全 文 ：收稿日期:2011 － 09 － 21．
基金项目:湖北省自然科学基金团队项目(2009CDA115) ;湖北省高校产学研项目(CXY2009B037)．
作者简介:曾智(1986 － ) ，女，硕士生，主要从事野生植物资源的保护与利用的研究;* 通讯作者:罗兴武(1975 － ) ，男，硕士，讲师，主要从事
食品科学与工程方面的研究．
响应面法优化平枝栒子多糖提取工艺研究
曾 智1，2，3，郑小江1，2，3，肖 浩1，2，3，罗兴武1，3*
(1．生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000;
2．湖北省生物医药产业药用植物资源开发利用技术创新基地，湖北 恩施 445000;
3．湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)
摘要:在单因素试验的基础上，采用响应面法优化热水浸提平枝栒子多糖的工艺条件，应用 Box － behnken中心
组合试验方法进行三因素三水平的试验设计，以多糖得率为响应值进行响应面分析(RSA)．通过分析各个因素的
显著性和交互作用，得出平枝栒子多糖提取的最佳工艺条件为:温度 94℃、浸提时间 2． 3 h、料水比 1∶ 21，平枝栒子
一次的多糖提取率可达到 0. 865% ．
关键词:平枝栒子;多糖;提取工艺;响应面法
中图分类号:O636． 1 文献标识码:A 文章编号:1008 － 8423(2011)04 － 0452 － 04
Extraction Technique Research of Polysaccharides from Cotoneaster
horizontalis Decne via Response Surface Methodology
ZHEN Zhi1，2，3，ZHEN Xiao － jiang1，2，3，XIAO Hao1，2，3，LUO，Xin － wu1，3*
(1． Hubei Key Laboratory of Bilogical Resources Conservation ald Utilization，Enshi 445000，China;
2． Technological Innovation Base for Development and Utilization of Medicinal
Resources of Hubei Biomedical Industry，Enshi 445000，China;
3． School of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China)
Abstract:Based on single factor tests，the analysis extraction conditions of polysaccharides from Cotone-
aster horizontalis Decne were obtained through Box － benhnken central com，bination design and RSM with
three factors and three levels for each factor． In the analysis of each factors significant and interaction，the
results showed that the analysis extraction conditions of polysaccharidesare are as follows:extraction tem-
perature 94℃，ratio of material solvent 1∶ 21，extraction time 2． 3 h． Under such conditions，the one － time
extraction rate is up to 0． 865% ．
Key words:Cotoneaster multiflorus bunge;polysaccharides;extraction technique;response surface method-
ology
平枝栒子［1 － 2］(Cotoneaster horizontalis Decne)属于蔷薇目(Rosales) ，蔷薇科(Rosaceae) ，平枝栒子属(Co-
toneaster)．平枝栒子广布于我国陕西、甘肃、湖北、湖南、四川、贵州、云南． 平枝枸子属落叶或半常绿匍匐灌
木;高不超过 0． 5 m，枝水平开张成整齐两列状;小枝圆柱形，幼时外被糙付毛，老时脱落，黑褐色．叶片近圆
形或宽椭圆形，稀倒卵形．花期 5 ～ 6 月，果期 9 ～ 10 月．
近年来，大量研究表明多糖除了有免疫调节、抗肿瘤的生物学效应、抗衰老、降血糖、抗凝血等［3］作用
第 29 卷第 4 期 湖北民族学院学报(自然科学版) Vol． 29 No． 4
2011 年 12 月 Journal of Hubei University for Nationalities(Natural Science Edition) Dec． 2011
外，还具有抗氧化与抗病毒活性［4］，且其对机体毒副作用小．因此，对多糖的研究已经成为医药界的热门领
域．响应面法(response surface methodology)［5］是采用多元二次回归方法作为函数估计的工具，与传统的“正
交试验设计分析方法”相比，具有试验周期短，求得的回归方程精度高，能研究几种因素交互作用等优
点［6 － 7］．另外，王献等［8］分别采用热水浸提及超声波提取水溶性茯苓多糖，结果二者的提取率分别为 13. 0%
和 8. 6%，表明热水浸提多糖得率高．因此本实验中采用热水浸提、响应面的方法来优化提取工艺，以期得到
最佳的提取工艺条件．
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
