全 文 ：收稿　1999-06-15　　　　修定　1999-11-23
毛蕊花和粟米草毛状根培养系统的建立(简报)
许铁峰　张汉明 　丁如贤 　李博华(第二军医大学药学院 , 上海 200433)
Establishment of Hairy Root Culture of Verbascum thapsus and Mollu-
go pentaphylla
XU Tie-Feng , ZHANG Hang-Ming , DING Ru-Xian , L I Bo-Hua(School of Pharmacy , Second Military Medical
University , S hanghai 200433)
　　提要　用发根农杆菌 A4、R1601 、ATCC15834
从毛蕊花和粟米草的无菌子叶中诱导出毛状根 , 经
高压纸电泳鉴定 ,这两种毛状根中均含有甘露碱 , 并
测定了它们的生长曲线。
　　关键词　毛蕊花　粟米草　毛状根
　　毛状根培养是 80年代以来在植物细胞
培养领域发展起来的一项新技术。毛状根培
养系统具有生长快速 ,不需要外源生长激素 ,
产生次生代谢产物稳定等优点[ 1] 。毛蕊花
系玄参科植物 ,是一味常用中药 ,具止血散
瘀 、清热解毒功效。粟米草为粟米草属一年
生草本植物 ,在我国广东 、海南等地有分布。
其有效成分粟米草皂甙 A(mollugogenol-A)
具抗真菌作用 ,最近研究表明它还具有较强
的杀精子作用[ 2] ,是一种有开发潜力的避孕
药。我们首次从这两种植物中建立起毛状根
培养系统 ,这将为改良性状和工业化生产药
用成分提供新的途径 。
材料与方法
　　植物有毛蕊花(Verbascum thapsus)与
粟米草(Mollugo pentaphyl la)。取两者的种
子用清水洗净 ,在75%乙醇中浸泡 1 min后 ,
再用0.1%HgCl2消毒 10 min ,以无菌水冲洗
5次 ,置于 MS0 培养基上 。毛蕊花 5 d和粟
米草 10 d后分别萌发 ,剪取生长 10 d的幼苗
子叶为外植体 ,于 MS0培养基上预培养 24 h
后用于转化 。发根农杆菌菌株 A4 、R1601 、
ATCC15834 感染前接于 YEB 固体培养基
上 ,于 25℃下活化 3次 ,然后转至 YEB液体
培养基中(R1601菌的培养基中加入 200 mg
·L-1卡那霉素),于黑暗和 25℃条件下以振
幅 2.5 cm 、100 r·min-1进行振荡培养 , 12 h
后用于感染外植体[ 3] 。
外植体转化实验时 ,取上述外植体浸入
处于对数生长期的农杆菌菌液中 ,共培养 20
min ,取出 ,用无菌滤纸吸干多余的菌液 ,置
于MS0 培养基上培养 24 h 后 ,移入含 300
mg·L -1头孢噻肟钠的 MS 固体培养基上 ,于
25℃、光照(2 000 lx)12 h·d-1条件下培
养[ 4] ,并以未经感染的子叶作对照。
毛状根长出 1周后选取 1 cm 以上者挑
至含 300 mg·L-1头孢噻肟钠的 MS 固体培
养基上继续除菌培养 ,继代培养两次后将培
养瓶置于 39.5℃的恒温箱中 48 h 以除菌 ,然
后将毛状根挑至不含激素的 1/2MS 液体培
养基中进行大量培养。
测定毛状根生长速率时 ,将毛状根置于
1/2MS 液体培养基中继续培养 , 35 ml
培养液/50 m l三角锥瓶 ,每隔 4 d收获 1次
毛状根并测其鲜重及干重 。鲜重用布氏漏斗
抽滤至无水滴下时测定 ,干重则是将样品置
于60℃中烘 12 h后测定 ,增长倍数按干重求
得。
分析冠瘿碱时 , 分别取这两种毛状根各
100 mg 置于 1 ml Eppendo rf管中 , 加入 100
μl 0.1 mol ·L-1 HCl 后捣成匀浆 , 以
20 000×g 离心 5 min , 取 10 μl上清液点样
423植物生理学通讯　第 36卷 第 5期 , 2000 年 10月
DOI :10.13592/j.cnki.ppj.2000.05.009
于Whatman 3MM 滤纸上进行高压纸电泳
(400 V , 30 mA)。电泳缓冲液为甲醇∶
醋酸∶水 (5∶15∶80), 40 min 后将滤纸取出
晾干 ,按 Morgan等[ 5]的方法用碱性 AgNO3
染色。以试管苗的正常根为阴性对照 ,甘露
碱(mannopine)标准品(1 mg·ml-1)为阳性
对照 。
结果与讨论
1　毛状根的获得
　　毛蕊花和粟米草子叶经 3种农杆菌感染
10 ～ 15 d 后均有毛状根长出 ,具白色根毛 ,
向上 、贴壁向上或沿培养基平长 , 失去向地
性。而未经农杆菌转化的子叶出根率较低 ,
并且向下长入培养基中 。3 种农杆菌感染效
率不同 ,对毛蕊花和粟米草来讲 ,均是 A4感
染效率最高。不同外植体诱导率也不相同 , 3
种菌对毛蕊花的诱导率均较粟米草高(表
1)。
2　毛状根生长速率
　　测定毛蕊花和粟米草的毛状根生长速率
的结果表明 ,培养在液体培养基中的毛状根
表 1　3种农杆菌诱导的毛蕊花和粟米草子叶的生根数
毛蕊花子叶
出根的外植体数 诱导率/ %
粟米草子叶
出根的外植体数 诱导率/ %
对照 7 23.3 5 16.7
A4 26 86.7 14 46.7
R1601 18 60.0 7 23.3
