全 文 ：墓头回提取物诱导 K562细胞凋亡的实验研究
程卫东　李　立
　程卫东 ,男 ,副教授 、硕士生导师
(兰州大学中西医结合研究所　甘肃 730000)
摘要:目的　探讨墓头回提取物体外抗白血病作用 ,为墓头回提取物抗肿瘤活性单体的筛选提供理论
依据。方法　采用MTT法测定墓头回对 K562细胞的增殖抑制率 ,计算出 IC50值;台盼蓝拒染法 、流式
细胞仪 PI染色观察墓头回对 K562细胞的促凋亡活性 ,用免疫细胞化学法检测墓头回对凋亡相关基
因 bcl-2和 bax蛋白表达的影响 。结果　墓头回对 K562细胞增殖具有明显的抑制作用 ,且在一定的
剂量范围内其抑制作用具有明显的剂量依赖性 , IC50为 36. 03 mg /L。墓头回作用于 K562细胞后 ,倒
置显微镜下可见典型的凋亡细胞的形态学特征。流式细胞仪检测结果显示 ,实验组细胞凋亡率明显
高于对照组 ,与对照组相比差异显著 (P <0. 05)。结论　墓头回作用于 K562细胞 ,可以明显抑制
K652细胞增殖。此外 ,诱导 K562细胞凋亡可能是其发挥抗肿瘤作用的机制之一。
关键词:墓头回;K562细胞;细胞凋亡;凋亡蛋白
中图分类号:R285. 5
Inductive effect of diversifolious patr in ia root extract on K562 cells
apoptosis
CHENG Wei-dong, LI Li
(Institute of Integ ra ted Chine se andW esternM ed icine, Lanzhou University, G ansu　730000)
Abstract:objec tive　 to investiga te the effects and mechanism o f diversifo lious patrinia root (DPR)
ex tract on pro life ration and apoptosis o f K562 cells to offer expe rimenta l data for sc reening bioactive
componen ts from DPR. Methods　MTT method w as used to detect inhibition ra tio to K562 proliferation
and IC50. The morpho log ica l charac te ristics o f apoptosis ce lls w ere obse rved by trypan b lue sta in. The
apoptosis ratio and cell cy cle o f K562 w ere measured by flow cy tometry (FCM ). The expression o f
apoptosis re lated pro te in bc l-2 and bax w ere de term ined by immunocy tochem istry. Results　DRP extract
obv iously inh ib ited the p ro life ra tion o fK562 ce lls in a does-dependen tmanner in the definite dose range,
and the IC50 w as 36. 03 mg /L. The typicalmorpho log ica l charac teristics of apoptosis ce lls cou ld be seen
unde r the invertedm icroscope. The apoptosis rates in the treatment g roups w ere significan t higher than
that in the contro l g roup (p <0. 05). The expression of bcl-2 pro tein w as down - regu lated, and the
expression o f bax pro tein w as up-regu lated afterK562 ce llsw ere treated by DRP extract for 48 h, and the
