全 文 ：Research Paper 研究报告
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
49(4):0498-0503;4 April 2009
ISSN 0001-6209;CN 11-1995 Q
http: journals.im.ac.cn actamicrocn
基金项目:国家自然科学基金(30670218)
＊通信作者。 Tel:+86-28-84480650;E-mail:wwwyiding@163.net
作者简介:程媛媛(1981-),女 ,山西太原人 ,硕士 ,研究方向为微生物化学与分子生物学。 E-mail:chengyuanyuan910@163.com
收稿日期:2008-12-13;修回日期:2009-01-07
华重楼内生菌抗菌肽的分离纯化及其特性
程媛媛 ,雍彬 ,张超 ,刘强 ,严伟 ,王一丁＊
(四川师范大学生命科学学院 , 成都 610068)
摘要:【目的】华重楼内生菌PCE45具有较强的抗菌活性 ,本文将对 PCE45产生的抗菌物质进行分离纯化和
性质分析报道。【方法】PCE45 发酵液经硫酸铵盐析 、丙酮沉淀 、SephadexG75 柱 、DE52 纤维素柱和
SephadexG25凝胶柱纯化分离得到抗菌肽 PCP-1。【结果】稳定性测试表明该抗菌肽对蛋白酶不敏感 ,对高温 、
强酸 、强碱有较好的耐受性 ,可造成稻瘟病菌菌丝畸形并抑制孢子萌发 。抑菌谱表明该抗菌肽对玉米弯孢
病菌等真菌和大肠杆菌等细菌有较强的抑菌效果 。质谱测得其分子量为 1058.3。氨基酸组成分析表明该
小肽主要由7种氨基酸组成 。茚三铜反应呈阴性 ,酸水解后 ,茚三酮反应和双缩尿反应呈阳性。【结论】根据
茚三酮反应和双缩尿反应结果推测 PCP-1可能为低分子量的环状小肽。这是首次关于华重楼内生菌抗菌肽
的研究报道。
关键词:华重楼;内生菌;抗菌肽;纯化
中图分类号:Q816 　　文献标识码:A　　文章编号:0001-6209(2009)04-0498-06
　　重楼是一类极具药用价值的植物 ,化学成分复
杂 ,药理活性强 。临床应用广 ,具有清热解毒 、消肿
止痛 、凉肝定惊 、止血 、祛痰和抑菌等功效 。但由于
重楼自然繁殖率很低 ,生长周期长以及市场需求的
不断扩大 ,导致重楼资源匮乏 ,供需矛盾突出 。
药用植物内生菌的研究表明 ,其内生菌不但可
以自身合成药物活性成分 ,还具有促进宿主植物合
成活性成分的能力。例如 Stierle 从短叶红豆杉
(Taxus breviflia)中分离得到能合成抗癌物质紫杉醇
的内生真菌(Taxomyces andreanae)[ 1] ,江东福等在内
生菌和龙血树血竭形成关系的研究中 ,发现内生菌
对龙血树血竭形成具有很强的促进作用[ 2] 。
目前 ,国内学者主要着重于滇重楼的繁殖技术 、
提取工艺和化学成分的研究[ 3-5] ,现已从重楼属植
物中分离出 50多种化合物 ,主要成分为皂甙[ 6] ,但
对华重楼尤其是其内生菌的研究较少。在重楼的驯
化和组织培养没有取得突破性进展的情况下 ,利用
重楼内生菌寻找新型可再生替代资源成为解决重楼
资源短缺 、确保重楼药材供应 、保护重楼野生资源和
保障名贵中成药质量的一条新途径 。2005年赵明
等筛选出产甾体皂甙的华重楼内生菌[ 7-9] ,尚没有
关于华重楼内生菌抗菌肽的研究报道 。本实验前期
工作中从华重楼根状茎中分离出一株具有较强抗菌
活性的细菌 PCE45 , 本文将对该菌产生的抗菌肽
PCP-1的分离纯化及特性的研究做报道。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　供试菌种:华重楼内生菌 Paris polyphylla
var.chinensis PCE45由本实验室分离得到。病原指
示菌:稻瘟病菌 Pyricularia oryzae Cav 、松赤枯病菌
Pestalotiopsis funerea 、玉米纹枯病菌 Rhizoctonia solani
DOI :10.13343/j .cnk i.wsxb.2009.04.002
Kuha、玉米弯孢病菌 Curvularia lunata (Walk)Boed 、
小麦赤霉病菌 Fusarium graminearum Schw 、绿色木霉
