全 文 ：新 疆 农 业 大 学 学 报　2005 ,28(4):11 ～ 14
Journal o f Xinj iang Agricultural University
文章编号:1007-8614(2005)04-0011-04
白梭梭 ISSR-PCR实验反应体系的建立和优化
张　萍1 , 董玉芝1 , 魏　岩1 , 胡成志2
(1.新疆农业大学 林学院 , 乌鲁木齐　830052;2.新疆大学 , 乌鲁木齐　830046)
摘　要:　探讨了白梭梭 ISS R实验中的各种影响因素 , 采用正交设计 L16(45)对 PCR反应中 5 个因素(Taq 酶 ,
Mg2+ , 模板 DNA , dNTP和引物)在 4 个水平上进行优化试验。在初步实验的基础上通过因素内比较进一步优化
各因素在 ISSR-PCR反应中的浓度;设置了不同的退火温度和循环次数 , 建立了白梭梭 ISSR 的最佳反应体系 ,为
进一步进行白梭梭种群间遗传多样性的研究奠定基础。
关键词:　白梭梭;ISSR;正交实验设计;最佳反应体系
中图分类号:　Q949. 745. 1　　　　　　文献标识码:　A
Establishment and Optimum of PCR
Reaction System in Haloxylou persicum
ZHANG Ping
1 , DONG Yu-zhi1 , WEI Yan1 , HU Cheng-zhi2
(1. Col leg e of Fo rest ry , Xinjiang Agricul tural University , Urumqi ,830052;2. Co lleg e o f Xinjiang
University , Urumqi , 830046)
Abstract:　This art icle focuses on the inf luential factors of ISSR experiments used to analy ze Haloxy lou
persicum . The o rthogonal design w as used to optimize ISSR-PCR ampli ficat ion sy stem in four levels of f ive
facto rs (Taq DNA polymerase , Mg2+ , DNA template , dN TP and primer) respectively . Based on the pre-
liminary expe riment , the density w ithin facto rs of ISSR-PCR was further optimized. And dif ferent annea-
ling temperature and cycle times w ere also compared. The reaction condit ion of ISSR expe riment w as dis-
cussed , which w as basis fo r the study on genetic dive rsity o f Haloxy lou persicum populations.
Key words:　Haloxy lou persicum ;ISSR-PCR;o rthogonal design;opt imal system
　　白梭梭(Haloxy lon persicum Bunge ex. Boiss.
e t Buhse)是我国西北荒漠地区优良的固沙植物 ,隶
属藜科梭梭属(Haloxy lon),小半乔木 ,具有极强的
抗旱性。在我国新疆与梭梭镶嵌分布 ,主要分布于
古尔班通古特沙漠 、乌伦古特河沿岸沙丘 、乌苏沙漠
等地 ,其中以乌苏分布较多 。它只生长于北疆沙漠
的流动沙地 、半流动沙地和半固定沙地上 ,分布区狭
窄。其地理分布的生境是干旱多风 ,冬季寒冷 ,夏季
炎热 ,温度年振幅大 ,其适生气象条件与梭梭相同 。
白梭梭的生长型和梭梭一样 ,根系强大 ,具有锚状
根 ,耐干旱 ,耐风蚀 ,耐沙埋 ,为典型的沙生超旱生植
物[ 1] 。近年来 ,由于水分条件 、过渡放牧 、鼠害 、尤其
是人为破坏的影响 ,梭梭生境遭到严重破坏。我国
已将其定为国家三级保护植物 ,并列入《中国珍稀濒
危植物名录》。
简单重复序列区间扩增多态(inte r-simple se-
quence repeats , ISS R)DNA 分析由 Zie tkiew icz 等
