全 文 :华 南 理工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )
第 36卷 第 7期 JournalofSouthChinaUniversityofTechnology Vol.36 No.7
2008年 7月 (NaturalScienceEdition) July 2008
文章编号:1000-565X(2008)07-0128-06
收稿日期:2007-09-19
*基金项目:贵州省科技基金资助项目(黔科合 J字 [ 2005] 2017号);贵州省自然科学基金资助项目(19993105)
作者简介:王文平(1966-), 女, 在职博士生 ,副教授 ,主要从事天然糖质分离纯化新方法新技术的研究.E-mail:wwp931002@
163.com
野木瓜水溶性多糖的提取 、分离及结构分析*
王文平 1 郭祀远1 李琳 1 王明力2 莫莉萍 2
(1.华南理工大学 轻工与食品学院 , 广东 广州 510640;
2.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室 , 贵州 贵阳 550003)
摘 要:采用纤维素酶法从野木瓜中提取水溶性粗多糖 ,通过正交试验确定了最佳提取
条件:提取温度 50℃, pH4.0,提取时间 2.5h,酶用量 50U/g.粗多糖经蛋白酶与 Sevage法
相结合脱蛋白 、大孔树脂脱色及水浴透析 ,得到野木瓜水溶性精多糖 CCP,再经 DEAE-纤
维素阴离子交换层析柱 ,得一种主要洗脱组分 CCP1.纸层析和 SepharoseCl-6B色谱柱分
析表明 CCP1为多糖纯品 ,苯酚 -硫酸比色法测得该多糖的糖含量为 97.3%,紫外光谱分
析未见蛋白质(280nm)与核酸(260nm)的特征吸收峰 ,红外光谱分析发现典型多糖吸收
峰.结果表明 , CCP1是初次从该植物中提取分离出来的新的均一多糖组分.
关键词:野木瓜;多糖;提取;纯化;结构分析
中图分类号:Q946.3 文献标识码:A
野木瓜 [ Chaenomelescathayensis(Hemsl.)
Schneid]是贵州省遵义市正安县独有的天然特产资
源 ,属蔷薇科(Rosaceae)木瓜属植物 ,落叶灌木或小
乔木.正安县野木瓜品质独具特色 ,具有果大 、皮薄 、
肉厚 、肉质细嫩 、味甘酸 、气香等特点.木瓜在中医药
学中用途广泛 , 《中医大辞典 》、《本草纲目 》、《本草
拾遗》等著名医著都记载了木瓜具有舒筋活络 、解
渴生津 、平肝和胃 、祛风除湿等功效 ,能治疗腰膝疼
痛 、脚气水肿 、痢疾霍乱 、心痛腹痛等疾病.另外 ,木
瓜还有抗菌消炎 、护肝降酶 、清暑利尿 、解酒祛痰等
作用.现代研究表明 ,多糖是野木瓜中的主要组成成
分 ,此外 ,野木瓜果实还含有丰富的有机酸 、果胶 、胡
萝卜素 、黄酮类 、氨基酸 、维生素和矿物质 [ 1] .
多糖在医药上是一种很好的佐剂 ,近年来发现
多糖的糖链在分子生物学中具有决定性作用 ,此外
它还能控制细胞的分裂和分化 、调节细胞的生长和
衰老[ 2] .流行病学和生理学研究表明 ,多糖对人体
的影响与细胞壁多糖的化学组成有关 [ 3-4] .在生命
过程中 ,糖作为能量物质和结构物质 ,它的味觉性
能 、生理性能及加工性能早已为人们所熟悉 [ 5] .除
此之外 ,现代医学研究表明某些多糖还具有抗凝血 、
抑感染 、御放射 、降血糖 、防肿瘤等免疫调节功
能[ 6-7] ,可以作为广谱免疫促进剂 ,常被称为 “生物
应答效应物”(BiologicalResponseModifier, BRM)或
生物活性多糖 [ 8] .多糖多种多样的生物活性以及在
功能食品和临床上的广泛使用 ,使多糖生物资源成
为天然药物 、生物化学及生命科学的研究热点.
关于野木瓜多糖的研究至今鲜有报道 ,为了进
一步深入开发利用野木瓜这一食药两用的珍贵植物
资源 ,发挥其潜藏的经济价值 ,文中在对野木瓜水溶
性多糖的常规法提取和含量测定的基础上[ 9-10] ,对
其进行了酶法提取的有效尝试 ,并进一步对所提取
的水溶性多糖进行分离纯化和结构分析 ,为深入研
究野木瓜多糖的理化性质 、化学结构及生物活性提
供基础数据.
