全 文 ：但飞君 ,禇立军 ,蔡正军 ,等.红毛七多糖体外抗氧化活性研究 [ J].江苏农业科学 , 2010(5):398-400.
红毛七多糖体外抗氧化活性研究
但飞君 , 禇立军 , 蔡正军 , 杨　文
(三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室 ,湖北宜昌 443002)
　　摘要:测定了红毛七多糖对 DPPH、O-2· 、 · OH、亚硝酸盐的清除作用。结果表明 , 红毛七多糖对 DPPH、O-2· 、
· OH、亚硝酸盐具有较强的清除能力。当多糖浓度为 4.0 mg/mL时 , 对 DPPH清除率接近 80%,对 O-2·的清除率达
78.1%, 对· OH的清除率达 96.6%, 对 NO
2
-的清除率达 85.1%。
　　关键词:红毛七;多糖;抗氧化活性;清除率
　　中图分类号:Q946.3　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010)05-0398-03
(上接第 397页)
生壳 、板栗壳和麦草 。但从材料易得性考虑 ,从秸秆中提取木
质素更具有实际意义 。
测定木质素含量的方法除了硫酸法 (Klason法)外 ,还有
紫外分光光度法 、红外光谱定量分析法 、同位素法 。由于红外
光谱法和同位素法对实验室要求较高 ,所以应用并不普遍 ,本
试验应用的 Klason法是测定木质素含量的经典方法 。紫外
分光光度法测定木质素仅需微量原料 ,在珍稀药材的研究中
更具可行性和实用性 ,用紫外分光光度法测定几种秸秆的木
质素含量还有待进一步研究。
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　　红毛七为小檗科红毛七属植物类叶牡丹 (Caulophylum
robustumMaxmi.)的根及根茎 ,我国主要分布于东北 、陕西 、浙
江 、湖北 、四川及西藏等地;性温 ,味苦辛 ,具有理气止痛 、祛风
活血 、抗菌 、散淤等功效 ,用于治疗跌打损伤 、风湿疼痛 、胃腹
疼痛 、月经不调等症 [1 ] 。研究表明 ,红毛七具有抗炎镇痛 、增
加细胞膜的通透性 、抗动脉粥样硬化 、抗肿瘤 、抗病毒 、抗心肌
缺血等药理作用 [ 2-3 ] ,主要化学成分包括生物碱 、三萜皂苷 、
挥发油等 [ 4 -5 ] 。笔者在前期超声辅助红毛七多糖提取工艺研
究 [ 6 ]的基础上 ,对提取的多糖进行了体外抗氧化试验 ,包括
其对 DPPH自由基 、O-2· 、· OH、亚硝酸盐的清除作用 ,旨在为
红毛七开发利用提供依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
红毛七多糖 ,自制 。
1.2　仪器
、AL204电子天平 (梅特勒 -托利多上海有限公司 ),
收稿日期:2009-12-17
基金项目:生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金(编号:
2007005)。
作者简介:但飞君(1972—),女 ,博士 , 副教授 ,主要从事天然产物的
活性成分研究。 Tel:(0717)6397478;E-mail:danfj0458@yahoo.
com.cn。
KQ3200DB型数控超声波清洗器 (江苏省昆山市超声仪器有
限公司), DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精密实
验设备有限公司 ), S-3100紫外可见分光光度计 (SCINCO
公司)。
1.3　试剂
DPPH(Sigma公司),盐酸萘乙二胺 (日本东京应化工业
株式会社), Tris、邻苯三酚 、亚硝酸钠(国药集团化学试剂有
限公司),维生素 C、硫代硫酸钠 (天津市科密欧化学试剂有
限公司), FeSO4(上海化学试剂有限公司), H2O2(广东汕头
市西陇化工有限公司),邻二氮菲(上海浦江化工有限公司 ),
对氨基苯磺酸(天津市远航化学品有限公司),磷酸二氢钠 、
磷酸氢二钠(天津市博迪化学试剂有限公司),盐酸 、冰醋酸 、
无水乙醇 、氯仿 、正丁醇 、碘化钾均为分析纯 。溶液除特殊指
出外均用双蒸水配制 。
1.4　样品的制备
干燥红毛七药材 200 g,粉碎过 40目筛 ,乙酸乙酯回流脱
脂 3次 ,药渣晾干后用 70%乙醇回流 3次 ,晾干得预处理的
红毛七干粉 。预处理的红毛七干粉以料液比 1 g∶20 mL、功
率 70 W、65 ℃,超声波提取 70min后 ,过滤 ,离心 ,得上清液;