建立[ 2] 。该技术具有操作简单 、成本低 、快速灵敏 、
多态性高 、所需 DNA 量少以及无需预知研究对象
的基因组序列等优点 , 同时也具有 SSR 的稳定
性[ 3] 。Jonsson等人的研究认为 ,在进行植物遗传
多样性和系统发育的研究时 ,可优先考虑使用 IS-
SR[ 4] 。国内近年来在林木方面也开始采用此方法。
然而 ,虽然它具有重复性高的优点 ,但其扩增结果往
收稿日期:2005 - 10 - 21
基金项目:国家自然科学基金项目(30260009);新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(200421112)
通讯作者:董玉芝 , E-mail:dy z830052@126. com
新　疆　农　业　大　学　学　报 2005年　
往会受到多个因素的影响 ,如模板浓度 、引物浓度 、
TaqDNA 聚合酶用量等[ 5] 。为了确保 ISSR分析结
果的特异 、有效和忠实性 ,对于不同植物必须进行
ISS R-PCR反应体系的建立与优化。白梭梭 ISS R-
PCR反应系统的建立及其群体遗传多态性分析尚
未见报道 。本实验探讨了影响 ISSR-PCR反应的多
个因素 ,建立了白梭梭 ISS R-PCR的最佳反应体系 ,
为进一步进行白梭梭种群间和种群内遗传多样性研
究奠定基础。
1　材料和方法
1. 1　材 料
本实验白梭梭的种子采集于中国新疆维吾尔自
治区的吐鲁番 、阜康 、甘家湖 、莫索湾 4 个地区 。种
子在光照培养箱内发芽后直接放入 - 70 ℃低温冰
箱冷冻保存。
1. 2　仪器和试剂
PCR扩增仪(Bio-Rad , iCycler 170-8720)、Sub-
Cell G T 型电泳仪(Bio-Rad)、各种型号微量移液器
(Eppendorf公司)、DU800紫外分光光度计 。主要
试剂与引物均购自上海生工生物工程有限公司。本
实验在中科院新疆生态与地理研究所完成。
1. 3　DNA 提取的方法
参考 Doy le 改进的CTAB法提取DNA[ 6] ,所提
取的 DNA呈白色或无色沉淀 ,电泳所显示的 DNA
带型完整 ,清晰一致 ,无明显降解。在紫外分光光度
计上定量检测其浓度 ,0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测
其质量(图 1)。
图 1　DNA 样品
Fig. 1　DNA sample
1. 4　试验处理
为了确定 PCR 反应中 5 个因素(Taq 酶 ,
Mg 2+ ,模板 DNA , dN TP ,引物)的较佳水平 ,采用
正交设计 L16(45)在 4个水平上进行试验。PCR反
应的因素水平见(表 1)L16(45)设计方案 。
1. 5　PCR扩增程序
本实验采用的初步 PCR扩增程序为 94 ℃变性
1. 5 min ,进入下列 35个温度循环:94 ℃变性 45 s ,
51 ℃退火 45 s , 72 ℃延伸 1. 5 min ,最后在 72 ℃延
伸 5 min ,扩增产物在 4 ℃保存。扩增产物用 1. 5%
的琼脂糖凝胶电泳检测 , EB 染色 , 电压为4 V /cm 。
在自动凝胶成像系统上观察并拍照记录。
表 1　PC R反应的因素水平 L16(45)正交试验设计
　Table 1　L16(45) orthogonal design for the factors and lev-
els of PCR reaction
编号 Taq(U /20μL)
dNTP
(mmo l /L)
模板
(ng /μL)
引物
(μmol /L)
Mg 2+
(mmo l /L)
1 0. 5 0. 10 1. 0 0. 4 0. 8
2 0. 5 0. 15 2. 0 0. 5 1. 0
3 0. 5 0. 20 3. 0 0. 6 1. 5
4 0. 5 0. 25 4. 0 0. 7 2. 0
5 1. 0 0. 10 2. 0 0. 6 2. 0
6 1. 0 0. 15 1. 0 0. 7 1. 5
7 1. 0 0. 20 4. 0 0. 4 1. 0
8 1. 0 0. 25 3. 0 0. 5 0. 8
9 1. 5 0. 10 3. 0 0. 7 1. 0
10 1. 5 0. 15 4. 0 0. 6 0. 8
11 1. 5 0. 20 1. 0 0. 5 2. 0
12 1. 5 0. 25 2. 0 0. 4 1. 5
13 2. 0 0. 10 4. 0 0. 5 1. 5