1 主要材料及设备
1.1 主要材料
野木瓜鲜果(贵州遵义天楼野木瓜有限公司提
供);纤维素酶(初始活力单位 1689U/g,上海伯奥生
物科技有限公司);酸性蛋白酶(上海楷洋生物技术有
限公司);二乙氨基乙基(Dicthylaminoethyl, DEAE)-
纤维素(上海试剂二厂);DEAE-52(Whatman进口分
装 ,北京经科宏达生物技术有限公司);琼脂糖凝胶
Cl-6B(Amersham进口分装 ,北京经科宏达生物技术
有限公司);其他试剂均为国产分析纯.
1.2 仪器设备
HH·SH-Z型电热恒温水浴锅(北京长安科学
仪器厂);SL2000电子天平 (澳豪斯公司);UV2550
紫外可见分光光度计(岛津公司);Nexus670型傅
立叶变换红外光谱仪(美国 Nicolet公司);N-1000V-
WB旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式会社);
BSZ-100自动部分收集器 (上海精科实业有限公
司);DDS-11A型电导率仪(上海虹益仪器仪表有限
公司);ALPHA1-4冷冻干燥机 、80-2B台式离心机
(上海安享科学仪器厂).
2 实验方法
2.1 粗多糖的提取分离
2.1.1 常规方法
野木瓜样品※预处理※石油醚回流脱脂※滤渣
80%乙醇索氏回流※滤渣挥干 ※90℃恒温水浴中
蒸馏水浸提 2h,重复一次※抽滤除渣※滤液真空浓
缩※加入 3倍体积的 95%乙醇※静置 24h※抽滤收
集沉淀※无水乙醇 、丙酮及无水乙醚分别洗涤※真
空干燥※粗多糖
2.1.2 纤维素酶法
在浸提过程中加入纤维素酶 ,以提取温度(45,
50 , 55℃), pH值 (4.0, 4.5, 5.0),加酶量(40, 50,
60U/g),提取时间(1.5, 2.0, 2.5h)为影响因素 ,进行
L9(34)正交试验.方差分析由正交实验助手 IIV3.1
软件完成.
2.2 粗多糖的纯化
2.2.1 脱蛋白
采用 95 %乙醇沉淀获得的粗多糖中含有较多
的蛋白质 ,为排除蛋白质的干扰 ,需寻求最有效的脱
蛋白方法.将常规 Sevage法 、酸性蛋白酶与 Sevage
法相结合法 、三氯乙酸法 3种脱蛋白方法进行比较.
2.2.1.1 Sevage法 [ 11]
将真空干燥后的粗多糖用少量蒸馏水溶解 ,按多
糖水溶液体积 1/3 ~ 1/4加入 Sevage试剂(氯仿 /正
丁醇体积比为 5∶1或 4∶1),混合振荡 20min,在离心
机中以 4000r/min离心 20min,去除多糖溶液层与
有机溶液层交界处的变性蛋白质 ,重复操作 8 ~ 12
次 ,直至中间无混浊沉淀为止.
2.2.1.2 酸性蛋白酶与 Sevage法相结合法
将酸性蛋白酶配制成 1g/L的酶溶液 ,粗多糖
用少量蒸馏水溶解 ,将蛋白酶液及多糖液以体积比
5∶100混匀 , 45℃保温 2h后 ,按 Sevage法脱蛋白 ,反
复操作 ,直至中间无混浊沉淀为止.
2.2.1.3 三氯乙酸法[ 12]
将真空干燥后的粗多糖用少量蒸馏水溶解 ,在
多糖水溶液中滴加 3%三氯乙酸直至溶液不再继续
混浊为止 ,在 5 ~ 10℃冰箱中放置过夜 ,离心去除沉
淀即得无蛋白质的多糖溶液.
2.2.2 脱色[ 13]
选用 D101大孔吸附树脂对多糖溶液进行脱
色 ,树脂的用量为每毫升饱和多糖溶液 0.04克干树
脂.将经过预处理的大孔树脂加入多糖溶液中 ,磁力
搅拌 1h,去除多糖色素.
2.2.3 透析
经过上述处理的多糖溶液 ,置于半透膜透析袋
(截留分子量 10 000Da)中 ,扎紧袋口 ,透析袋悬浮
于盛有蒸馏水的大烧杯中 ,磁力搅拌下透析 72h,每
8h换一次水 ,除去无机盐及低聚糖等小分子杂质 ,
取出袋内物测定其电导率小于 25ms/m时即可.将
袋内多糖溶液真空浓缩 、95%乙醇沉淀 ,真空干燥即
得野木瓜精多糖 CCP.