Trichoderma viride 、油菜病核菌 Sclerotinia sclerotiorum 、
镰刀霉菌 Fusarium sp.、冬瓜枯萎病菌 Fusarium
oxysporum 、苹果轮纹病菌 Physalospora piricola 、绿色粘
帚霉 Gliocladium viriens 、球孢 白 僵菌 Beauveria
bassiana 、大肠杆菌 Escherichia coli 、金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus 、枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 、
白色念珠菌 Candida albicans ,由本实验室保存。
1.1.2　培养基:马铃薯培养基 (土豆 200 g , 葡萄糖
18 g , 水 1000 mL ,自然 pH), 牛肉膏蛋白胨培养基
(牛肉膏 10 g , 蛋白胨 10 g , NaCl 5 g , 水 1000 mL ,
pH 7.2)
1.1.3　主要试剂与仪器:DE52 纤维素(Whatman),
SephadexG75(Amersham Biosciences), Sephadex G25
(Pharmacia),蛋白酶 K(Amresco), 高速冷冻离心机
(Beckman),AKTA purifier100层析系统(GE),紫外分
光光度仪 UV-1700(Shimadzu),傅里叶变换红外光谱
仪Nexus670(Nicolet),质谱仪 BioTOFQ(Bruker),氨基
酸分析仪 L-8800(Hitachi),显微镜(Nikon)。
1.2　粗提液的制备
将PCE45接种于发酵培养基 48 ～ 72 h , 37℃摇
床培养 ,发酵液离心后除菌体(4800 ×g ,30 min),上
清液采用硫酸铵沉淀法 ,分别制备30%～ 40%、40%
～ 50%、50%～ 60%、60%～ 70%、70%～ 80%盐析
液 ,4℃静止过夜。离心弃上清(19200 ×g , 10 min),
沉淀物用适量磷酸缓冲液(10 mmol L Na2HPO4-
NaH2PO4 ,pH7.2)充分溶解 ,取溶解液加入 2 倍的
-20℃丙酮 , -20℃静置 2 ～ 3 h ,离心去杂质(19200
×g ,10 min),上清液经过旋转蒸发除去丙酮 ,透析
冷冻干燥浓缩后得到粗提液 。采用管碟法[ 10] 检测
抑菌圈大小 ,确定最佳硫酸铵饱和度。
1.3　抗菌肽的分离纯化
1.3.1　SephadexG75层析:将预处理的 SephadexG75
用10 mmol L NaCl(Tris-HCl缓冲液 , pH8.5)平衡装
柱(10 mm ×700 mm),取粗提液上样 ,用 100 mmol L
NaCl(Tris-HCl缓冲液(pH8.5)洗脱 ,流速为0.5 mL min ,
同时在 215 nm 、245 nm、280 nm处检测收集活性组分 ,
冷冻浓缩后供进一步纯化 。
1.3.2　DEAE52纤维素层析:将预处理的 DEAE52
纤维素用 100 mmol L NaCl(Tris-HCl缓冲液 , pH8.5)
平衡装柱(10 mm×200 mm),取以上活性组分上样 ,
用100 ～ 600 mmol L NaCl (Tris-HCl缓冲液 , pH8.5)
梯度洗脱 ,流速为 0.5 mL min ,在 215 nm处检测收
集活性组分 ,冷冻浓缩后供进一步纯化 。
1.3.3　SephadexG25 层析:操作同 1.3.1 , 流速为
0.2 mL min ,在 215 nm处检测并收集活性组分 ,冷冻
干燥备用 。
1.4　抗菌肽稳定性的测定
1.4.1　热稳定性:将样品分别进行 100℃沸水浴
30 min 、115℃、121℃高压蒸气灭菌锅处理 20 min 后 ,
以玉米弯孢霉菌作为指示菌检测抑菌活性。以未处理
的样品为对照 ,将对照的抑菌活性定为100%。
1.4.2　pH稳定性:直接调节样品的 pH 值(pH 值分
别为 3.0 、3.5 、4.0……11.0),静置过夜 ,以玉米弯孢
霉菌作为指示菌检测抑菌活性。以未经酸碱处理的
样品为对照 ,将对照的抑菌活性定为 100%。