diffe rences betw een the treatment g roup and the contro l group w ere significan t(p<0. 05). Conclusion　
DRP extract can inh ib it the pro lifera tion and induce the apoptosis o fK562 ce lls, whichm ay be one o f the
mechanism s of an ti-tumo r e ffect of i.t
Key words:dive rsifolious patrinia roo t;K562 ce lls;apop tosis;apoptosis re lated p ro tein
51
第 30卷第 1期 2007年 1月
Vo .l 30 No. 1 Jan. 2007
　 　 北京中医药大学学报
Journal o f Be ijing Unive rsity o f T raditiona l Chine seM edic ine
　　联合化疗是目前肿瘤内科治疗的常用手段 ,
但迄今用于临床的化疗药物多具有较大的不良
反应 ,主要是对骨髓造血功能的抑制 ,产生多种
并发症 , 从而导致治疗失败 。因此 , 寻求高效低
毒的抗肿瘤药物是目前肿瘤治疗的主要任务之
一 。墓头回是败酱科植物异叶败酱 (Pa trin ia het-
erophy lla bunge. )的根及根茎 , 具有清热解毒 、消
痈散结之功效 。现代药理学研究证明墓头回有
广泛的药理活性 , 可抗炎抑菌 、镇静 、止血 ,治疗
瘰疬瘿瘤 、肠痈肿痛 ,是一种具有开发价值的抗
肿瘤中药 [ 1] 。本研究以人白血病细胞系 K 562细
胞为靶细胞 ,研究墓头回经醇提和大孔树脂梯度
洗脱法制成粗提物对诱导 K562凋亡的可能机
制 ,为进一步寻找墓头回治疗肿瘤的生物活性成
分提供实验依据 。
1　材料
1. 1 细胞株
人慢性粒细胞白血病 (CML)细胞系 K562细胞
株购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库 。
1. 2　试剂与仪器
鼠抗人 bcl-2单抗和 bax单抗及即用型 SABC
免疫组化染色试剂盒为武汉博士德生物工程有限公
司产品 。 DAB显色试剂盒(H istosta in-p lus DAB K it)
西安晶美生物工程有限公司产品。 RPM I 1640培养
基为 G ibco公司产品 ,噻唑蓝(MTT)、RN ase A、碘化
丙啶 (PI)为 sigm a公司产品 ,流式细胞仪为美国
Beckman Coulter公司产品。
1. 3 药品
墓头回为 2005年 10月采自甘肃省庆阳地区异
叶败酱的根 ,经本校药物化学教研室鉴定 。墓头回
提取物为中国科学院西北高原生物研究所提供 ,以
双蒸水稀释配成工作原液 ,使用时 0. 22 μm孔径滤
膜过滤除菌 。阿霉素为上海第十二制药厂生 ,批号
020198。
2　方法
2. 1 细胞培养
K562细胞培养于含 10%灭活(56 ℃, 30 m in)小
牛血清的 RPM I 1640培养液中 ,培养液含 NaHCO3
2. 0 g /L、青霉素 100 U /mL、链霉素 100 U /mL。置于
37℃、5% CO 2培养箱内培养。
2. 2　MTT比色法测定药物的细胞增殖抑制作用
参照文献 [ 2] ,取对数生长期 K562细胞 ,用含
10%小牛血清的 RPM I 1640培养液配成 1×108 L -1
单细胞悬液 ,然后分别加入实验药物接种至 96孔板
中 ,终体积为每孔 100 μL,每组设 4个平行孔。实
验分为 4组 ,加药组:加入墓头回提取物 ,终质量浓
度为 6. 3、12. 5、25、50、100、200mg /L;阳性对照组:
加入阿霉素 , 终 质量浓度分 别为 2. 5、 5. 0、
10.0 mg /L;阴性对照组:加入等体积的培养液;空白
对照组:加入等体积的相应含细胞无药物培养液。
置 37℃、5%CO2培养箱中培养 24、48、72 h后 ,每孔
加入 MTT溶液(5 g /L)10μL,在相同条件下继续培
养 4 h后 ,每孔加入 10%酸化的十二烷基磺酸钠
(SDS)100 μL终止培养 , 37 ℃过夜 ,然后室温下在
微量振荡器上振荡 10 m in,酶标仪检测 570 nm波长
处的吸光度(A)值 ,由下列公式计算细胞增殖抑制
率。以上实验各重复 3次 ,求平均值 。计算 IC50值 ,
利用概率单位法求得。
细胞增殖抑制率 =(1 -A实验 /A空白 )×100%
