光曲线和琼脂糖凝胶电泳检测，处理后的
DNA 质量能满足 RAPD-PCR实验对 DNA 纯
度的要求。
2.2 基因组 DNA 的多态性分析
从 100个引物中试验筛选了 20个引物进
行 RAPD-PCR扩增，RAPD分析所显示的 DNA
水平上的多态性信息如表 1 所示。20 个随机
引物共扩增出 226 条 RAPD 谱带，其中共同
带 33条，多态带 193条，平均每个引物出现
多态带 9.65条；扩增的谱带数最多时为 13条，
最少时为 10条；多态性最高为 92.31%,多态性
最低为 70.00%,各引物扩增平均表现的多态性
为 85.40%。结果表明汝城白毛茶种群呈现遗
传背景的复杂性和丰富的遗传多样性，这与其
表观形态上的遗传多样性是相符的。
表 1 汝城白毛茶种群的 RAPD-PCR 扩增产物的多态性
Table 1 DNA polymorphism amplified by RAPD-PCR with “Rucheng Baimao Cha”
引物 碱基序列 扩增谱带总数 基本谱带数 特异谱带数 多态带百分率 (%)
Primer Base sequence
5’→3’
Total bands Basic bands Special bands Percentage of
polymorphic bands
S3 CATCCCCCTG 11 1 10 90.91
S4 GGACTGGAGT 12 1 11 91.67
S9 TGGGGGACTC 12 1 11 91.67
S10 CTGCTGGGAC 13 3 10 76.92
S11 GTAGACCCGT 11 1 10 90.91
S16 TTTGCCCGGA 10 1 9 90.00
S23 AGTCAGCCAC 10 3 7 70.00
S28 GTGACGTAGG 11 1 10 90.91
S35 TTCCGAACCC 10 3 7 70.00
S44 TCTGGTGAGG 11 1 10 90.91
S53 GGGGTGACGA 12 1 11 91.67
S55 CATCCGTGCT 12 1 11 91.67
S58 GAGAGCCAAC 10 2 8 80.00
S62 GTGAGGCGTC 11 2 9 90.91
S65 GATCACCGCC 13 1 12 92.31
S78 TGAGTGGGTG 11 1 10 90.91
S86 GTGCCTAACC 11 3 8 72.73
S89 CTGACGTCAC 12 3 9 75.00
S94 GGATGAGACC 10 2 8 80.00
S99 GTCAGGGCAA 13 1 12 92.31
Total 226 27 193 85.40
Average 11.3 1.35 9.65 85.40

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2.3 聚类分析
从汝城白毛茶种群单株间的遗传距离来
看，8号单株与 9号单株之间的遗传距离最小，
为 0.0882，22号单株与 24 号单株之间的遗传
距离最大，为 0.5791, 其余单株之间的遗传距
离居二者之间，遗传距离的大小可以表明单株
间亲缘关系的远近。根据遗传距离矩阵通过聚
类分析得出汝城白毛茶种群 28个单株的 DNA
分子系统树图如图 1所示，从图 1可以看出，
汝城白毛茶种群中有些单株聚类很近，遗传基
础比较一致，有些聚类较远，显示其遗传多样
性，总体说来，其遗传变异呈现连续性，当结
合距离 I为 0.14时，汝城白毛茶种群可分为 6
个类型，这与资源调查中根据形态学所得到的
类型是一致的。实验结果表明汝城白毛茶的核
心种质基因群在汝城县白毛茶示范场得到了
有效保护。
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N o . 2 0
N o . 2 1
N o . 2 3
N o . 2 2
N o . 1 3
N o . 1 4
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N o . 3
N o . 4
N o . 5
N o . 1 8
N o . 2 7
N o . 2 8
N o . 1 5
N o . 1 6
N o . 1 7
N o . 1 9
N o . 6
N o . 7
N o . 1
N o . 2
N o . 2 5
N o . 2 6
N o . 2 4
N o . 11
N o . 1 2
N o . 8
N o . 9
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0.15-
0.10-
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0.00-
图 1 汝城白毛茶种群 28 个单株的 DNA分子系统树图
Fig. 1 DNA molecular dendrogram of 28 individual
plants of “Rucheng Baimao Cha” population