全 文 ：文章编号: 0258-879X ( 1999) 10-0764-03
粟米草毛状根的研究
许铁峰　张汉明　丁如贤　李博华　张巧艳　郑汉臣
摘 要　目的: 建立粟米草 (Mollugo pentaphylla L. )的毛状根培养系统并研究毛状根的生长特性。方法:分别用发根农杆菌
R1601, ATCC 15834和 A4感染粟米草无菌苗的子叶 ,获得毛状根 ,并筛选优质株系 ;用高压纸电泳法对毛状根进行甘露碱检
测 ;测定其生长曲线 ;比较不同基本培养液、不同 p H值对毛状根生长的影响。结果: 高压纸电泳结果显示 ,所获毛状根中均含
有甘露碱 ,表明毛状根中确已转入发根农杆菌的 T-DN A; 1 /2 M S0培养液 pH 5. 4～ 5. 8最适合粟米草毛状根的生长。结论:快
速生长的粟米草毛状根在药用活性成分的生产上将具有较大潜力。
关键词　粟米草 ; 毛状根 ; 发根农杆菌
中图分类号　 R 567. 21; R 282. 2　　　　文献标识码: A
Study on hairy roots of Mollugo pentaphylla L.
Xu Tiefeng, Zhang Hanming , Ding Ruxian, Li Bohua, Zhang Qiaoyan, Zheng Hanchen
( Department of Pharmacognosy , College of Pharmacy, Second Military Medical Univ ersity,
Shanghai, 200433)
ABSTRACT　 Objective: To establish the culture system of hai ry roo ts o f Mollugo pentaphyl la L. and to
study the g row th character o f hai ry ro ots. Methods: Hairy roo ts of Mollugo pentaphyl la L. w ere obtained
from the coly leden explants infected by Agrobacterium rhizogenes R1601, ATCC15834 and A4. The bet ter
lines w ere selected. Mannopine w as examined through paper elect ropho resis. The g row th curv e was ob-
tained and ex t rinsic factors (di fferent pH and dif ferent medium ) affecting the g row th of hai ry roo ts w ere
investigated. Results: The resul ts of paper elect ropho resis show ed that the hai ry ro ots contained
mannopine, this evidenced the integ ration of Ri T-DN A in the t ransfo rmed plants; 1 /2 M S0 liquid medium
and pH 5. 4～ 5. 8 are sui table for the g row th of hai ry ro ots of Mollugo pentaphyl la L. Conclusion: The
fast-g rowing hai ry ro ots of Mollugo pentaphyl la L. have g reat po tential on the production of activ e compo-
nent.
KEY WORDS　Mollugo pentaphylla L. ; hairy roo ts; Agrobacterium rhizogenes
[ Acad J Sec Mil Med Univ , 1999, 20( 10): 764～ 766 ]
⒇
　 粟米草 (Mollugo pentaphyl la L. )为粟米草属
(Mollugo L. )一年生草本植物 ,在我国广东、广西、
海南、云南有分布 [ 1] ,其有效成分为粟米草皂甙 A
( mollugogeno l-A) ,具抗真菌作用 ,最近研究表明它
还具有较强的杀精子作用 [ 2] ,是一味有开发潜力的
避孕药。
毛状根培养是 80年代在植物细胞培养技术领域
发展起来的一项新技术 ,毛状根培养系统具有生长