14 2. 0 0. 15 3. 0 0. 4 2. 0
15 2. 0 0. 20 2. 0 0. 7 0. 8
16 2. 0 0. 25 1. 0 0. 6 1. 0
表 2　ISSR引物序列
Table 2　Sequences of ISSR primer
引物序号 序列
AW24463 (CA)6WS
AW24465 (CTC)4WC
AW24468 (AC)8 SG
AW24469 (CTC)4WC
AW38191 (CT)8 RC
AW38195 (CTC)5
AW38196 (GACA)4
AW38198 (GGAGA)3
AW38202 (AC)8YA
AW38204 (AG)8 YT
AW38206 CSC(GA)6
2　结果与分析
按表 1设计的 16个处理进行 PCR反应后 ,将
得到的产物进行电泳 ,结果显示第 6 个处理的扩增
结果较好(图 2)。在正交设计分析后 ,对每个因素
各个水平作多重比较。
12
　第 4 期 张　萍 , 等:白梭梭 ISSR-PCR实验反应体系的建立和优化
M :M3000
图 2　PCR产物电泳结果
Fig. 2　Result of PCR products electrophoresis
2. 1　引物浓度对 ISS R-PCR的影响
引物浓度会对 PCR的带型产生明显的影响 。
本实验设置了 0. 2 ～ 1. 0 μmol /L 9个浓度梯度 ,低
于 0. 4 μmo l/L 时 ,由于引物的竞争机制 ,引物与模
板的结合机率降低 ,造成扩增条带过淡 ,从而不能真
实的反映结果;0. 5 ～ 0. 7 μmo l/L 时随着引物浓度
的增大 ,条带的亮度有所增加;但大于此浓度条带的
亮度反而变淡。最后在结果稳定 , 重复性较好的前
提下 ,采用了较低的引物浓度为0. 5μmo l/L(图3)。
　1～ 9:引物浓度分别为 0. 2 , 0. 3 , 0. 4 , 0. 5 , 0. 6 , 0. 7 , 0. 8 ,
0. 9 , 1. 0 μmol / L
图 3　引物浓度对 ISS R-PCR的影响
Fig. 3　Effect of different amount of primer on ISSR-PCR
2. 2　模板浓度对 ISS R-PCR的影响
模板浓度是影响 ISSR-PCR扩增效果的重要的
因子之一 。模板中含有一定量的 RNA和少量的蛋
白质不会对扩增结果产生明显影响 ,但为避免模板
中含有对 Taq酶的抑制剂 ,应尽量纯化模板。本实
验在 0. 5 ～ 15. 0 ng /μL 进行 10个浓度梯度实验 ,发
现在 PCR反应中 ,模板质量浓度低的 0. 5 ng /μL 无
扩增产物或很少 , 4. 0 ng /μL 以上时条带亮度反而
会变浅或扩增条带缺失;在这之间的浓度扩增结果
较一致。最后本实验选用用量较少又较稳定的 2. 0
ng /μL 作为 PCR反应的用量(图 4)。
　1～ 10:模板浓度分别为 0. 5 , 1. 0 , 2. 0 , 3. 0 , 4. 0 , 5. 0 , 7. 5 ,
10. 0 , 12. 5 , 15. 0 ng /μL
图 4　模板浓度对 ISSR-PC R的影响
Fig. 4　Effect of different template on ISSR-PCR
2. 3　d N TP 浓度对 ISS R-PCR影响
在 PCR反应中 ,dN TP 是 PCR的原料 ,它的浓
度过高会导致 PCR错配 ,从而使扩增出现非特异性
扩增;浓度过低 ,又会影响合成效率 ,影响扩增效果。
另外 , TaqDNA 聚合酶的用量是影响 PCR 反应的
一个重要因素 , Mg2+对 PCR反应的特异性和扩增
效率也有显著影响 ,不仅影响酶的活性 ,还可影响扩
增的真实性和扩增产物的特异性 , Taq酶的聚合作
用需要一定浓度的 Mg2+来激活 ,浓度过低就会使
带型较少 ,过高则产生弥散现象 ,条带反而减少 ,有
非特异性扩增出现 。
在预实验的基础上 , Taq酶浓度为 1U /20 μL ,
Mg2+为 1. 5 mmo l /L 时 ,设置了 0. 1 ～ 0. 3 mmo l /L
5个浓度梯度的 dNT P进行实验(图 5)。
　　1 ～ 5:dNTP 浓度分别为 0. 10 , 0. 15 , 0. 20 , 0. 25 ,
0. 30 mmol /L
图 5　dNTP浓度对 ISS R-PCR的影响
Fig. 5　Effect of different dNTP on ISSR-PCR
