全 文 ：食品研究与开发 2008年1月第29卷第1期
基金项目:贵州省科技基金(黔科合J字[2005]2017号)
作者简介:王文平(1966-),女(汉),教授,在读博士,研究方向:天然
产物化学。
王文平 1,郭祀远 1,李琳 1,王明力 2,梁桂娟 2
(1.华南理工大学轻工与食品学院,广东 广州 510640;
2.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州 贵阳 550003)
考马斯亮蓝法测定野木瓜多糖中蛋白质的含量
摘 要:采用考马斯亮蓝染色法对野木瓜多糖中蛋白质含量进行测定,在波长 595nm处测定吸光度,实验表明标准
蛋白质在 1.67μg/mL~16.67μg/mL之间呈现良好的线性关系,该法简便迅速,灵敏度高、重现性好,是测定野木瓜多
糖中蛋白质含量的有效方法,并通过此法测得野木瓜多糖中蛋白质平均含量为12.17%。
关键词:野木瓜;多糖;蛋白质含量;考马斯亮蓝染色法
THEDETERMINATIONOFPROTEINCONTENTINPOLYSACCHARIDESFROMSTANUNTONIACHINENSIS
WITHCOOMASSIEBRILLIANTBLUEMETHOD
WANGWen-ping1,GUOSi-yuan1,LILin1,WANGMing-li2,LIANGGui-juan2
(1.ColegeofLightIndustryandFoodScience,SouthChinaUniversityofTechnology,
Guangzhou510640,Guangdong,China;2.GuizhouProvinceKeyLabaratoryofFermentationEngineering
andBiopharmary,Guiyang550003,Guizhou,China)
Abstract:ThecontentofproteinsinpolysaccharidesfromStanuntoniaChinensiswasdeterminedbythedying
methodwithcoomassiebriliantblue,measuringtheabsorbencyon595nm.Theresultshownthatthereisa
goodlinearityrelationbetweentheabsorbencyandthecontentofstandardproteinsintherangeof1.67μg/mL-
16.7μg/mL.Themethodissimpleandrapid,goodreproducibilityandsensitivity,especialysuitableforthede-
terminationofproteinscontentinpolysaccharidesfromStanuntoniaChinensis.Bythismethod,theaverage
contentofproteinsinpolysaccharidesis12.17%.
Keywords:StanuntoniaChinensis;polysaccharides;contentofproteins;dyingmethodwithcoomassiebriliantblue
野木瓜(StanuntoniaChinensis)是贵州省遵义正安
县独有的野生天然特产资源,属蔷薇科贴梗海棠灌木
丛植物。正安县野木瓜品质独具特色,具有果大、皮薄、
肉厚、肉质细嫩、味甘酸、气香等特点。木瓜在中医药学
中用途广泛,《中医大辞典》、《本草纲目》、《本草拾遗》
等著名医著都记载了木瓜具有舒筋活络,解渴生津、平
肝和胃、祛风除湿等功效,能治疗腰膝疼痛,脚气水肿,
痢疾霍乱,心痛腹痛等疾病,另外,还有镇咳、清暑利
尿、解酒祛痰等作用。现代研究表明,野木瓜含有丰富
的有机酸、果胶、蛋白质、多种氨基酸、多种维生素和多
种矿物质[1]。
多糖是野木瓜中有效成分之一,野木瓜粗多糖中
含有多种杂质,影响其多糖纯度最主要的物质为杂蛋
白。如何快速,简单,准确地对其中的蛋白质含量进行
检出,无疑将直接影响着野木瓜多糖的纯化效率和开
发应用。蛋白质作为一项质量和资源评价的重要指标,
其含量必需明确,故探索测定野木瓜多糖的蛋白质含
量方法有重要的意义。目前关于野木瓜多糖中蛋白质
含量的测定方法还鲜有报道,本实验采用考马斯亮蓝
G-250染色法对野木瓜多糖中蛋白质含量进行测定,
与其它方法相比,该法简单、迅速,且相对较为准确,是
测定野木瓜多糖中蛋白质含量的有效方法。
1 主要材料、仪器设备及原理
1.1 主要材料
野木瓜:贵州遵义天楼野木瓜有限公司提供;野木
瓜多糖:本实验室自制;牛血清白蛋白:进口分装,Sigma
公司;考马斯亮蓝 G-250:进口分装,中国医药集团上
海化学试剂公司;其它试剂均为国产分析纯试剂。
检测分析
