全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2014，26(3):667-674 http:/ /www． zjnyxb． cn
刘济明，王敏，闫国华，等． 濒危竹种小蓬竹(Drepanostachyum luodianense)ＲAPD-PCＲ反应体系优化［J］．浙江农业学报，
2014，26(3):667-674．
DOI:10. 3969 / j． issn． 1004-1524. 2014. 03. 23
收稿日期:2013-07-19
基金项目:贵州省国际科技合作计划项目［(2013)7010 号］;贵州大学引进人才科研项目“濒危植物小蓬竹个体生态特征及其小生境特
点研究”
作者简介:刘济明(1963—)，男，重庆人，博士，教授，主要研究方向为资源植物学及植物生理生态学。E-mail:karst0623@ 163． com
濒危竹种小蓬竹(Drepanostachyum luodianense)ＲAPD-PCＲ
反应体系优化
刘济明，王 敏，闫国华，赵小鹏，文 萍，池 馨，颜 强，李 鹏
(贵州大学 林学院，贵州 贵阳 550025)
摘 要:为了建立小蓬竹(Drepanostachyum luodianense)ＲAPD-PCＲ反应的最优体系，以小蓬竹基因组 DNA
为模板，对影响其 ＲAPD扩增的 dNTPs浓度、模板 DNA浓度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度、Mg2 +浓度等重
要参数进行了单因子和正交试验。试验得出小蓬竹 ＲAPD 最优反应体系为:20 μL 反应体系，10 × PCＲ
buffer为 1 /10 体积，dNTPs为 100 μmol·L －1，模板 DNA 量为 30 ng，Taq DNA 聚合酶为 1. 0 U，引物浓度为
0. 2 μmol·L －1，Mg2 +浓度为 1. 5 mmol·L －1。优化后的 ＲAPD-PCＲ 反应程序为:94℃预变性 5 min，然后进
入 35 个循环，即 94℃变性 1 min，35℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，循环完毕后于 72℃延伸 7 min，最后在 4℃
保持。
关键词:小蓬竹;ＲAPD-PCＲ;引物;dNTPs;Taq DNA聚合酶
中图分类号:S 795 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2014)03-0667-08
Optimization of ＲAPD-PCＲ conditions for a rare and endangered bamboo of Drepanostachyum
luodianense
LIU Ji-ming，WANG Min，YAN Guo-hua，ZHAO Xiao-peng，WEN Ping，CHI Xin，YAN Qiang，LI Peng
(College of Forestry，Guizhou University，Guiyang 550025，China)
Abstract:The Drepanostachyum luodianense ＲAPD-PCＲ reaction system was optimized for the analysis of genetic
variation and structure of D． luodianense． The genomic DNA of D． luodianense was extracted by improved CTAB
method． Then，both single factor test and orthogonal design were applied to study the effects of main factors on the
ＲAPD-PCＲ system for D． luodianense，in which the main factors included the concentration of dNTPs，primers and
Mg2 + ． The content of template DNA and Taq DNA polymerase and an optimal 20 μL ＲAPD-PCＲ reaction system for