迅速、不需要外源生长激素、产生次生代谢产物稳定
等优点 [3 ]。由于粟米草野生资源极其有限 ,因此利用
毛状根培养生产药用活性成分将是解决资源短缺问
题的一条途径。我们对毛状根的诱导、最佳培养条件
的选择进行了研究 ,建立了粟米草的毛状根培养系
统。
1　材料和方法
1. 1　发根农杆菌的保存　将中科院北京遗传所提
供的 3种发根农杆菌 ATCC 15834, R1601, A4接种
于 YEB固体培养基 ,于 25℃ 培养 48 h后 ,置 4℃冰
箱保存 ,每两个月转接 1次 [4 ]。临用前于 Y EB固体培
养基、 25℃活化 3次 ,然后转至 Y EB培养液 ( R1601
的培养液中加入 200 mg /L卡那霉素 )于黑暗、 25℃ ,
100 r /min振荡培养 , 12 h后用于感染外植体。
·764· 第 二 军 医 大 学 学 报Acad J Sec Mi l M ed Univ　 1999 Oct; 20( 10)
⒇ 作者单位　第二军医大学药学院生药学教研室 ,上海 , 200433
许铁峰 ,男 , 1971年 9月生 ,硕士
1. 2　植物材料　取粟米草种子用清水洗净 ,在 75%
乙醇中浸泡 1 min,再用 0. 1% HgCl2消毒 10 min,无
菌水冲洗 5次 ,置于 MS0培养基上 , 9 d后萌发。取生
长 10 d的子叶及下胚轴作为外植体 ,于 MS0培养基
上预培养 24 d后用于转化。
1. 3　外植体的转化　将上述预培养的外植体分别
浸于处于对数生长期的农杆菌 R1601, ATCC
15834, A4菌液中 ,共培养 20 min,取出 ,用无菌滤纸
吸干多余的菌液 ,置于 MS0培养基上培养 24 h后移
至含 300 mg /L头孢噻肟钠的 MS固体培养基上培
养 , 25℃ ,光照 12 h /d,并以未经感染的粟米草子叶
和下胚轴为对照。
1. 4　毛状根的除菌　将感染后外植体上长出的毛状
根剪下移到新的含抗生素的培养基上 ,每周转接 1次 ,
转接 3次以后 ,将培养瓶放入 39. 5℃的恒温箱中除菌 ,
48 h后取出移到不含抗生素的 MS0培养基上。
1. 5　毛状根优质株系的筛选　将 M S0培养基上的
毛状根逐一分开 ,挑取长 2 cm左右者移入 1 /2 M S0
培养液中 , 50 ml三角锥瓶 ,每瓶一根 , 35 m l培养
液 , 20 d后观察生长情况 ,挑取生长迅速的进行继
代培养。
1. 6　甘露碱的检出　分别取 3种农杆菌感染获得的
毛状根各 100 mg置于 1 m l Eppendo rf管 ,加入 0. 1
mol /L HCl 100 μl ,捣 成 匀浆 , 4℃浸提 2 h,
1. 5× 104 r /min离心 5 min,取上清液 10μl点样于
Whatman 3 MM滤纸上进行高压纸电泳 ( 400 V, 30
m A) ,电泳缓冲液为 HCOOH CH3 COOH H2O
( 5 15 80)。40 min后将滤纸取出晾干 ,均匀浸入碱
性硝酸银溶液 ( 0. 625 g AgNO3溶于 50 ml丙酮 )中
染色 1 min,晾干后再浸入 10 m l 20% NaOH+ 90 ml
95%乙醇混合液中显影 5 min,最后再经 5%硫代硫
酸钠溶液中退色 20 min[5 ] ,晾干后拍照。以试管苗的
正常根为阴性对照 ,甘露碱标准品 ( 1 mg /ml )为阳
性对照。
1. 7　毛状根生长曲线的测定　取生长快速的株系
MR4在 1 /2 M S0培养液中进行测定 ,每 50 m l锥形瓶
接种毛状根鲜质量 0. 43 g (干质量 0. 047 g ) , 35 ml
培养液 ,共 30瓶。每 3 d测 1次鲜质量与干质量 ,每次
测 3瓶 ,以平均质量为指标绘制生长曲线。鲜质量系
用布氏漏斗抽滤至无水滴下时测得 ,干质量系 60℃
烘 12 h后测得。
1. 8　毛状根最佳生长条件的筛选
1. 8. 1　不同基本培养液对生长的影响　配制 MS0 ,
1 /2 M S0 , B5 , GB5 , W S等 5种不同的培养液 ,方法
同“生长曲线测定”项 , 18 d后称质量。
1. 8. 2　不同 pH值对生长的影响　配制 pH值分别
为 5. 0, 5. 4, 5. 8, 6. 2, 6. 6, 7. 0等 6种 1 /2 M S0培养
液 ,方法同“生长曲线测定”项 , 18 d后称质量。
2　结　果
2. 1　毛状根的获得　子叶外植体经 3种农杆菌感染
7 d后陆续有毛状根长出 ,长出的毛状根具白色根
毛 ,向上、贴壁向上或沿培养基平长 ,失去向地性 (见