2.2.4 野木瓜多糖的分级
称取 100.00gDEAE-纤维素 ,用蒸馏水浸泡过
夜后抽滤 ,分别用 0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、
0.5mol/LNaOH浸泡 1h,再用蒸馏水依次处理至中
性 ,抽气装入层析柱(4.8cm×60cm),用蒸馏水平衡
24h.称取 0.85g野木瓜精多糖 CCP,溶于 40mL蒸馏
水中 ,上柱 ,分别用 0.0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0mol/L
NaCl溶液洗脱 ,控制流速为 1mL/min,自动部分收
集器收集 , 10mL/管 ,以硫酸 -苯酚法隔管跟踪检
测 ,收集同一洗脱峰含多糖各管样品[ 14] ,作洗脱曲
129 第 7期 王文平 等:野木瓜水溶性多糖的提取 、分离及结构分析
线 ,洗脱液经过真空浓缩 、透析 、冷冻干燥 ,得白色野
木瓜多糖洗脱组分 CCP1.
2.3 纯度鉴定
2.3.1 纸层析[ 15]
取新华 1号滤纸(3cm×20cm),距端点 1cm处
的中部以 CCP1水溶液点样 ,展层剂为正丁醇 ∶浓氨
水 ∶水 (40∶50∶5,体积比),饱和 2h以上 ,室温展层
6h,取出后吹干 ,用 0.5%甲苯胺蓝液染色 ,立即用
95%乙醇漂洗至背景褪色 ,观察斑点.
2.3.2 凝胶色谱法
称取野木瓜多糖洗脱组分 CCP1 10mg溶于
0.1mol/LNaCl溶液中 ,小心将其加到 SepharoseCl-6B
(1.5cm×90cm)琼脂糖凝胶柱中 ,对 CCP1进一步
分离纯化.以 0.1mol/LNaCl溶液洗脱 , 流速为
1mL/min,自动部分收集器收集 , 5mL/管 ,用硫酸 -
苯酚法隔管跟踪检测多糖 ,以试管数为横坐标 ,吸光
度为纵坐标 ,作洗脱曲线 ,合并同一洗脱峰的多糖
液 ,透析 、浓缩 、冷冻干燥 ,得野木瓜多糖纯品 CCP1.
2.4 结构特征分析
2.4.1 紫外光谱检测
取野木瓜多糖纯品 CCP1 1.00mg,蒸馏水溶解 ,
配成浓度为 60mg/L的多糖溶液 ,以蒸馏水为对照 ,
于 190 ~ 400nm处进行紫外扫描.
2.4.2 红外光谱检测
将凝胶柱色谱分离后的野木瓜多糖透析 、浓缩 、
冷冻干燥 ,得到白色纤维状疏松固体 CCP1 ,在远红
外灯照射下分别与 KBr混合研细后 ,以 KBr为本
底 ,在 4 000 ~ 400cm-1波数范围内进行红外扫描.
3 结果与分析
3.1 粗多糖的提取分离
用纤维素酶辅助提取野木瓜多糖 ,考虑到各因
素之间的相互关系 ,选用四因素三水平进行 L9(34)
正交实验 ,以进一步确定适宜的多糖提取条件.选取
的因素水平见表 1 ,实验结果及分析见表 2,方差分
析结果见表 3.
表 1 正交试验因素水平表
Table1 Factorsandlevelsoforthogonalexperiments
因素
水平
A
(温度 /℃)
B
(pH值)
C
(加酶量 /(U·g-1))
D
(时间 /h)
1 45 4.0 40 1.5
2 50 4.5 50 2.0
3 55 5.0 60 2.5
表 2 L9(34)正交实验结果
Table2 ResultsofL9(34)orthogonalexperiments
试验号 A B C D 多糖得率 /%
1 1 1 1 1 13.06
2 1 2 2 2 14.12
3 1 3 3 3 14.86
4 2 1 2 3 17.10
5 2 2 3 1 15.75
6 2 3 1 2 13.94
7 3 1 3 2 16.22
8 3 2 1 3 14.31
9 3 3 2 1 15.84
K1 42.04 46.38 41.31 44.65
K2 46.79 44.18 47.06 44.28
K
3 46.37 44.64 46.83 46.27
k1 14.013 15.460 13.770 14.883
k2 15.597 14.727 15.687 14.760
k3 15.457 14.880 15.610 15.423
极差 R 1.584 0.733 1.917 0.663
表 3 酶法浸提方差分析结果
Table3 Resultsofthevarianceanalysisfortheextractionwith
cellulose
方差来源 偏差平方和 自由度 F值 F0.5临界值 显著性
A 1.058 2 0.211 3.110 不显著
B 0.105 2 0.021 3.110 不显著
C 18.220 2 3.639 3.110 显著
D 0.642 2 0.128 3.110 不显著
误差 20.02 8 — 3.110 不显著
从表 2可以看出 ,各因素对纤维素酶法提取多
糖的影响主次顺序为 C>A>B>D.由表 2中数据
可见 ,最适酶法提取条件为 A2B1C2D3 ,即:提取温度
50℃, pH值 4.0,提取时间 2.5h,酶用量 50U/g.从
表 3方差分析结果来看 ,因素 C的影响比较显著.