D． luodianense was established，including 1 /10 volume 10 × PCＲ buffer，100 μmol·L －1 dNTPs，30 ng template
DNA，1. 0 U Taq DNA polymerase，0. 2 μmol·L －1 primers and 1. 50 mmol·L －1 Mg2 + ． The optimized reaction
program was initially at 94℃ for 5 min，followed by 35 cycles at 94℃ for 1 min，at 35℃ for 30 s，at 72℃ for 90 s，
and then held at 72℃ for 7 min，and finally kept at 4℃ ．
Key words:Drepanostachyum luodianense;ＲAPD-PCＲ;primers;dNTPs;Taq DNA polymerase
小蓬竹［Drepanostachyum luodianense(Yi et
Ｒ． S． Wang)Keng f．］系禾本科竹亚科镰序竹
属，又名“藤竹”、“竹麻”，为一次性开花结实的
合轴丛生竹种。小蓬竹是我国特产竹种，在
IUCN的红色名录中被定为濒危种。20 世纪末
期，小蓬竹被当地造纸企业广泛用作造纸原料，
特别是对新生幼竹掠夺式的砍伐现象严重，致使
小蓬竹无性系种群严重退化，竹株衰老死亡，种
群数量急剧减少。自 2000 年以来，对小蓬竹滥
砍乱伐的行为已经得到有效扼制，但是，由于小
蓬竹自身特殊的生活习性和克隆繁殖为主的繁
殖方式，使得其分布区很难得到扩大［1］。据现有
调查，小蓬竹在贵州省的罗甸县、平塘县、紫云苗
族布依族自治县、长顺县、望谟、安龙、贞丰、册亨
及惠水等地的喀斯特山地有分布，于海拔 300 ～
1 200 m的山坡上成片生长，种群数量不断减少，
亟需保护。
目前国内外对于小蓬竹的研究主要集中在
小蓬竹群落以及无性系种群生态、生理学方
面［2 － 8］，对于小蓬竹分子水平的研究还未见报
道。ＲAPD 随 机 扩 增 多 态 性 DNA (random
amplified polymorphic DNA)是 20 世纪 90 年代建
立的一种基于 PCＲ 的分子标记技术［9 － 10］。
ＲAPD技术具有操作简单、自动化程度高、需要模
板 DNA量极少、周期短等优点，但是 ＲAPD 技术
对反应条件非常灵敏，所以在进行 ＲAPD 分析前
首先要建立稳定的 ＲAPD-PCＲ 反应体系。本文
通过大量试验，探讨了 dNTPs 浓度、模板 DNA 浓
度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度、Mg2 +浓度等因
子对小蓬竹 ＲAPD 反应的影响，建立并优化了小
蓬竹的 ＲAPD-PCＲ反应体系，为小蓬竹的遗传多
样性及遗传结构研究奠定了基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
小蓬竹材料采自贵州省罗甸县董架乡董架
村，海拔约 840 m。采集幼嫩、新鲜叶片约 10 g
置于塑封袋中，加入 100 g变色硅胶，摇动袋子使
叶片充分接触硅胶，保证叶片在 12 h 内干燥，备
用。并随时注意硅胶的颜色，一旦发现其由蓝色
变为粉红色，则及时更换。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 小蓬竹基因组 DNA提取与检测
在经典的 CTAB法［11 － 12］基础上进行改良，从
经硅胶干燥的小蓬竹叶片中提取小蓬竹基因组
DNA。0. 08%浓度琼脂糖凝胶电泳及紫外分光
光度计检测 DNA的浓度和纯度。
1． 2． 2 退火温度优化
PCＲ循环中，退火温度最为重要。本试验选
择引物 S279(CAAAGCGCTC)，以其 Tm 值为基
础，由 PCＲ 仪自动设定 8 个温度梯度(45. 0，
44. 3，43. 0，41. 2，39. 0，37. 1，35. 7，35. 0℃)来进
行退火温度优化。
反应体系为:20 μL 的反应体积，其中 10 ×
PCＲ buffer 为 1 /10 体积，dNTPs 为 200 μmol·
L －1，引物浓度 0. 2 μmol·L －1，Taq DNA聚合酶为
1. 0 U，Mg2 + 为 1. 50 mmol·L －1和 DNA 模板 50
ng。ＲAPD-PCＲ 反应程序为:94℃，5 min →