2. 3　墓头回诱导 K562细胞凋亡的检测
2. 3. 1　细胞形态观察:分别取加药组及对照组作用
24、48、72 h的 K562细胞 ,先在倒置显微镜下观察
细胞形态;然后从对照组及加药组各取样 90 μL移
入小试管中 ,加 10 μL 0. 4%台盼蓝染液混匀 ,用血
细胞计数板普通显微镜下观察细胞染色情况 。
2. 3. 2　流式细胞仪检测细胞凋亡:将经墓头回提取
物处理 48 h及对照组的 K562细胞 ,分别收集于离
心管中 , 1 000 r /m in离心 5 m in,弃上清液 ,用 PBS
缓冲液洗 2次 , 75%冷乙醇固定 , 4 ℃过夜 ,染色前
PBS洗 3次 ,经 400目筛网滤过后 ,加入 RN aseA至
终质量浓度为 20 mg /L,碘化丙啶 (PI)至终质量浓
度为 50mg /L,在 4 ℃下避光染色 20 m in,染色后以
流式细胞仪测定细胞 DNA水平 ,并用 Mu lticyc le软
件分析。
2. 3. 3　免疫细胞化学法检测凋亡相关基因蛋白的
表达:将玻片在 10%倍稀释的多聚赖氨酸中浸泡
5m in,干燥过夜 ,将经墓头回提取物处理 48 h及空
白对照组的 K562细胞分别收集于离心管中 ,采用
SABC法按免疫组化染色试剂盒操作说明进行 ,鼠
bcl-2和 bax单克隆抗体按 1∶100稀释 ,空白对照以
PBS代替一抗 。结果根据染色强度和阳性细胞数进
行半定量分析 ,在高倍视野下随机记数 100个细胞 ,
计算阳性细胞百分比 ,以 5张玻片的平均值代表该
组的阳性细胞百分率。
2. 4　统计方法
统计分析采用 SPSS 12. 0统计软件处理 ,实验
数据结果均以 –x ±s表示 ,多组均数比较用单因素方
差分析 ,方差不齐时 ,进行变更转换。加药组与对照
52 北京中医药大学学报　 　 　 　　　　　　　　　　　　　　第 30卷
组凋亡率及凋亡基因蛋白表达的比较采用 t检验。
3　结果
3. 1 墓头回对 K562细胞增殖的抑制作用
各质量浓度墓头回提取物对 K 562细胞的增
殖有较强的抑制作用 ,与空白对照组比较有显著
性差异 (P <0. 05),且在一定剂量范围内随墓头
回质量浓度的增加 ,其抑制率越来越高 ,具有明
显的剂量依赖性 ,求得 IC50为 (36. 03 ±3. 58) g /
mL。结果见表 1。
表 1 墓头回对 K562细胞增殖的抑制作用(–x±s)
组别 剂量 /(m g /L)
24 h
吸光度 抑瘤率 /%
48 h
吸光度 抑瘤率 /%
72 h
吸光度 抑瘤率 /%
阴性对照组 0. 083±0. 029 0 0. 094±0. 031 0 0. 115±0. 015 0
空白对照组 0. 663±0. 014 0 1. 283±0. 016 0 1. 453±0. 078 0
阿霉素组 2. 5 0. 351±0. 043 47. 05 0. 309±0. 002 75. 91 0. 256±0. 063 82. 38
5. 0 0. 126±0. 011 80. 99 0. 105±0. 036 91. 81 0. 069±0. 021 95. 25
10. 0 0. 082±0. 005 87. 63 0. 051±0. 034 96. 02 0. 028±0. 010 98. 07
墓头回提取物组 6. 3 0. 443±0. 013 33. 24 0. 727±0. 021* 43. 33 1. 117±0. 066 23. 15
12. 5 0. 443±0. 006 33. 24 0. 709±0. 008* 44. 73 1. 124±0. 044 22. 58
25. 0 0. 432±0. 004 34. 25 0. 662±0. 075* 48. 40 1. 089±0. 061 25. 26
50. 0 0. 430±0. 026 34. 63 0. 572±0. 029* 55. 42 0. 845±0. 021 44. 13
100. 0 0. 352±0. 020 49. 40 0. 509±0. 006* 60. 33 0. 723±0. 033 53. 57
200. 0 0. 271±0. 005 64. 67 0. 269±0. 012* 79. 03 0. 236±0. 005 91. 28
　　注:与空白对照组比较*P <0. 05
3. 2　墓头回诱导 K562细胞凋亡
3. 2. 1　K562细胞形态学观察:经墓头回提取物处
理的 K562细胞与未经处理的 K562细胞比较 ,在形