按照正交试验优化的条件作 3次平行实验 ,结
果粗多糖的平均得率为 17.42%,硫酸 -苯酚法测
定其多糖含量为 67.12%.用常规热水浸提法提取
野木瓜粗多糖 ,多糖的得率为 10% ~ 12%,多糖含
量在 43%左右.采用常规热水提取法时 ,多糖很难
从细胞壁中释放出来 ,得率低 ,而且温度高 、时间长 ,
多糖易失活 ,成本高.酶法提取与常规热水浸提法相
比 ,不仅使提取的条件更为温和 ,效率更高 ,且野木瓜
粗多糖的得率及含量均有显著提高 ,是一种理想的提
取方法.
3.2 粗多糖的纯化
3.2.1 脱蛋白方法比较
利用 3种方法将粗多糖脱蛋白后 ,分别用考马
130 华 南 理 工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 第 36卷
斯亮蓝法和硫酸 -苯酚法测定多糖样品中蛋白含量
及多糖含量 ,结果见表 4.
表 4 3种方法的脱蛋白效果比较
Table4 Comparsionoftheresultsofremovingproteinsforthe
threemethods
方法 蛋白含量 /% 多糖含量 /%
Sevage法 2.54 78.3
酶解 +Sevage法 0.68 83.7
三氯乙酸法 1.26 70.4
由表 4可见 ,酶解与 Sevage法相结合脱蛋白 ,
多糖含量有所提高 ,蛋白脱除效果也好 ,既减少了常
规 Sevage法的操作次数 ,又避免了三氯乙酸法脱蛋
白引起的多糖降解损失.
3.2.2 粗多糖的分级
由于多糖的糖基一般为中性或酸性带负电荷的
糖分子 ,故可采用 DEAE-纤维素阴离子交换柱层析
进行分离纯化 ,粗多糖经 DEAE-纤维素柱分离后 ,
用 0.2mol/LNaCl溶液洗脱 ,得洗脱组分 CCP1 ,洗
脱曲线为单一对称峰 ,如图 1所示 ,说明 DEAE-纤维
素柱分离效果较好.
图 1 CCP1的 DEAE-纤维素层析柱图谱
Fig.1 ColumnchromatographyofCCP
1
onDEAE-cellulose
3.3 纯度鉴定
3.3.1 纸层析
野木瓜多糖 CCP1经纸层析 ,结果只有一个斑
点 ,证明为纯品.
3.3.2 凝胶过滤
经 DEAE-纤维素柱分离的多糖 CCP1 进行
SepharoseCl-6B琼脂糖凝胶柱层析 ,作出单一组分
鉴定洗脱曲线 ,如图 2所示 , CCP1纯化鉴定洗脱曲
线显示为单一对称峰 ,说明 CCP1是分子量分布均
一的组分.
图 2 CCP1的 SepharoseCl-6B凝胶层析柱图谱
Fig.2 GelcolumnchromatographyofCCP1 onSepharoseCl-6B
3.4 紫外光谱测定
对 CCP1进行紫外光谱扫描 ,结果如图 3所示.
图 3 CCP1的紫外吸收光谱
Fig.3 UltravioletabsorptionspectrumofCCP
1
由图 3可见 , CCP1在 260和 280nm处无紫外吸
收 ,表明 CCP1中不含蛋白质 、多肽及核酸.
3.5 红外光谱测定
CCP1经红外光谱检测 ,结果如图 4所示.
图 4 CCP1红外吸收光谱
Fig.4 InfraredabsorptionspectrumofCCP1
从红外光谱图可知 , CCP1具有典型的多糖吸收
峰 ,其特征吸收峰及所对应的功能基团见表 5[ 16-17] .