(94℃，1 min→35 ～ 45℃，30 s→72℃，90 s)→35
个循环→72℃，7 min，4℃保持。
1． 2． 3 ＲAPD体系的单因子优化
对影响 ＲAPD 扩增的 dNTPs、模板 DNA 浓
度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度、Mg2 +浓度等因
子进行优化，每次改变一个因子的浓度同时保持
其他因子及浓度不变，使用经优化了退火温度的
反应程序。各因子梯度见表 1。
表 1 试验因子水平
Table 1 Level of factors
水
平
dNTPs /
(μmol·L －1)
模板 DNA
/ ng
Taq DNA
聚合酶
/ U
引物 /
(μmol·L －1)
Mg2 + /
(mmol·L －1)
1 50 30 0. 5 0. 1 1. 3
2 100 40 1. 0 0. 2 1. 5
3 150 50 1. 5 0. 3 1. 7
4 200 60 2. 0 0. 4 2. 0
5 250 80 2. 5 0. 6 2. 5
6 300 100 3. 0 0. 8 3. 0
7 400 120 3. 5 1. 0 3. 5
1． 2． 4 ＲAPD体系的正交优化
为优化反应体系，避免各个因子间的相互作
用影响扩增结果，根据表 1 中 5 个影响因子的单
因子试验结果，选取每个因子试验效果较好的 3
个水平，按正交表 L18(35)进行试验。对正交试
·866· 浙江农业学报 第 26 卷 第 3 期(2014 年 5 月)
验的 PCＲ 扩增条带根据条带数量和清晰度进行
打分。无条带产生记为 1，随着条带数量增加、清
晰度提高而逐渐加分，以评分结果为依据进行直
观分析，最终确定 ＲAPD-PCＲ最优体系。
1． 2． 5 PCＲ产物检测
ＲAPD-PCＲ扩增产物于 2%琼脂糖凝胶上进
行电泳，电泳液为 1 × TBE，电压 5 V·cm －1，待溴
酚蓝跑至离点样孔 2 /3 处时停止电泳，在凝胶成
像系统下观察结果并拍照记录。
2 结果与分析
2． 1 小蓬竹基因组 DNA的提取与检测
采用改良 CTAB 方法提取到较高纯度的小
蓬竹基因组 DNA，0. 08%琼脂糖凝胶电泳检测
结果显示(图 1)所提取的基因组 DNA 主带清
晰，略有拖尾现象但不影响 ＲAPD 分析。所提
取的小蓬竹基因组 DNA A260 /A280比值为 1. 75 ～
1. 79，纯度较高;干燥叶片的 DNA 得率在
2. 17 ～ 5. 27 μg·g － 1，已经达到 ＲAPD分析下游
试验的要求。
图 1 小蓬竹 DNA电泳结果
Fig． 1 The DNA electrophoresis result of D． luodianense
2． 2 退火温度优化
与变性温度、延伸温度不同，退火温度在不
同的 PCＲ程序中有较大差异。在一定温度范围
内，退火温度越高，扩增产物的特异性越高，但
退火温度过高又会令引物和模板 DNA 亲和力
变小，扩增条带变弱。随着退火温度的降低，扩
增产物的特异性降低。通常引物的退火温度取
决于引物的碱基组成、长度和浓度，一般以引物
的 Tm值为基础设置退火温度。ＲAPD 的引物
长度为 10 bp，退火温度一般低于 40℃。因为退
火温度高于 40℃会抑制 ＲAPD 反应［6］。本试
验结果显示:35. 0，35. 7，37. 1℃三个温度扩
增条带数较多，在 35. 0℃时扩增效果最好，条
带清晰、分辨率高、多态性丰富。因此本试验
中小 蓬 竹 ＲAPD-PCＲ 的 最 适 退 火 温 度 为
35. 0℃(图 2)。
1—35. 0℃;2—35. 7℃;3—37. 1℃;4—39. 0℃;5—41. 2℃;
6—43. 0℃;7—44. 3℃;8—45. 0℃。
图 2 ＲAPD反应体系 35 ～ 45℃ 8 个梯度退火温度的
扩增结果
Fig． 2 Amplification results of different annealing
temperatures from 35℃ to 45℃ in ＲAPD reaction system
2． 3 ＲAPD体系的单因子优化
2． 3． 1 dNTPs浓度对 ＲAPD-PCＲ的影响
dNTPs即 dATP，dTTP，dGTP，dCTP 4 种脱氧
核苷酸，是 PCＲ 反应的原料。dNTPs 浓度过高
会直接螯合 Mg2 +，使其浓度下降而影响 Taq
DNA聚合酶的活性;还可能造成错配而降低产
物的特异性。但是 dNTPs浓度过低又会使反应