态学上发生显著的变化 ,倒置显微镜下观察 ,对照组
细胞体呈圆形 ,结构完整 ,胞浆透亮 ,细胞悬浮生长 ,
核大而圆且位于细胞中央。而墓头回提取物处理
24 h后 ,细胞体积变小 ,细胞形态发生改变 ,呈椭圆
形 、胞浆透明度下降 ,颗粒感增强 ,细胞密度下降 ,可
见细胞碎片 ,且随着作用时间延长 ,视野中的正常细
胞减少 ,形成许多彼此团成簇的台盼蓝拒染的凋亡
小体。
3. 2. 2　流式细胞术分析细胞凋亡:墓头回 50 mg /L
作用于 K562细胞 48 h后以流式细胞仪分析细胞
DNA水平直方图 ,可见典型的 DNA水平小于二倍体
的亚 G 1凋亡峰 ,凋亡率为 (17. 15±1. 24)%,较对照
组细胞凋亡率(2. 05±0. 53)%增高(P <0. 05)。
3. 2. 3　凋亡相关基因蛋白表达:结果见表 2。可见
50 mg /L墓头回处理 K562细胞 48 h , bc l-2蛋白表
达减弱 ,而 bax蛋白表达增强 ,对照组与加药组间差
异显著 (P <0. 05), blc-2与 bax蛋白主要分布在基
质和核膜周围 ,细胞浆上有棕黄色或棕褐色颗粒着
色为阳性特征。
表 2 墓头回处理 K562细胞 48 h后 bcl-2
及 bax蛋白的表达(%;–x±s)
组别 剂量 /(m g /L) bcl-2阳性率 bax阳性率
空白对照组 100 46. 33±2. 77 28. 67±1. 30
墓头回提取物组 50 32. 20±1. 80* 33. 45±0. 92*
　　注:与空白对照组比较*P <0. 05
4　讨论
据报道 , CML是一种进展性造血干细胞的克隆
性疾病 ,临床上表现为髓系的恶性扩增[ 3] 。其 9号
染色体长臂上的 abl与 22号染色体长臂上的 bcr基
因交互易位构成 Ph染色体 ,产生 bcr-abl融合基因 ,
表达 P210蛋白 ,有很强的酪氨酸激酶活性 ,常被用
于 CML的体外研究 。蛋白质磷酸化是调节真核细
胞增殖和分化的主要环节 ,大部分蛋白质磷酸化是
在蛋白激酶催化下进行的。受体酪氨酸酶与配体结
合后 ,通过本身和底物蛋白酪氨酸残基的磷酸化为
下游信号分子所识别 ,导致信号传导异常 ,造成细胞
增殖失控而发病 。本实验用 MTT实验首次观察了
墓头回提取物对 K562细胞增殖的影响 ,结果表明 ,
墓头回提取物具有很强抑制 K562细胞增殖的作
用。但是墓头回提取物是否通过抑制酪氨酸激酶的
活性而抑制 K562细胞增殖 ,尚需进一步研究;倘若
如此 ,墓头回有望成为新的抗肿瘤药物 。
(下转第 57页)
53 第 1期 程卫东等　墓头回提取物诱导 K562细胞凋亡的实验研究
精密吸取各供试品溶液 20 μL,注入液相色谱仪 ,测
定色谱峰峰面积 ,外标一点法计算人参皂苷 Rg1 、人
参皂苷 Rb1及三七皂苷 Rg1的含量 。结果见表 2。
表 2 有效部位样品含量测定结果(%;n =3)
批次 人参皂苷 Rg1含量 RSD
三七皂苷 R1
含量 RSD
人参皂苷 Rb1
含量 RSD
1 4. 14 1. 43 1. 01 1. 71 5. 63 1. 31
2 4. 05 0. 47 1. 01 1. 05 5. 50 1. 63
3 5. 75 1. 62 0. 81 0. 88 5. 69 1. 12
2. 10. 2 三七药材样品含量测定:精密称取 3批不
同产地的三七药材样品各 3份 ,按三七药材样品制
备方法项下制备供试品溶液。分别精密吸取各供试
品溶液 20 μL,注入液相色谱仪 ,测定色谱峰峰面
积 ,外标一点法计算人参皂苷 Rg1 、人参皂苷 Rb1及
三七皂苷 Rg1含量。结果见表 3。
表 3 三七药材样品含量测定结果(%;n =3)
批次 人参皂苷 Rg1含量 RSD
三七皂苷 R1
含量 RSD
人参皂苷 Rb1
含量 RSD
1 2. 34 1. 25 0. 56 1. 02 2. 26 1. 37
2 2. 33 1. 28 0. 50 0. 38 2. 21 1. 59
3 2. 72 0. 89 0. 49 1. 84 2. 23 0. 82
3 讨论
通过 3批有效部位及 3批药材中人参皂苷
Rg1、人参皂苷 Rb1及三七皂苷 R1含量测定结果表
明 ,采用 HPLC方法 ,在本文建立的色谱条件下 ,样
品中 3种成分与其他成分分离良好 ,方法简便快速 ,
结果准确可靠 ,可作为其质量控制方法之一 。
参考文献:
[ 1] 中华人民共和国药典委员会. 中华人民共和国药典:一
部 [M ] . 2005版.北京:化学工业出版社 , 2005:10 - 11.