减压浓缩 ,浓缩液经氯仿 -正丁醇 (体积比 4 ∶1)萃取 ,分出
上清液 ,除蛋白质 。离心后上清液加入乙醇至含醇量为
80%,静置 ,离心 ,沉淀依次用无水乙醇 、丙酮 、乙醚各洗 2次 ,
真空干燥 ,即得精制红毛七多糖 ,备用 。
—398— 江苏农业科学　2010年第 5期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2010.05.099
1.5　清除 DPPH作用试验
将参考文献 [ 7-8]的方法稍加改进 ,精确称取 15.8 mg
DPPH,溶于 100 mL无水乙醇配制成 0.4 mmol/L的 DPPH母
液 。依次精确量取 0.05、0.25、0.50、0.75、1.00 mL的 DPPH
母液 ,稀释至 2.00 mL,在 517 nm下测其吸光度 , 得标准曲
线:y=1.233x-0.0522 8, r=0.9991 8。
取 1.0mL红毛七多糖样品溶液与 1.0 mL0.15 mmol/L
的 DPPH溶液于同一试管中 ,摇匀 ,放置 30 min,以溶剂作参
比测定其吸光度 Di,同时测定 1.0 mL0.15mmol/L的 DPPH
溶液与 1.0mL溶剂混合后的吸光度 D0 ,以及 1.0 mL红毛七
多糖不同浓度的样品溶液与 1.0 mL溶剂混合后的吸光度
Dj。按照下列公式计算清除率 ,清除率越大表明抗氧化能力
越强 。
清除率 =[ 1-(Di-Dj)/D0 ] ×100%
1.6　清除超氧离子自由基的测定
参照参考文献 [ 9-10]的方法 ,取 4.5mLTris-HCl缓冲
液(50mmol/L, pH值为 8.2),于 20 ℃水浴中保温 20 min,分
别加入 1.0mL不同浓度的多糖溶液和 0.4mL邻苯三酚溶液
(25mmol/L),混匀后于 25 ℃水浴中反应 5 min,加入 1.0mL
HCl溶液(8mol/L)终止反应 ,在 420 nm处测定吸光度 Di;以
蒸馏水代替样品液作为对照 ,测定吸光度 D0;以蒸馏水代替
显色剂测定样品本身吸光度 Dj。按下式计算清除率 。
清除率 =[ (D0 -(Di-Dj)/D0 ] ×100%
1.7　清除羟基自由基作用试验
将参考文献 [ 11]的方法稍加改进 ,在试管中加入 2.0mL
pH值为 7.4的磷酸盐缓冲液和 1.0 mL1.5 mmol/L的邻二
氮菲溶液 ,混匀 ,加入 1.0mL1.5mmol/LFeSO4溶液 ,立即混
匀 。加入 1.0mL一定浓度的样品溶液 ,混匀 ,加入 0.02%的
H2O2 1.0mL,补充体积至 8.0 mL, 37℃保温 1 h,在 510 nm
处测定吸光度(此为损伤管吸光度)。同时做样品空白试验 ,
另再做损伤管和未损伤管 ,其中损伤管中加入 0.02% H2O2
1.0mL,未损伤管不加 H2O2 ,最后补充各管体积至 8.0 mL,
于 37℃下保温 1h,测 510 nm下的吸光度 ,重复 2次 ,计算平
均值 。按下式计算清除率:
· OH清除率 =[ (D2 -D1 )/(D0 -D1)] ×100%
其中 , D0为未损伤管的吸光度;D1为损伤管的吸光度;D2为
加样品液并扣除样品空白后的吸光度 。
1.8　清除亚硝酸盐作用试验
1.8.1　标准曲线　将参考文献 [ 12-13]的方法稍加改进 ,
精确量取亚硝酸钠标准液(5 μg/mL)0.00、0.20、0.40、0.60、
0.80、1.00 mL, 分别置于 10 mL具塞刻度试管中 , 各加入
1.0mL0.4%的对氨基苯磺酸溶液 ,混匀 ,静置 5 min,加入
0.5mL0.2%的盐酸萘乙二胺溶液 ,加水至刻度 ,混匀 ,静置
15 min, 538 nm下测定吸光值 ,得标准曲线:y=0.724 78x+
0.013 48 , r=0.999 86。
1.8.2　试验方法　准确称取 5 μg/mL的 NaNO2标准溶液 2
份各 1.0mL,分别置于 25 mL比色管中 ,其中一份加入一定
量的待测样品溶液 , 37 ℃恒温水浴中反应 30 min,另一份作
空白 。取出后 2份均立即加入 1.0mL0.4%的对氨基苯磺酸
溶液 ,混匀 ,静置 5min后加入 0.5mL0.2%的盐酸萘乙二胺
溶液 ,加水至 10mL,混匀 ,静置 15min,以不加 NaNO2和样品
溶液的试剂为空白 ,于 538nm处测定吸光值 ,分别为 D1 、D2。
亚硝酸盐的清除率按以下公式计算:
清除率 =[ (D2 -D1)/D2 ] ×100%
2　结果与分析
2.1　红毛七多糖对 DPPH的清除作用