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食品研究与开发2008年1月第29卷第1期
1.2 仪器设备
HH·SH-Z型电热恒温水浴锅:北京长安科学仪器
厂;ZK-828型电热真空干燥箱:上海跃进医疗器械厂;
DWF-180型电动植物粉碎机:河北省黄骅市科研器材
厂;SL2000电子天平:澳豪斯公司;UV2550紫外可见
分光光度计:岛津公司;N-1000V-WB旋转蒸发仪:日
本东京理化器械株式会社;DL-5型离心机:上海安亭
科学仪器厂。
1.3 实验原理
蛋白质分子均具有酰胺基团,棕红色的考马斯亮
兰G-250染料上的阴离子与蛋白质的酰胺结合,使溶
液变为蓝色,其最大吸收峰也由465nm变为 595nm,
蛋白质在1μg~1000μg范围内,蛋白质与色素物质结
合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,
故可用于测定蛋白质含量[2]。
2 方法
2.1 蛋白质标准溶液的制备
精确称取牛血清白蛋白 10.00mg,用少量蒸馏水
溶解定容至 100mL,即为 0.1mg/mL蛋白质标准液,
4℃~5℃冰箱中保存。
2.2 考马斯亮蓝G-250溶液的制备
精密称取考马斯亮蓝G-250100.00mg加入95%
乙醇 50mL,再加入 85%磷酸 100mL,最后用蒸馏
水定容至 1000mL,最终试剂含 0.01%考马斯亮蓝
G-250,4.7%乙醇,8.5%磷酸,置于棕色瓶中备用[3]。
2.3 供试品溶液的制备
精确称取野木瓜多糖100.00mg,加蒸馏水溶解定
容至100mL,即为1mg/mL供试品溶液。
2.4 标准曲线的制作
分别精密吸取标准蛋白质溶液 0.0、0.1、0.2、0.3、
0.4、0.5、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0mL于10mL具塞试管中,
各管加水至1mL,加入考马斯亮蓝 G-250溶液 5mL,
混匀,放置10min[3],于595nm处测定其吸光度。
2.5 样品中蛋白质含量的测定
取供试品溶液各 1mL,同时做三个重复,以空白
试剂为参比,按上述标准曲线的测定法,分别测定其吸
光度值,计算样品中蛋白质的含量。
3 结果
3.1 标准曲线回归方程建立
用紫外分光光度计,以试剂空白参比,在595nm波
长处测定对照品溶液吸光度。
以吸光度为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘制标
准曲线见图1。
得其线性回归方程式 Y=0.00635X+0.15735,
R2=0.99859,相关系数r=0.9993,表明蛋白质在1.67μg/mL
~16.67μg/mL范围内很好地符合郎伯-比尔(Lamber-
Beer)定律。
3.2 样品蛋白质含量测定结果
按上述蛋白质含量测定方法,同时做三个重复,经
测定吸光度值分别为0.290、0.282、0.286,计算得野木
瓜多糖中蛋白质含量分别为12.57%、11.77%、12.17%
平均含量为12.17%。
3.3 稳定性实验
取同一供试品溶液1mL,每隔10min测定1次,
观测其稳定性,结果表明在显色60min时间内吸光度
稳定性较好,结果见表1。
3.4 精密度实验
精密吸取标准溶液(100μg/mL)0.5mL进行精密
度试验,连续进行6次测定其吸光度,得RSD=0.58%,
小于5%,表明精密度好,结果见表2。
3.5 重现性实验
精密吸取来自同一批原料的试样,按样品测定方
法,分别测定其吸光度,检验该测定方法的重现性,
得 RSD=2.37%,小于 5%,表明重复性较好,结果见
表 3。
图1 蛋白质标准曲线
Fig.1 Thestandardcurveoftheproteins
10
0.278
20
0.282
30
0.279
40
0.275
50
0.273
时间Time/min
吸光度A
60
0.272
表1 稳定性实验结果
Table1 Theresultofstabilityexperimentation
1
0.542
2
0.547
3
0.546
4
0.550
5
0.551
样品号Samplenumber
吸光度A
6
0.543
RSD/%
0.58
表2 精密度实验结果
Table2 Theresultofprecisionexperimentation
检测分析
116
食品研究与开发 2008年1月第29卷第1期
表3 重现性实验结果
Table3 Theresultofreproducibilityexperimentation
1
0.219
2
0.221
3
0.226
4
0.229
5
0.216
样品号Samplenumber
吸光度A
平均
0.222
RSD/%
2.37
胶原蛋白是动物所有结缔组织、皮、腱、韧带软骨 等的主要蛋白成分[1],广泛应用于医药、化妆品、食品、