ATCC15834 14 46.7 8 26.7
　　实验中两种材料均采用 30个外植体 ,感染第 15 d时统计。
呈现出正常离体器官的生长模式。一开始毛
状根生物量随着时间进程而快速增加 ,粟米
草约 18 d时达到最大 ,毛蕊花约 21 d时达到
最大 ,以后毛状根的生物量逐渐下降(表 2)。
表 2　毛蕊花和粟米草的生长速率
测定时间/ d 毛蕊花
m(FW)/ g·瓶-1 m(DW)/ g·瓶-1 增长倍数
粟米草
m(FW)/ g·瓶-1 m(DW)/ g·瓶-1 增长倍数
0 0.32 0.030 0.28 0.024
3 0.34 0.036 1.2 0.33 0.032 1.3
6 0.61 0.059 2.0 0.54 0.049 2.0
9 1.17 0.110 3.7 1.03 0.099 4.1
12 2.20 0.210 7.0 1.79 0.176 7.4
15 3.41 0.331 11.0 3.45 0.333 13.9
18 4.67 0.457 15.2 5.90 0.588 24.5
21 5.59 0.560 18.7 5.87 0.583 24.3
24 5.52 0.547 18.2 5.83 0.571 23.8
27 5.50 0.538 17.9 5.29 0.530 22.1
424 植物生理学通讯　第 36卷 第 5期 , 2000 年 10月
　　另外 ,发根农杆菌转化植物时将自身 Ri
质粒的 T-DNA上的基因整合到植物细胞基
因组中 ,继而整合的基因诱导发根的产生 ,由
于整合进植物基因组中的 T-DNA 片段上有
冠瘿碱合成酶基因 ,这种基因可以在植物细
胞中表达 ,产生冠瘿碱合成酶 ,使植物能够合
成原来本身并不存在的冠瘿碱 。根据这一认
识 ,我们又用高压纸电泳技术 ,测得毛蕊花和
粟米草的毛状根中均含有甘露碱(资料略),
说明这两种毛状根确已被农杆菌转化。
参考文献
1　王关林 ,方宏筠.植物基因工程原理与技术.北京:科学
出版社 , 1998.237～ 238
2　Rajasekaran M , Nair AG R , Hellstrom WJG et a l.Sper-
micidal activity of an anti fungal saponin obtained from the
tropical herb Mollugo pentaphylla.Contraception , 1993 ,
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3　黄菊辉 ,周长久 ,秦凤琴等.发根农杆菌的 Ri T-DNA 对
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4　张荫麟 ,宋经元 ,吕桂兰等.丹参毛状根培养的建立和丹
参酮的产生.中国中药杂志 , 1995 , 20(5)∶269～ 271
5　Morgan A , Cox PN , Turner DA et al.Transformat ion of
tomato using an Ri plasmid vector.Plan t Sci , 1987 , 49∶
37～ 49
收稿　1999-09-06　　　　修定　2000-01-21
　 1　现地址:宜昌市园林局植物研究所(宜昌 443000)。
PP333及矮壮素对地被菊试管苗生根的影响(简报)
陈龙清　张雨琴1 　袁芳亭(华中农业大学林学系 , 武汉 430070)
Effects of PP333 and CCC on Rooting of Tube-plantlet in Ground-cover
Chrysanthemum
CHEN Long-Qing , ZHANG Yu-Qin , YUAN Fang-Ting(Department of Forestry , Huazhong Agricultural Uni-
versity , Wuhan 430070)
　　提要　以 1/ 2MS+NAA 0.1 mg·L-1为基本培
养基 ,附加 0.1 mg·L-1的 PP333 , 对地被菊试管苗
有促进生根 、抑制小苗节间伸长 、延缓生长的作用 ,
由此长成的小苗健壮 ,茎粗叶茂 , 移栽成活率高。
　　关键词　地被菊　生根培养　多效唑(PP333)
　矮壮素(CCC)
　　地被菊是北京林业大学新选育出的一类
适于露地栽培的新品种群 ,抗逆性强 ,耐粗放
管理 ,植株紧密低矮 ,花小而繁密 ,花团锦簇 ,
花期较长 ,适宜作为地被栽培 ,深得人们喜
爱[ 1] 。常规繁殖以扦插为主 ,而新选育的品
种 ,往往繁殖系数低 、速度慢 ,不能满足生产
上的要求。近年来 ,我们采用组织培养试管
苗方法获得成功 ,但苗较细弱 ,移栽时对环境
条件要求高 , 容易死亡。本文以多效唑
(PP333)和矮壮素(CCC)处理地被菊试管
苗 ,观察两者对延缓试管苗生长的影响 ,以求
获得移栽易成活的高质量试管苗的途径 。
材料与方法
　　地被菊品种“银杯” [ Dendrathema ×
grandi f lora cv.Silver Cup (“Yin Bei”)] 由
北京林业大学陈俊愉教授提供。试验于
425植物生理学通讯　第 36卷 第 5期 , 2000 年 10月