速度降低，最终影响 PCＲ产量。试验结果表明，
当 dNTPs浓度为 50 μmol·L － 1时，有一条清晰亮
带，弱带模糊;当 dNTPs浓度为 100 ～ 250 μmol·
L － 1时，扩增条带数和亮度接近，其中 100 μmol·
L － 1亮度较高;而 dNTPs浓度高于 250 μmol·L － 1
时，扩增条带完全缺失。因此，选择 50，100 和
150 μmol·L － 1 3 个 dNTPs 浓度用于正交试验
(图 3)。
·966·刘济明，等．濒危竹种小蓬竹(Drepanostachyum luodianense)ＲAPD-PCＲ反应体系优化
1—50 μmol·L －1;2—100 μmol·L －1;3—150 μmol·L －1;4—
200 μmol·L －1;5—250 μmol·L －1;6—300 μmol·L －1;7—400
μmol·L －1。
图 3 ＲAPD反应中不同 dNTPs浓度的比较
Fig． 3 Comparison among different dNTPs concentrations
in the ＲAPD reaction system
2． 3． 2 模板 DNA量对 ＲAPD-PCＲ的影响
ＲAPD-PCＲ对模板 DNA 的用量和纯度要求
都很低，但 DNA 量过低会得不到所需的扩增产
物;反应体系中模板量增多可以减少交叉污染引
起反应失败的可能，但含量过高又会出现非特异
性扩增。试验结果显示(图 4):DNA 模板量为
80，120 ng时无扩增带，其余 5 个 DNA 模板量下
扩增的带型差异不大，其中 30 ng 时扩增条带最
亮，综合效果最好。所以选择 30，40 和 50 ng 3
个 DNA模板量进行正交试验。
1—30 ng;2—40 ng;3—50 ng;4—60 ng;5—80 ng;6—100
ng;7—120 ng。
图 4 ＲAPD反应中不同模板 DNA浓度的比较
Fig． 4 Comparison among different template DNA
concentrations in the ＲAPD reaction system
2． 3． 3 Taq DNA 聚合酶浓度对 ＲAPD-PCＲ 的
影响
PCＲ反应的总体积、酶活性和酶的耐热性等
都会制约 Taq DNA聚合酶的用量［13］。在 PCＲ体
系中，Taq DNA聚合酶浓度过低会导致扩增产物
量少;浓度过高，又会引起非特异性扩增［14］。由
图 5 可见，除了最低浓度 0. 5 U没有扩增带以外，
1. 0 ～ 3. 5 U 的扩增带都清晰、亮度高，并且带型
差异不大。综合 PCＲ要求和试验成本考虑，选取
1. 0，1. 5 和 2. 0 U 3 个 Taq DNA聚合酶量进行正
交试验。
1—0. 5 U;2—1. 0 U;3—1. 5 U;4—2. 0 U;5—2. 5 U;6—3. 0
U;7—3. 5 U。
图 5 ＲAPD反应中不同 Taq DNA聚合酶浓度的比较
Fig． 5 Comparison among different Taq DNA polymerase
concentrations in the ＲAPD reaction system
2． 3． 4 引物浓度对 ＲAPD-PCＲ的影响
引物浓度也会影响扩增效率，浓度过高会
造成错配及非特异性扩增，还可能在引物之间
形成二聚体;若浓度过低，则会降低引物与模板
的结合率，使扩增过早结束而致扩增条带浅或
无条带。试验结果见图 6，各个引物浓度都扩增
出条带，1. 0 μmol·L － 1扩增的条带亮度最弱和
条带数最少;0. 1 μmol·L － 1扩增条带最清晰、多
态性最高且辨识率也最大;当浓度大于 0. 3
μmol·L － 1时出现了 200 ～ 500 bp 的小片段，可
能是引物浓度过大形成的非特异性片段。本试
验选择 0. 1，0. 2 和 0. 3 μmol·L － 1 3 个引物浓度
进行正交试验。
·076· 浙江农业学报 第 26 卷 第 3 期(2014 年 5 月)
1—0. 1 μmol·L －1;2—0. 2 μmol·L －1;3—0. 3 μmol·L －1;4—
0. 4 μmol·L －1;5—0. 6 μmol·L －1;6—0. 8 μmol·L －1;7—1. 0
μmol·L －1。
图 6 ＲAPD反应中不同引物浓度的比较
Fig． 6 Comparison among different primers concentrations