1.4.3　蛋白酶稳定性:37℃水溶条件下 ,用反应浓
度均为 1 mg mL蛋白酶 K和胰蛋白酶处理样品 2 ～
3 h , 以玉米弯孢霉菌作为指示菌检测抑菌活性。
以未加酶处理的样品为对照 ,将对照的抑菌活性定
为 100%。
1.5　抑菌活性的测定
采用滤纸片扩散法[ 11] 测试内生菌对细菌的抑
制作用 , 28℃培养 12 h ～ 48 h观察是否有抑菌圈出
现。采用生长速率法[ 12] ,每隔 24 h测试样品对病害
真菌的抑制率 ,直至真菌长满对照平板。菌丝生长
抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径) (对照菌
落直径- 5)×100%
1.6　抗菌肽的特性分析
样品的紫外吸收采用日本岛津紫外分光光度计
UV-1700紫外扫描。官能团检测采用傅里叶变换红
外光谱方法进行红外光谱测定。分子量测定采用质
谱仪测定 。样品经酸水解后采用氨基酸自动分析仪
检测氨基酸组成。茚三酮反应实验比较酸水解处理
前后茚三酮显色结果。
1.7　抗菌肽对真菌菌丝和孢子的影响
采用平板对峙法[ 13] ,待牛津杯周围形成抑菌圈时镜
检观察比较正常生长的菌丝和抑菌圈边缘处的菌丝。
2　结果
2.1　PCP-1的分离纯化
2.1.1　粗提液的提取:通过对 PCE45发酵液不同硫
酸铵浓度处理和抑菌能力测定 ,结果发现当硫酸铵
饱和度在 30%以下时抑菌活性较小 ,在 50%～ 70%
时抑菌效果最强 ,当浓度大于 70%时抑菌效果增强
不明显 ,所以粗提液制备采用硫酸铵浓度为 50%～
70%。经过丙酮处理后得到浅黄色粗提液 。
499程媛媛等:华重楼内生菌抗菌肽的分离纯化及其特性. 微生物学报(2009)49(4)
2.1.2　SephadexG75 层析和 DEAE52纤维素层析:
SephadexG75层析和DEAE52纤维素层析后得到 4个
洗脱峰 ,用玉米弯孢病菌为指示菌进行检测 ,第 3和
第4个峰有很强的抑菌活性 ,而第 1和第 2个峰没
有发现抑菌活性。收集活性组分(图 1-A),冷冻浓
缩后低温保存。
2.1.3　SephadexG25层析:SephadexG25层析后得到
2个洗脱峰 ,用玉米弯孢病菌为指示菌进行检测 ,第
1个峰有很强的抑菌活性 ,而第 2个峰没有发现抑
菌活性 。收集活性峰(图 1-B),冷冻干燥后得到样
品PCP-1 为白色粉末。 1 L 细菌发酵液可得到
1 mg PCP-1纯品。
图 2　PCP-1的抑制效果
Fig.2　The effect of PCP-1 against(A)Curvularia lunata(Walk.)Boed ,(B)Pyricularia oryzae Cav ,(C)Rhizoctonia solani
Kuha ,(D)Fusarium graminearum Schw.
图 1　PCP-1 的层析图谱
Fig.1　Chromatogram of PCP-1.A:DE52 cellulose column;B:Sephadex
G25 column.
2.2　PCP-1的稳定性
2.2.1　PCP-1 对温度的敏感性:样品经 100℃沸水
浴 30 min ,115℃、121℃高压蒸气灭菌锅处理 20 min
后 ,抑菌活性保持在95%以上 ,表明PCP-1具有很好
的热稳定性。
2.2.2　PCP-1对 pH 的敏感性:在不同酸碱度下的
抑菌活性表明 , pH 值在 5.5 ～ 10.5范围内时样品均
有抗菌活性;最适 pH 范围是 7.5 ～ 8.5 ,抑菌活性保
持在 90%以上;当 pH <4.0 或 pH>11.0 时抑菌活
性不明显 。
2.2.3　PCP-1对蛋白酶的敏感性:样品经蛋白酶 K
和胰蛋白酶处理后 ,抑菌活性仍保持在 90%以上 ,
说明 PCP-1对蛋白酶 K和胰蛋白酶具有很好的耐受
性。
2.3　抑菌谱
PCP-1对多种病害菌都有抑制作用 。对玉米弯
孢病菌和稻瘟病菌抑菌效果最强 , 抑菌率达到了
95.5%和 93.5%;对绿色木霉 、玉米纹枯病菌 、和松
赤枯病菌 、镰刀霉菌也有较好的的抑制效果 ,抑制率
达到 80%以上;对其他菌株也有较好的抑制效果
(图 2)。说明 PCP-1对病原菌的抑制作用具有广谱
性(表 1)。
2.4　PCP-1的性质
2.4.1　紫外光谱分析:对抗菌肽 PCP-1进行紫外扫