图 1) ,而对照子叶出根率较低 ,并且向下长入培养基
中 , 3种农杆菌中以 A4感染效率最高。下胚轴作为外
植体无根长出。感染后第 14天时出根情况统计见表
1。
表 1　 3种农杆菌对子叶外植体感染的结果
Tab 1　 The results of cotyledon explants infected by
3 kinds of Agrobacterium rhizogenes
Number of
explan ts
Number of root-
ed explan ts
Induction
rate(% )
Con t rol 30 5 16. 7
A4 30 14 46. 7
R1601 30 7 23. 3
ATCC 15834 30 8 26. 7
2. 2　快速生长的优质株系的筛选　在 1 /2 M S0培
养液中培养 20 d后 ,观察各瓶中毛状根生长情况 ,
选出生长最快的二个株系 MR1和 M R4,均系子叶
经 A4感染后长出 ,以后各项实验均以 MR4为材料
(图 2, 3)。
2. 3　甘露碱的检出　高压纸电泳法检测结果显示 ,
在 3种农杆菌感染后获得的粟米草毛状根中均含有
甘露碱 ,表明毛状根确已转入农杆菌的 T-DNA。正
常根无甘露碱斑点 (图 4)。
2. 4　生长速率测定　实验结果见表 2,从表中可以
表 2　毛状根生长速率测定
Tab 2　 The growth rate of the hairy roots
(x-±s )
Time
( t /d)
Fresh mass
(m / g)
Dry mas s
(m /g )
Increased
mul tiples
0 0. 28± 0. 03 0. 024± 0. 004
3 0. 33± 0. 02 0. 032± 0. 004 1. 33
6 0. 54± 0. 02 0. 049± 0. 003 2. 04
9 1. 03± 0. 13 0. 099± 0. 008 4. 13
12 1. 79± 0. 19 0. 176± 0. 010 7. 33
15 3. 45± 0. 22 0. 333± 0. 018 13. 88
18 5. 90± 0. 20 0. 588± 0. 018 24. 50
21 5. 87± 0. 13 0. 583± 0. 022 24. 29
24 5. 83± 0. 18 0. 571± 0. 040 23. 79
27 5. 29± 0. 22 0. 530± 0. 039 22. 08
·765·第 10期 . 许铁峰 ,等 . 粟米草毛状根的研究
看出 ,毛状根生长量随时间而快速增加 ,约 18 d时
质量达最大 (增长倍数以干质量求得 ) ,以后毛状根
生长量随时间而下降。
2. 5　毛状根最佳生长条件的筛选
2. 5. 1　不同培养液对毛状根生长的影响　结果见
表 3,可见 1 /2 M S0培养液最佳。
2. 5. 2　不同 pH值对毛状根生长的影响　结果见
表 4,可见 pH值为 5. 4～ 5. 8时最佳。
表 3　不同培养液对毛状根生长的影响
Tab 3　 The ef f ect of diff erent liquid medium on growth of hairy roots
(x-±s )
M S0 1 /2 M S0 B5 GB5 WS0
Fresh mas s(m /g) 6. 73± 0. 18 7. 52± 0. 24 5. 48± 0. 31 4. 07± 0. 10 0. 88± 0. 06
Dry mass (m /g) 0. 60± 0. 03 0. 68± 0. 03 0. 49± 0. 02 0. 36± 0. 02 0. 08± 0. 004
Increased mul tiples 23 26 19 14 　　 3
表 4　不同 pH值对毛状根生长的影响
Tab 4　 The ef fect of dif f erent pH on growth of hairy roots
( x-± s )
pH Fresh mas s(m /g) Dry mass (m /g )
5. 0 6. 48± 0. 20 0. 60± 0. 04
5. 4 7. 88± 0. 23 0. 75± 0. 02
5. 8 7. 45± 0. 33 0. 71± 0. 04
6. 2 6. 38± 0. 21 0. 58± 0. 04
6. 6 6. 10± 0. 34 0. 57± 0. 03
7. 0 6. 21± 0. 42 0. 60± 0. 05
7. 4 5. 51± 0. 50 0. 53± 0. 05
3　讨　论
不同的菌株 ,不同的外植体材料 ,毛状根的诱导