DPPH是一种稳定的自由基 ,它在可见光区有特征吸收 ,
比色测定简便 、快捷 。自由基清除剂存在时 , DPPH的单电子
被配对而使其颜色变浅 ,在最大吸收波长处的吸光度变小 ,且
颜色变浅的程度与配对电子数是成剂量关系的 ,因此可用于
物质清除自由基的研究与天然抗氧化剂的筛选 。本试验通过
检测自由基 DPPH的清除率 ,观察红毛七多糖在体外对DPPH
有无抑制或清除作用 ,结果如图 1所示。从图 1可知 ,在样品
测定浓度范围内 ,红毛七多糖对 DPPH自由基具有较强的清
除能力 ,对 DPPH自由基的清除率总体趋势是随着浓度的增
大而提高;但当浓度增大到一定值后 , DPPH清除率增幅不明
显 ,最大清除率为 80.4%。
2.2　红毛七多糖对超氧离子自由基的清除作用
超氧离子自由基(O-2· )是活性氧的一种 ,是机体内寿命
最长的自由基 ,通常作为自由基链式反应的引发剂 ,产生活性
更强的自由基 ,在体内由过氧化物歧化酶清除。如果体内过
氧化物歧化酶活力下降或 O-2·产生过量都会给机体造成危
害 。本试验通过邻苯三酚自氧化产生 O-2· ,来观察红毛七多
糖在体外对 O-2·有无抑制或清除作用 ,结果如图 2所示 。
　　由图 2可知 ,在样品测定浓度范围内 ,随着浓度的增大红
毛七多糖对 O-2·的清除率增大 ,当浓度增大到 0.5 mg/mL时 ,
清除率发生突增 ,当多糖浓度继续增大时 ,清除率缓慢增大 ,
且具有一定剂量依赖关系 。红毛七多糖浓度为 4.0 mg/mL
时对 O-2·的清除率达 78.1%。
2.3　红毛七多糖对羟基自由基的清除作用
羟基自由基(· OH)是化学性质非常活泼的一种活性
—399—但飞君等:红毛七多糖体外抗氧化活性研究
氧 ,也是目前已知活性氧中对生物体毒性最强 、危害最大的一
种自由基 ,几乎能与所有的生物大分子发生各种不同类型的
反应 。本试验以邻二氮菲 -Fe2 +为指示剂 ,采用比色法测定
Fenton反应体系产生的 · OH,研究样品对 · OH的清除效率 ,
结果如图 3所示 。
　　由图 3可知 ,红毛七多糖对 · OH具有明显的清除作用 。
当多糖的浓度为 0.25 mg/mL时 ,对 · OH的清除率达到
80%,与同等条件下同浓度常用的抗氧化剂维生素 C相当 。
在样品测定浓度范围内 ,清除率总体趋势是随着浓度的增大
而提高 , 并呈明显的 剂量依赖 关系 。当多 糖浓度为
4.0mg/mL时 ,对 · OH的清除率达 96.6%。
2.4　红毛七多糖对 NO2 -的清除作用
亚硝酸盐与仲胺在人体中易合成强致癌物质亚硝胺 。亚
硝胺能引起人体和动物的肝脏等多种器官的恶性肿瘤 ,因此
在体内外清除亚硝酸盐以阻断亚硝胺的合成是防治癌症的有
效途径之一 。本试验通过检测 NO2 -的清除率 ,观察红毛七
多糖在体外对 NO2 -有无清除作用 ,结果如图 4所示 。
　　从图 4可知 ,在样品测定浓度范围内 ,红毛七多糖对
NO2 -都具有一定的清除能力 ,对 NO2 -的清除率总体趋势是
随着浓度的增大而提高 ,呈现一定剂量依赖关系 。多糖浓度
达到 4.0mg/mL时对 NO2 -的清除率达 85.1%。
3　结论
红毛七多糖具有一定的体外抗氧化性 ,它对 DPPH自由
基 、O-2· 、· OH和亚硝酸盐具有较强的清除能力 ,清除能力随
着浓度的增大而提高 。在不同的自由基产生体系中 ,其抗氧
化活性强弱不尽相同 ,其中对 · OH的清除作用及对 NO2 -的
清除作用大于对 DPPH的清除作用 ,对 O-2·与对 DPPH的清除
作用相当 。在测定浓度范围内 ,多糖浓度与抗氧化活性呈一
定的依赖关系 ,当多糖浓度为 4.0mg/mL时 ,对 DPPH清除率
接近 80%,对 O-2·的清除率达 78.1%,对 · OH的清除率达
96.6%,对 NO2 -的清除率达 85.1%。
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　　更正:本刊 2010年第 4期 308页刊登的论文《玉米须提取物抑菌活性及耐热耐压稳定性研究 》 ,因编辑出版过程中出
现疏漏 ,作者单位的顺序给颠倒了 ,其作者及作者单位更正如下 ,并向作者和广大读者致歉!
王元清 1, 2 , 严建业 2 , 喻林华 1 , 陈晓莉1 , 胡　波 1 , 陈志文 1 , 谷阿龙 1
(1.中南林业科技大学生命科学与技术学院 ,湖南长沙 410004;2.湖南中医药大学药学院 ,湖南长沙 410208)
《江苏农业科学》编辑部
—400— 江苏农业科学　2010年第 5期