描 ,发现最大吸收峰位于 210 nm左右 ,在 250 nm ～
280 nm 附近有稍弱的吸收峰 ,与肽键(215 nm)的最
大吸收峰相符合。(图 3-A)
2.4.2　官能团分析:红外光谱分析结果:谱图的基
团特征吸收峰显示有 C =O(1652cm-1)、-NH(1557
cm
-1 、3321 ～ 3285 cm-1)、-OH(1039 cm-1 、3321 ～
3285 cm
-1)、C-H (2964 cm-1 , 2925 cm-1 , 2849
cm
-1)、-CH2(1460 cm-1)(图 3-B)。
2.4.3　分子量分析:由质谱分析图谱可判断 PCP-1
的分子量为 1058.3 D(图 3-C)。
500 Yuanyuan Cheng et al. Acta Microbiologica Sinica(2009)49(4)
表 1　PCP-1 对病害菌的抑菌活性
Table 1　The antimicrobial activities of PCP-1
Microorganism
Antimicrobial
activity ＊
Inhibition
rate %
Fungi
　Rhizoctonia solani Kuha +++ 89.3
　Fusarium graminearum Schw +++ 86.5
　Curvularia lunata(Walk.)Boed ++++ 95.5
　Pestalotiopsis funerea +++ 86.3
　Pyricularia oryzae Cav ++++ 93.5
　Trichoderma viride +++ 83.3
　Sclerotinia sclerotiorum +++ 88.5
　Fusarium sp. +++ 86.3
　Fusarium oxysporum ++ 75.3
　Physalospora piricola ++ 72.5
　Gliocladium viriens ++ 79.5
　Beauveria bassiana ++ 81.3
　Candida albicans undetemined
Bacteria
　Escherichia coli + undetemined
　Staphylococcus aureus + undetemined
　Bacillus subtilis + undetemined
＊ The antimicrobial activity is expressed by the diameter of inhibition zone ,
+:3～ 5mm , ++:5～ 10mm , +++:10～ 15mm , ++++:15～ 20mm
2.4.4　氨基酸组成分析:氨基酸分析结果表明 ,PCP-
1主要含有 7种氨基酸 ,氨基酸残基数为 9。其中极
性氨基酸(Ser 、Tyr 、Glu 、Asp)相对含量为 61.64%,与
PCP-1易溶于水 、极性强的特征相符合(表2)。
表 2　PCP-1 的氨基酸组成
Table 2　Amino acid component of PCP-1
Amino acids Content mol% No.of residues
Gly 13.31 1.88(2)
Leu 11.76 0.95(1)
Pro 8.6 0.79(1)
Ser 14.4 1.45(1)
Tyr 10.57 0.61(1)
Asp 13.45 1.07(1)
Glu 23.22 1.67(2)
2.4.5　茚三酮反应性测试:PCP-1茚三酮反应呈阴
性 ,说明它无自由 N-端 。酸水解后 ,茚三酮反应和
双缩尿反应呈阳性 ,故推测它可能为环肽。
2.5　PCP-1对真菌菌丝和孢子的影响
PCP-1对稻瘟病菌丝和孢子的生长有强烈的抑
制作用。抑菌平板抑菌圈边缘处的菌落稀薄 ,而其
他部位菌丝生长旺盛。镜检观察到抑菌圈边缘处的
菌丝成串珠状 、分枝增多 、聚集成丛枝状 ,有的生长
菌丝的顶端畸形 ,孢子仅有少数萌发;而正常菌丝分
枝少 ,间节长 ,菌丝光滑 、均匀 ,孢子轮廓清晰 ,数目
较多(图 4)。
图 3　PCP-1的性质分析图
Fig.3　Character analysis of PCE45.A:UV spectrum;B:IR spectrum;C:MS profile.