in the ＲAPD reaction system
2． 3． 5 Mg2 +浓度对 ＲAPD-PCＲ的影响
Mg2 +浓度对酶活性、酶专一性、退火温度、解
链温度以及产物的特异性等都有影响［13］。Mg2 +
浓度过低会造成 Taq DNA聚合酶效率低，使得产
物减少;Mg2 +浓度过高又会出现大量非特异性产
物，并且带纹模糊。本试验扩增结果见图 7，
Mg2 +浓度为 1. 3 ～ 3. 0 mmol·L －1时都能扩增出较
好的条带，随着浓度增加主条带亮度减弱，并且
出现非特异性扩增;3. 5 mmol·L －1时缺失一条主
条带。综合考虑，选择 1. 3，1. 5 及 1. 7 mmol·L －1
进行正交试验。
2． 4 正交优化
根据以上单因子优化的结果，从每个因子的
试验水平中选出 ＲAPD-PCＲ效果较好的三个浓度
梯度作为正交试验的因子水平(表 2)。正交试验
1—1. 3 mmol·L －1;2—1. 5 mmol·L －1;3—1. 7 mmol·L －1;4—
2. 0 mmol·L －1;5—2. 5 mmol·L －1;6—3. 0 mmol·L －1;7—3. 5
mmol·L －1。
图 7 ＲAPD反应中不同 Mg2 +浓度的比较
Fig． 7 Comparison among different Mg2 + concentrations
in the ＲAPD reaction system
设计见表 3，正交试验结果及分析见表 4 和图 8。
极差 Ｒ值决定了各个影响因子对 ＲAPD-PCＲ 的
影响程度，即:引物浓度 ＞ 模板 DNA 浓度 ＞
Mg2 +浓度 ＞ Taq DNA 聚合酶量 ＞ dNTPs 浓度。
以各个因子水平最高的平均值 K 来确定各因素
最佳浓度，若 K值相同则取较小浓度，因此小蓬
表 2 正交试验因子水平
Table 2 Level of orthogonal factors
水
平
因子
dNTPs/
(μmol·L －1)
模板DNA/
ng
Taq DNA
聚合酶/U
引物/
(μmol·L －1)
Mg2 + /
(mmol·L －1)
1 100 30 1. 0 0. 1 1. 3
2 150 40 1. 5 0. 2 1. 5
3 200 50 2. 0 0. 3 1. 7
图 8 ＲAPD-PCＲ反应体系正交设计的扩增结果
Fig． 8 The result of orthogonal design for ＲAPD-PCＲ
·176·刘济明，等．濒危竹种小蓬竹(Drepanostachyum luodianense)ＲAPD-PCＲ反应体系优化
表 3 ＲAPD-PCＲ正交试验设计 L18(35)
Table 3 Orthogonal design for ＲAPD-PCＲ L18(35)
试验组 dNTPs / (μmol·L －1) 模板 DNA / ng Taq DNA聚合酶 / U 引物 /(μmol·L －1) Mg2 + / (mmol·L －1) 打分
1 100 30 1. 0 0. 1 1. 5 3
2 100 40 1. 5 0. 2 1. 7 6
3 100 50 2. 0 0. 3 2. 0 5
4 150 30 1. 0 0. 2 1. 7 15
5 150 40 1. 5 0. 3 2. 0 4
6 150 50 2. 0 0. 1 1. 5 2
7 200 30 1. 5 0. 1 2. 0 10
8 200 40 2. 0 0. 2 1. 5 14
9 200 50 1. 0 0. 3 1. 7 13
10 100 30 2. 0 0. 3 1. 7 12
11 100 40 1. 0 0. 1 2. 0 9
12 100 50 1. 5 0. 2 1. 5 11
13 150 30 1. 5 0. 3 1. 5 8
14 150 40 2. 0 0. 1 1. 7 7
15 150 50 1. 0 0. 2 2. 0 7
16 200 30 2. 0 0. 2 2. 0 7
17 200 40 1. 0 0. 3 1. 5 1
18 200 50 1. 5 0. 1 1. 7 1
竹最优 ＲAPD体系为:dNTPs为 100 μmol·L － 1;
模板 DNA 量为 30 ng;Taq DNA 聚合酶为 1. 0
U;引物浓度为 0. 2 μmol·L － 1;Mg2 +浓度为 1. 5
mmol·L － 1。
表 4 正交试验结果分析