平枝栒子采自于湖北省农业科学院中药材研究所(恩施市新塘乡长岭岗)．
无水乙醇(AR)、苯酚(AR)、浓硫酸(AR)、葡萄糖标准品(AR)、三氯甲烷(AR)、正丁醇(AR)．
1． 2 仪器与设备
FA －1004B电子天平 上海精密科学仪器有限公司;HWS12数显恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司;低速
大容量多管离心机 上海安亭科学仪器厂;紫外可见分光光度计 TU －1810北京普析通用仪器有限责任公司．
表 1 浸提温度对多糖提取率的影响
Tab． 1 The effect of of extraction temperature experiment of polysaccharide extraction
序号 1 2 3 4 5 6
温度 /℃ 50 60 70 80 90 100
多糖得率 /% 0． 249 0． 343 0． 539 0． 606 0． 681 0． 685
表 2 浸提时间对多糖提取率的影响
Tab． 2 The effect of of extraction time experiment of polysaccharide extraction
序号 1 2 3 4 5 6
时间 /h 1． 0 1． 5 2． 0 2． 5 3． 0 3． 5
多糖得率 /% 0． 361 0． 510 0． 565 0． 695 0． 707 0． 712
1． 3 方法
1． 3． 1 多糖提取工艺流程 平枝栒子→干燥→粉碎→浸提→定容→醇沉→去蛋白→取 1 mL→测吸光度．
1． 3． 2 提取工艺的主要步骤 精确称取平枝栒子粉末 0. 5 mg 置于 50 mL 的烧杯中，加入一定体积的蒸馏
水，在一定温度下水浴一段时间，4 800 r /min 离心 30 min 取上清液定容至 25 mL，取 5 mL加入 3 倍体积的无
水乙醇于 4℃冰箱中过夜，4800 r /min离心 15min取沉淀定容至 10mL，加入 sevage试剂 2． 4 mL去蛋白，然后
取 1 mL溶液测其吸光度．
1． 3． 3 多糖含量与提取率的测定
1． 3． 3． 1 测定方法 多糖含量与提取率的测定:采用苯酚 －硫酸法［9 － 12］．精密吸取上述去蛋白后的样品液
1． 0 mL，加入 1． 0 mL5%的苯酚溶液，然后加入 5 mL98%的浓 H2SO4 ．摇匀后在 40℃水浴中反应 15 min，再在
冷水中冷却 10 min，在 480 nm下测其吸光度．
1． 3． 3． 2 标准曲线绘制 精密称取 105℃下干燥至恒重的葡萄糖标准品 10． 00 mg，置于小烧杯中用蒸馏水
溶解，再定容至 25mL，摇匀，即配得葡萄糖标准溶液．取 7 支干净的试管，分别精密吸取葡萄糖标准溶液0． 0、
0． 1、0． 2、0． 3、0． 4、0． 5、0． 6 mL，分别加入蒸馏水补至 2． 0 mL，按上述方法分别加入新鲜配制的 5%苯酚溶
液［13］1． 0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸 5． 0 mL，摇匀后置 40℃水浴中加热 15 min，取出置冷水中冷却 10 min，用
分光光度计在波长 480 nm处测定吸光度，得标准曲线方程:y = 0． 123 2x － 0． 000 3，R2 = 0． 999 3．
2 结果与分析
2． 1 单因素实验
2． 1． 1 浸提温度对平枝栒子多糖提取率的影响 精确称取平枝栒子粉 0． 5 g，每个梯度称取 3 份，选取时间
2． 0 h、料液比 1 ∶ 12，分别在温度为
50、60、70、80、90、99℃提取，测得平
枝栒子多糖得率如图 1 中所示．
2． 1． 2 时间对平枝栒子多糖提取率
的影响 精确称取平枝栒子粉 0． 5
g，每个梯度称取 3 份，在温度为
90℃、料液比 1 ∶ 12 的条件下，各样
品分别提取 1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0、
3． 5 h，结果见表 2．
2． 1． 3 料液比对平枝栒子多糖提取
354第 4 期 曾 智等:响应面法优化平枝栒子多糖提取工艺研究
表 3 料液比对多糖提取率的影响
Tab． 3 The effect of ratio of material solvent experiment of polysaccharide extraction
序号 1 2 3 4 5 6
料液比 1∶ 8 1∶ 12 1∶ 16 1∶ 20 1∶ 24 1∶ 28
多糖得率 /% 0． 298 0． 455 0． 613 0． 729 0． 736 0． 741
表 4 响应面试验因素水平表
Tab． 4 Factors and levels of RAS test
因素
水平
－ 1 0 1
X1(温度)/℃ 81 90 99
X2(时间)/h 2． 0 2． 5 3． 0
X3(料液比)/(m·V
－1) 1∶ 16 1∶ 20 1∶ 24
率的影响 精确称取平枝栒子粉
0. 5 g，每个梯度称取 3 份，在温度
90℃、提取时间 2． 5 h，各样品料液比
分别为 1 ∶ 8、1 ∶ 12;1 ∶ 16、1 ∶ 20、
1∶ 24、1∶ 28，结果见表 3．
2． 2 响应面法优化提取工艺条件
根据 Box － benhnken 的中心组
合试验设计原理［5］，综合各单因素实验结果，以提取温度、料液
比、浸提时间为因素，采用响应面分析方法进行试验设计，试验设
计见表 4．
对浸提时间、温度、料液比作如下变换:X1 =(T － 90)/9，X2 =
(z － 20)/4，X3 =(t － 2． 5)/0. 5，以三次试验所得多糖提取率的平均值为响应值(Y) ，设计试验与设计结果见
表 5，15 个试验中，1 ～ 12 是析因试验，13 ～ 15 是中心试验，用来估计试验误差．
表 5 响应面试验设计与数据处理