3　讨论
　　自从 1974年瑞典科学家 Boman 等人从诱导的
眉纹天蚕蛾(Samia cynthia)蛹中发现抗菌肽以
来[ 14] ,人们又在细菌 、真菌 、两栖类 、哺乳动物 、植物
和人类中相继发现并分离得到了抗菌肽 。这些小肽
有许多共同特征:分子量很小;基本都是环状结构;
含有一些特殊氨基酸 , 能耐受高温和蛋白酶的作用
等。本实验从华重楼内生菌中分离出的抗菌肽
PCP-1热稳定性好 ,且对蛋白酶 K和胰蛋白酶都有
较好的耐受性 ,这可能与它的分子量小和环状结构
有关 。
由于 PCP-1 分子量较小 ,序列较短 ,所以 SDS-
PAGE分离时分辨率低 ,效果不理想 ,最终采用质谱
分析测得 PCP-1分子量为 1058.3D。本实验没有采
用高效液相色谱做样品的纯度检测 ,但由于质谱仪
501程媛媛等:华重楼内生菌抗菌肽的分离纯化及其特性. 微生物学报(2009)49(4)
图 4　PCP-1 对水稻稻瘟病菌菌丝形态的影响
Fig.4　Effect of PCP-1 on the hyphal morphology of Pyricu laria oryzae
Cav.A:Normal hyphal morphology;B:Abnomal hyphal morphology.
对样品的纯度要求很高 ,质谱测量的精度可达千分
之一 D ,所以可以肯定该抗菌肽纯度达到一定的要
求 ,所得的分子量是准确的。
氨基酸组成分析表明 PCP-1主要含有 7种氨基
酸 ,是否含有特殊的氨基酸还需进一步验证 。氨基
酸测试时 ,还含有少量其他的氨基酸占 4.69%,可
能是由于收集时误差引起的 ,但它们的含量微小 ,不
影响氨基酸残基数。
在已报道的芽孢杆菌抗菌多肽类抗生素中 ,多
数抑菌谱窄 , 大多数不能同时既抗细菌又抗真
菌[ 15-16] ,本文报道的抗菌肽 PCP-1抑菌谱广 、活性
强 ,对许多危害严重丝状真菌 、细菌都表现出很强的
抗菌活性 ,对深入研究和开发利用重楼资源提供了
一定的理论依据 ,同时对华重楼新的生产途径及药
用植物的保护具有十分重要的经济及生态效益 ,在
农业或医药业中具有重要的应用潜力 。PCP-1的抑
菌机理还有待进一步研究 。
参考文献
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502 Yuanyuan Cheng et al. Acta Microbiologica Sinica(2009)49(4)
Purification and characterization of an antimicrobial peptide from Paris polyphylla
var.chinensis
Yuanyuan Cheng , Bin Yong , Chao Zhang , Qiang Liu , Wei Yan , Yiding Wang＊
(College of Life Science , Sichuan Normal University , Chengdu 610068 , China)
Abstract:[Objective] We isolated an endophyte PCE45 from the rhizome of Paris polyphylla var.chinensis.From PCE45 , we
purified and characterized an antimicrobial peptide.[ Methods] After ammonium sulfate salting-out , acetone precipitation ,
SephadexG75 ,DE52 and SephadexG25 column chromatography , we separated an antimicrobial peptide PCP-1 from the strain
PCE45.The stability against high temperature and proteinase , and antimicrobial activity were also analyzed.[ Results] The
antimicrobial peptide PCP-1 was stable to proteinase and tolerated high temperature , strong acid and strong base.PCP-1 caused
deformation of the hyphae of Pyricularia oryzae and prohibited the spore germination.It also inhibited fungi such as Curvularia
lunata and bacteria such as Escherichia coli.Mass spectrogram measurement revealed its molecular weight of 1058.3 Da.The
amino acid composition of the peptide composed of 7 amino acids.Ninhydrin reaction showed negative trait whereas after acid
hydrolysis with positive ninhydrin reaction and biuret reaction.[ Conclusion] The ninhydrin reaction and biuret reaction imply
that the peptide PCP-1 is a cyclic lipeptide.This is the first report about antimicrobial peptide from Paris polyphylla var.
chinensis.
Keywords:Paris polyphylla var.chinensis;endophyte;antimicrobial peptide;purification
(本文责编:张晓丽)
Supported by the National Natural Science Fundation of China(No.30670218)
＊Corresponding author.Tel:+86-28-84480650;E-mail:wwwyiding@163.com
Received:13 December 2008 Revised:7 January 2009
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(2)如果是编辑部在审稿意见中要求您修改后再提交本刊“复审” , 则不作为新稿处理 ,请作者直接将修改稿上传到远程系统
中 , 不再另交稿件受理费。
503程媛媛等:华重楼内生菌抗菌肽的分离纯化及其特性. 微生物学报(2009)49(4)