饲料等工业中。胶原蛋白含有大量的甘氨酸,脯氨酸,
羟脯氨酸,羟赖氨酸等,其中羟脯氨酸(Hydroxyproline,
以下简称 Hyp)和羟赖氨酸在其它蛋白中很少见[2],为
3.6 回收率实验
精密吸取已配制的 1mg/mL供试品溶液 0.5mL,
分别加入 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的蛋白质标准溶液,
按样品测定方法,分别测定其吸光度,计算回收率,结果
见表4,样品平均回收率均为100.99%,RSD为2.01%,
表明本法可行。
4 结论
通过实验可知,蛋白浓度在 0.1mg/mL~1.0mg/mL
范围内,用考马斯亮蓝比色法测定野木瓜多糖中蛋白
质的含量,该法准确率较高,重复性较好,据有关资料
表明优于其他方法[4-5],并且此法简便灵敏,对设备要求
较低,适宜于野木瓜多糖中蛋白质的含量测定。
参考文献:
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[2] 路苹,于同泉,王淑英,等.蛋白质测定方法评价[J].北京农学院学
报,2006,21(2):65-68
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含量[J].中国交通医学杂志,2006,20(2):159-160
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法的比较研究[J].中国食用菌,2003,22(1):27-30
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中国生化药物杂志,2003,24(2):78-80
收稿日期:2007-04-28
表4 回收率实验结果
Table4 Theresultofrecoveryrateexperimentation
回收率/%
Recoveryrate/%
98.85
104.06
101.18
101.25
99.63
加入量/μg
Addition/μg
10
20
30
40
50
平均/%
Averagevalue/%
100.99
样品含量/μg
Samplecontent/μg
10.261
10.261
10.261
10.261
10.261
RSD/%
2.01
户业丽 1,程波 1,吕中 1,陈飞 1,李智涛 1,丁强 1,蓝泽桥 2
(1.武汉工程大学绿色化工过程省部共建教育部重点实验室,湖北 武汉 430074;
2.湖北天峡鲟业有限公司,湖北 宜都 443300)
人工养殖鲟鱼皮中羟脯氨酸含量的测定
STUDYONDETERMINATIONOFHYDROXYPROLINEINTHESKINOFFARMEDSTURGEON
HUYe-Li1,CHENGBo1,LVZhong1,CHENFei1,LIZhi-tao1,DINGQiang1,LANZe-qiao2
(1.KeyLaboratoryforGreenChemicalProcessofMinistryofEducation,WuhanInstituteofTechnology,
Wuhan430074,HuBei,China;2.HubeiTianxiaSturgeonCompany,Yidu443300,Hubei,China)
Abstract:HydroxyprolinecontentintheskinoffarmedSturgeonwasdeterminedandhydrolysistechnologyof
theskinoffarmedSturgeonwasstudied.Asaresult,thehydroxyprolinecontentwas0.693%intheskinof
farmedSturgeon,theoptimalhydrolysisconditionofSturgeonskinwasgiven:6mol/LHCl,110℃,24h.
Keywords:Sturgeon;photocolorimetricmethod;hydroxyproline;colagen
摘 要:采用比色法对人工养殖鲟鱼皮中羟脯氨酸进行测定,并对鲟鱼皮的水解工艺进行了研究,结果表明:鲟鱼皮
中羟脯氨酸含量为0.693%;鲟鱼皮水解的最佳工艺为:6mol/LHCl、110℃、24h。
关键词:施氏鲟鱼;比色法;羟脯氨酸;胶原蛋白
基金项目:湖北省基础化学示范中心资助
作者简介:户业丽(1963-),女(汉),副教授,硕士,主要从事医药中
间体的合成、中草药活性成分的分离、纯化等工作。
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
测得总量/μg
Detectedvalue/μg
20.146
31.073
40.615
50.762
60.078
检测分析
117