Table 4 Intuitive analysis of orthogonal design
结果 dNTPs 模板 DNA Taq DNA聚合酶 引物 Mg2 +
K1 7. 67 9. 17 8. 00 5. 33 6. 50
K2 7. 17 6. 83 6. 67 10. 00 9. 00
K3 7. 67 6. 50 7. 83 7. 17 7. 00
Ｒ 0. 50 2. 67 1. 33 4. 67 2. 50
3 讨论
ＲAPD技术对试验程序和条件比较敏感，易
受环境条件影响，导致重复性差［15 － 16］。但若保
证同样的 ＲAPD 流程、同样的试剂以及同一型号
的 PCＲ仪，亦有很好的重复性［17］。在竹类植物
的研究中，已经有何天友等［18］、邢新婷等［19］、王
波等［20］应用单因子试验方法分别对佛肚竹、麻
竹和筇竹进行了 ＲAPD 反应体系优化，在其他物
种中该方法得到了更为广泛的应用。但是，单因
子试验着重于研究各个影响因子对 ＲAPD 反应
的影响，忽略了各因子间的互相作用。为了弥补
这些不足，普晓兰等［21］、李华等［22］就用正交试验
方法对巨龙竹和云南箭竹进行 ＲAPD 体系优化。
相比于单因子试验，正交试验可以了解各个因子
之间的内在规律，能较快地找到最优体系及影响
扩增效果的主次要因子［23］。本试验先进行单因
子优化，选用单因子试验中效果好的因子水平进
行正交试验来筛选最优反应条件。这样避免了
各类影响因子之间的相互作用对扩增的影响，确
保了 ＲAPD 体系的各个因子水平更合理、更
科学。
ＲAPD体系中 dNTPs浓度过高会抑制酶的活
性及降低扩增特异性，浓度过低又会导致一些弱
带消失，一般采用 100 ～ 200 μmol·L －1［24］，本研
究中使用 dNTPs 为 100 μmol·L －1就可以获得稳
定、清晰、亮度高的条带。本试验中，模板 DNA
·276· 浙江农业学报 第 26 卷 第 3 期(2014 年 5 月)
的量在 30 ～ 60 ng 时都可以获得较为一致的效
果，为降低 TE 缓冲液中 EDTA 对反应体系中
Mg2 +的不良影响，应尽量降低模板 DNA 用量，综
合正交试验结果，本研究选择 30 ng的模板 DNA。
Taq DNA 聚合酶量受反应体系、酶活性、耐热性
等影响，用量过高会造成浪费及产生非特异性产
物;酶用量过低会降低扩增产物［25］。但在本研
究中，Taq DNA聚合酶用量为 1. 0，1. 5，2. 0，2. 5，
3. 0，3. 5 U时扩增效果差异不大，因此确定最佳
Taq DNA酶量为 1. 0 U。引物浓度一般在0. 2 ～
0. 5 μmol·L －1，过低不能扩增产物，过高则会有
引物自身连接的产物出现，本试验就出现了这种
现象。根据正交试验结果，最后确定最佳引物浓
度为 0. 2 μmol·L －1。Mg2 +是 Taq DNA 聚合酶的
激活剂，其浓度会影响酶的活性、PCＲ 合成的忠
实性、引物与模板的结合效率、扩增产物的特异
性、引物二聚体的形成、退火温度、模板与 PCＲ
产物双链的变性温度等很多方面［25］。一般 Mg2 +
用量为 1. 5 ～ 2. 0 mmol·L －1［26］。本研究的单因
素试验中，Mg2 +浓度为 1. 3 ～ 3. 0 mmol·L －1时，扩
增效果相差不大，其中 1. 7 mmol·L －1时扩增条带
数量和强度较大，但正交试验的结果是 Mg2 +浓
度为 1. 5 mmol·L －1时扩增效果最好，这是 Mg2 +
和 dNTPs存在螯合作用造成的，因此本试验确定
1. 5 mmol·L －1为最佳 Mg2 +浓度。
本试验最终确定小蓬竹最优 ＲAPD-PCＲ 反
应体系:20 μL反应体系，10 × PCＲ buffer为 1 /10
体积，dNTPs为 100 μmol·L －1，模板 DNA量为 30
ng，Taq DNA 聚合酶为 1. 0 U，引物浓度为 0. 2
μmol·L －1，Mg2 +浓度为 1. 5 mmol·L －1;其反应程
序为:94℃预变性 5 min，接着按照 94℃变性 1
min，35℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，进行 35 个循
环，然后 72℃延伸 7 min，最后 4℃保持。
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(责任编辑 张 韵)
·476· 浙江农业学报 第 26 卷 第 3 期(2014 年 5 月)