Tab． 5 Program and results of RAS test
试验号 X1 X2 X3 提取率 /% 试验号 X1 X2 X3 提取率 /% 试验号 X1 X2 X3 提取率 /%
1 － 1 － 1 0 0． 629 6 0 － 1 1 0． 742 11 1 0 1 0． 808
2 － 1 0 － 1 0． 631 7 0 1 1 0． 768 12 1 1 0 0． 754
3 － 1 0 1 0． 729 8 0 1 － 1 0． 714 13 0 0 0 0． 860
4 － 1 1 0 0． 796 9 1 － 1 0 0． 858 14 0 0 0 0． 858
5 0 － 1 － 1 0． 652 10 1 0 － 1 0． 734 15 0 0 0 0． 864
所得结果，用响应面分析软件分析得到如下的结果:
表 6 Y的估计回归系数结果
Tab． 6 Result of estimated regression coefficients for Y
项目 系数 误差系数 T P 项目 系数 误差系数 T P
常数项 0． 861 0． 003 632 236． 941 0． 000 X3X3 － 0． 088 0． 003 274 － 26． 788 0． 000
X1 0． 046 0． 002 224 20． 736 0． 000 X1X2 － 0． 068 0． 003 146 － 21． 537 0． 080
X2 0． 019 0． 002 224 8． 485 0． 003 X1X3 － 0． 006 0． 003 146 － 1． 907 0． 115
X3 0． 040 0． 002 224 17． 758 0． 000 X2X3 － 0． 009 0． 003 146 － 2． 861 0． 035
X1X1 － 0． 047 0． 003 274 － 14． 495 0． 000 S = 0． 006 3 R － Sq = 99． 8% R － Sq(adj)= 99． 4%
X2X2 － 0． 054 0． 003 274 － 16． 480 0． 000
表 7 回归方程的方差分析
Tab． 7 Analysis of variance for Y
来源 DF Seq SS Adj MS F P
回归项 9 0． 093 068 0． 093 068 261． 24 0． 000
线性项 3 0． 032 352 0． 032 352 272． 44 0． 000
平方项 3 0． 041 888 0． 041 888 352． 74 0． 000
交互作用项 3 0． 018 828 0． 018 828 158． 55 0． 000
残差 5 0． 000 198 0． 000 198
失拟项 3 0． 000 179 0． 000 179 6． 40 0． 138
纯误差 2 0． 000 019 0． 000 019
总和 14 0． 093 266
由表 6 结果可知:温度、浸提时间的一次方及其二次方、料液比的二次方对平枝栒子多糖的提取率影响
都极显著(P ＜ 0． 01)．
通过软件分析结果得到平枝栒子多糖得率为响应值的最优方程为:
Y = 0． 861 + 0． 046X1 + 0． 019X2 + 0． 040X3 － 0． 047X
2
1 － 0． 054X
2
2 － 0． 088X
2
3 － 0． 035X2X3
其中 X1 =(T － 90)/9，X2 =(t － 2. 5)/0. 5，X3 =(z － 20)/4．
回归方程中各变量对指标(响应值)影响的显
著性是由 F 检验来判定的，概率 P 越小，相应变量
的显著性就越高．由表 6 可知，各因素的一次项及二
次项对响应值的影响都是极显著的，交互项 X2X3
是显著的．同时由表 7 也可以看出，回归模型的相关
系数 R2 = 0． 093 068 /0． 093 266 = 99． 78%，回归方程
也是极显著的．因此，该回归方程可以用来描述各因
素与响应值之间的关系，进而确定平枝栒子多糖提
取的最佳条件．对回归方程求一阶偏导数等于零，整
理可得如下三式:
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0． 046 － 0． 094X1 = 0 (1)
0． 019 － 0． 108X2 － 0． 035X3 = 0 (2)
0． 040 － 0． 176X3 － 0． 035X2 = 0 (3)
联立上述式(1)～ (3)解方程组得:X1 = 0． 489，X2 = 0． 109，X3 = 0． 206，代入 X1 = (T － 90)/9，X2 =
(t － 2. 5)/0. 5，X3 =(z － 20)/4，分别得到浸提温度 T = 94. 4℃、料液比 1∶ 20． 824、浸提时间 2． 099 h．但考虑
到实际操作的便利，将其最佳提取工艺条件修正为提取温度 94℃，料液比 1∶ 21，浸提时间 2． 1 h．
根据所得结果，由响应面分析软件得到如图 1 ～ 3．
从图 1 ～ 3 上可以形象地看出各因素的交互作用对响应值(多糖得率)的影响．根据以上 Box － benhnken
的中心组合试验，得到平枝栒子的最佳提取工艺条件为:提取温度为 95℃，料液比为 1∶ 21，浸提时间 2． 1 h．
3 结论
在单因素试验的基础上，通过 Box － Benhnken设计及响应面分析，建立了响应值与各因素之间的数学模
型，据此模型可以预测理论提取率为 0． 877% ．据此二次回归模型，确定了平枝栒子多糖的最佳提取工艺:提
取温度为 95℃，料液比为 1∶ 21，浸提时间 2． 1 h．按此工艺条件提取平枝栒子多糖，其一次实际提取率可达
0． 865% ．实际得率与理论值相差甚小，说明该模型能够很好地预测试验结果，可以简单快速地用来设计和分
析各种与此相关的试验．
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