131 第 7期 王文平 等:野木瓜水溶性多糖的提取 、分离及结构分析
表 5 CCP1的红外光谱数据
Table5 DataofinfraredspectrumforpolysaccharideCCP1
吸收峰 /cm-1 特征基团
3420 O H伸缩振动
2937 CH3 , CH2 , CH等的 C H伸缩振动
1610 C O的伸缩振动
1410, 1320 C H变角振动
1146, 1110, 1022, 950 吡喃型糖环
880 β-糖苷键连接
4 结论
用纤维素酶法能有效地从野木瓜中提取粗多
糖 ,经脱蛋白 、脱色 、透析 、DEAE-纤维素离子交换层
析柱分离 ,可得洗脱组分 CCP1.通过纸层析 、凝胶色
谱柱鉴定证明 ,从野木瓜粗多糖中分离纯化的多糖
CCP1为单一组分;紫外光谱 、红外光谱分析进一步
表明 , CCP1是初次从该植物中分离得到的一种新的
多糖组分.
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132 华 南 理 工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 第 36卷
Extraction, SeparationandStructuralAnalysisofWater-Soluble
PolysaccharidesfromChaenomelescathayensis
WangWen-ping1 GuoSi-yuan1 Lilin1 WangMing-li2 MoLi-ping2
(1.SchoolofLightIndustryandFoodSciences, SouthChinaUniversityofTechnology, Guangzhou510640, Guangdong, China;
2.GuizhouProvinceKeyLaboratoryofFermentationEngineeringandBio-Pharmacy,
GuizhouUniversity, Guiyang550003, Guizhou, China)
Abstract:Inthispaper, first, crudewater-solublepolysaccharideswereextractedfromChaenomelescathayensis
usingcelulase, andtheoptimalextractionconditionsweredeterminedviaorthogonalexperiments, thatis, extracting
thepolysaccharideswithacelulosedosageof50U/gat50℃andpH4.0for2.5h.Next, theproteinsinthecrude
polysaccharideswereremovedbymeansofSevagemethodcombinedwithacid-resistantproteinase.Then, thepig-
mentsinthepolysaccharideswereremovedusingmacroporousresinandothersmal-moleculeimpuritieswerere-
movedviadialysis.Thus, finewater-solubleChaenomelescathayensispolysaccharides(CCP)wereobtainedand
furtherfractionated.Finaly, anelutioncomponentCCP1 wasseparatedviathecolumnchromatographyofDEAE-
celulose.AccordingtotheresultsofpaperchromatographyandSepharoseCl-6Bcolumnchromatography, CCP1 is
asakindofpurepolysaccharidewithasaccharidecontentof97.3% detectedbythephenol-sulfuricacidassay.
Moreover, astherearenoabsorptionpeaksofprotein(at280nm)andnucleicacid(at260nm)intheUVspec-
trumbuttherearetypicalcharacteristicabsorptionpeaksofpolysaccharidesintheIRspectrum, itisconcludedthat
CCP1 isanewkindofhomogeneouspolysaccharideseparatedfromChaenomelescathayensis.
Keywords:Chaenomelescathayensis;polysaccharide;extraction;purification;structuralanalysis
(上接第 127页)
FabricationofAutoclavedSilicateProductswithCeramic
PolishingPowdersasRawMaterial
WangGong-xun SuDa-gen ZhaoYi-xiang
(KeyLaboratoryofSpecialyFunctionalMaterialsoftheMinistryofEducation, SouthChinaUniversityof
Technology, Guangzhou510640, Guangdong, China)
Abstract:Autoclavedsilicateproductswerefabricatedwithceramicpolishingpowdersastherawmaterial.The
productswerethencomparedwiththosefabricatedwithflyash.Moreover, thehydrothermalproperties, mineralogi-
calcompositionsandmorphologiesoftheproductswereinvestigatedbymeansofIR, XRD, SEMandEDS, andthe
correspondingstrengthswerealsomeasured.Theresultsshowthattheautoclavedconditionisbeneficialtoinspiring
thepozolanicactivityofceramicpolishingpowders, andthat, ascomparedwithflyash, ceramicpolishingpowders
providemoreactivatedSiO2 forthereaction, thusloweringtheCa/Siratioofthehydrationproductandimproving
thestrengthoftheautoclavedproducts.Itisalsofoundthattheproductspossessthehigheststrengthatalime-to-
polishingpowdersmassratioof1∶3.
Keywords:ceramicpolishingpowder;flyash;autoclavedsilicateproduct;pozzolanicactivity;hydrationpro-
duct;strength
133 第 7期 王文平 等:野木瓜水溶性多糖的提取 、分离及结构分析