[ 2] 梁 宁 ,赵怀清 , 周迎春 , 等. H PLC法同时测定三七总
皂苷中人参皂苷 Rg1与 Rb1的含量 [ J] . 中草药 , 2002, 33
(8):704 -705.
[ 3] 黄新生.高效液相色谱法测定人参茎叶浸膏及人参根中
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175.
[ 4] 黄永焯 ,王宁生. HPLC-ELSD法测定复方丹参滴丸中人
参皂苷 Rg1、 Rb1 和三七皂苷 R1的含量 [ J] . 中药新药
与临床药理 , 2002, 13(3):174 -176.
(收稿日期:2006-07-03)
(上接第 53页)
　　本研究发现 ,墓头回抑制 K562细胞的生长是
通过诱导 K 562细胞凋亡而发挥作用的 ,表现为墓
头回提取物作用于 K562细胞一定时间后台盼蓝染
色拒染 ,表明其细胞膜完好 ,为非坏死细胞 ,倒置显
微镜下可见细胞体积变小 ,细胞形态发生改变 ,最后
形成膜包小体。流式细胞仪分析可见 K562细胞经
墓头回提取物处理 48 h后 ,在 DNA直方图上 ,可见
明显的亚二倍体凋亡峰。以上结果表明 ,诱导肿瘤
细胞凋亡是墓头回抗肿瘤作用机制之一。
bc l-2基因家族是调节细胞凋亡的主要基因 。
这一家族表达蛋白分子都含有两个与 bcl-2蛋白同
源的结构域 ,形成各种同源二聚体和异源二聚体 ,从
而产生对细胞凋亡之不同的调节作用 ,而 bax作为
其家族成员之一 ,又常与 bc l-2形成异源二聚体 ,抑
制 bc l-2的促细胞生长功能 。因此认为细胞内的
bax与 bcl-2含量之比决定该细胞受刺激后的生存
与凋亡 [ 4] 。本研究结果显示 ,墓头回提取物可导致
bc l-2蛋白表达减弱及 bax蛋白表达增强 ,这可能是
墓头回诱导 K562细胞凋亡的原因之一 。
综上所述墓头回提取物具有较强的抗肿瘤作用 ,
其发挥抗肿瘤作用的机制之一在于诱导肿瘤细胞凋
亡。本实验仅探讨了墓头回提取物在体外对 K562细
胞增殖及对 K562细胞凋亡的影响 ,其在体内对细胞
凋亡的影响尚不清楚 ,其抗肿瘤作用的分子机制还有
待于进一步研究。此外 ,本实验目前仅用墓头回粗提
物进行了抗白血病和诱导细胞凋亡的探讨 ,今后还有
待于分离鉴定抗肿瘤的活性单体 ,并在单体水平上进
一步对墓头回的作用机制进行较深入的探讨 ,以便将
其开发成抗肿瘤新药用于临床治疗 。
参考文献:
[ 1] 刘　圣 ,周书明. 墓头回研究进展 [ J] .中国中医药信息
杂志 , 1997, 4(2):6
[ 2] 司徒镇强 ,吴军正. 细胞培养 [ M ] . 西安:世界图书出版
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[ 4] 汤钊酋.现代肿瘤学 [M] .上海:复旦大学出版社 , 2003:151.
(收稿日期:2006-06-19)
57 第 1期 陈玉平等　HPLC法测定清脑宣窍方有效部位中人参皂苷 Rg1 、Rb1及三七皂苷 R1的含量