dN TP 在 0. 1 ～ 0. 15 mmol /L 之间扩增结果一
致 ,但 0. 15 mmol /L 时增条带稍清晰;0. 2 mmol /L
13
新　疆　农　业　大　学　学　报 2005年　
以上带型发生变化 ,扩增产物缺失或扩增产物不稳
定。本实验采用 0. 15 mmo l /L ,在此浓度下扩增稳
定 ,重复性强。
2. 4　循环次数对 ISS R-PCR的影响
PCR的循环次数决定产量 ,次数太少 ,产物量
极低 ,次数太多 ,进入到反应平台期后 , PCR产物也
不会有明显的增加 ,反而引起非特异性扩增 。本实
验进行了 30 ,35和 40次循环的尝试 , 30个循环时 ,
扩增不稳定 ,扩增带型较弱;35个循环时 ,带型稳定
且清晰;40循环时 ,扩增结果一致 ,由此可见在本实
验中 ,35个循环已经达到要求。
2. 5　退火温度对 ISS R-PCR的影响
在 PCR扩增中 ,退火温度明显影响扩增带的式
样 ,提高退火温度可减少引物与模板的非特异性结
合 ,提高 PCR反应的特异性 ,降低退火温度则可提
高扩增产量。本实验从 47 ～ 53 ℃尝试了不同的退
火温度 ,低于49 ℃时扩增的差异性较大 ,背景较深;
随着温度的升高扩增条带数有增加的趋势 ,大于
52 ℃时由于引物与模板的结合减弱 ,扩增带反而变
小 ,亮度减弱;最后选择在 51 ℃的退火温度下进行
扩增 ,扩增条带清晰 ,重复性好 。
3　讨 论
采用正交试验设计的均衡分散 、综合可比以及
可伸可缩 、效用明确的特性[ 7] 。对影响 ISSR 反应
条件的主要因素进行筛选 ,可缩短实验时间 ,较快地
找到最优水平组合 。正交试验设计是一种值得借鉴
的方法。影响 ISSR 结果的因素很多 ,为了利用这
一分子标记进行遗传多样性分析 ,获得重复性和可
靠性较高的 ISSR带谱 ,提高分析的准确性 。对不
同试验条件下的 PCR反应体系进行优化 ,我们筛选
出较稳定的梭梭 ISS R-PCR的反应体系 ,在 20 μL
的反应体系中 ,Mg2+的浓度为 1. 5 mmol /L ,引物的
浓 度 为 0. 5 μmo l/L , d NTP 的 浓 度 为
0. 15 mmo l /L ,TaqDNA聚合酶的用量为 1 U ,模板
DNA 的用量为40 ng 。按照此体系 ,在51 ℃的退火
温度下 ,延伸 1. 5 min , 35 个循环 。利用此优化系
统 ,对白梭梭种群的进行 ISS R-PCR扩增 ,能得到清
晰 、多态性高的 ISSR带谱 ,并具有较好的重复性 ,
多态位点丰富 。
参考文献:
[ 1] 　中华人民共和国林业部. 新疆森林[ J] . 乌鲁木齐 ,新疆人民出版社 , 1989.
[ 2] 　Zieticwiez E , Rafalski A , Labuda D. Genome finge rprinting by simple sequence repea ts (SSR) ancho red po lyme rase
chain reaction am plification [ J] . G enomics , 1994 , 20:176-183.
[ 3] 　何予卿 , 张宇 ,孙海 , 等.利用 ISS R标记研究栽培稻和野生稻亲缘关系[ J] .农业生物技术学报 , 2001 , 9(2):123 - 127.
[ 4] 　Jonsson B O , Jonsdot tir I S , Cronbe rg N. Clonal div ersity and allozyme variation in population o f the a rctic Carex big e-
lowii. JEcol , 1996 ,(84):449-459.
[ 5] 　冯富娟 , 王凤友 ,刘彤. 红松 ISSR-PCR 实验系统影响因素[ J] . 植物学通报 , 2004 , 21(3):326-331.
[ 6] 　Doy le J. DNA pro tocols fo r plants-CTAB total DNA isolation. In:Hew itt G M , Johnston A . Mo lecular Techniques in
Taxonomy[ M] . Berlin:Springer , 1991:283-293.
[ 7] 　何正文 , 刘运生 ,陈立华 , 等.正交设计直观分析法优化 PCR条件[ J] .湖南医科大学学报 , 1998 , 23(4):403-404.
14