率均不相同 ,我们采用 R1601, ATCC 15834, A4三
种菌株均诱导成功 ,但以 A4的效率最高。
由于整合进植物基因组中的 T-DNA片段上有冠
瘿碱合成酶基因 ,该基因可以在植物细胞中表达 ,产生
冠瘿碱合成酶 ,使植物能够合成原来本身并不存在的
冠瘿碱 ,所以我们以高压纸电泳检测冠瘿碱的方法来
验证 T-DNA是否在毛状根中整合和表达 [6 ]。
由于一条毛状根起源于一个细胞 ,所以我们把
外植体上的每条毛状根逐一分开 ,作为单克隆进行
培养 ,这样的培养物性能稳定 ,有利于提供稳定的次
生代谢产物 [3 ]。
来源不同的毛状根具有不同的生长速度 ,我们
通过筛选得到了生长快速的优质株系 M R1和
M R4。
发根农杆菌感染植物的方法通常有 3种 [ 7 ] ,即共
培养法、叶圆盘法和活体接种法 ,本实验采用叶圆盘
法 ,结果成功诱导出了粟米草的毛状根。 (本文图见
封三下 )
参 考 文 献
1　陶德定 . 国产粟米草属的分类研究 [ J ]. 云南植物研究 , 1990, 12
( 2): 129
2　 Rajas ekaran M, Nair AGR, Hel ls t rom W JG, et al . Spermicidal
act ivity of an an tifungal saponin ob tained f rom the t ropical herb
Mollu go p entaphyl la [ J] . Cont raception, 1993, 47( 4): 401
3　王关林 . 发根农杆菌 Ri质粒载体转化 . 见:王关林 ,方宏筠主编 .
植物基因工程原理与技术 [M ] . 北京: 科学出版社 , 1998. 237～
238
4　 谷正男 ,谷古力 ,芮和恺 . 甘草毛状根的研究 [ J] . 中药材 ,
1992, 15( 10): 3
5　 Morgan AJ, Cox PN, Turner DA, et al . Tran sformation of
tomato using an Ri plasmid vecto r [ J ]. Plant Sci, 1987, 49( 1): 37
6　黄菊辉 ,周长久 ,秦凤琴 . 发根农杆菌的 Ri T- DN A对茎用芥菜
的遗传转化 [ J] . 植物学报 , 1994, 36( 12): 911
7　路铁钢 ,孙敬三 . 细胞转化技术 . 见:孙敬三 ,桂耀林主编 . 植物
细胞工程实验技术 [M ] . 北京:科学出版社 , 1995. 241～ 268
( 1999-06-04收稿 , 1999-08-27修回 )
(本文编辑　姚春芳 )
三岁小儿烧碱当饮料 ,长征医院医生再造消化道
来自安徽 3岁的小儿赵旭明 ,因误服装在饮料瓶中的烧碱 ,造成食管烧伤高位狭窄 ,已完全不能进食 , 1个月来只能依靠静
脉输液维持营养。患儿已严重贫血 ,生命岌岌可危。其父母带小旭明四处求医 ,最后慕名来到长征医院。
患儿入院后 ,胸心外科主任徐志飞教授为其施行胃造瘘管术 ,经胃给予肠道营养支持 ; 3个月后在全麻下运用游离结肠与
口腔底部及梨状窝吻合重建消化道。术后患儿恢复正常进食 ,无任何并发症 ,体质量明显增加 ,营养状况亦明显改善。
·766· 第二军医大学学报　 1999年 10月 ,第 20卷
氧化苦参碱对乙型肝炎病毒转基因小鼠乙肝抗原表达的影响
(正文见第 746页 )
图 1　氧化苦参碱治疗前后小鼠肝脏内 HBsAg和 HBcAg的免疫组化结果 (× 400)
Fig 1　 Immunohistochemistry results of HBsAg and HBcAg in mice liver before
and af ter Oxy treatment (× 400)
A: HBsAg ( befo re t reatm en t) ; B: HBsAg ( af ter treatment ) ; C: HBcAg ( before t reatmen t) ;
D: HBcAg ( af ter t reatment )
粟米草毛状根的研究
(正文见第 764页 )
图 1　 A4感染 10 d后的子叶外植体
Fig 1　 Cotyledon explants 10 days after inoculat ion with A4
图 2　固体培养基上的毛状根
Fig 2　 Hairy roots on MS0 solid medium
图 3　液体培养基上的毛状根
Fig 3　 Hairy roots on 1 /2MS0 liquid medium
图 4　纸电泳图谱
Fig 4　 Paper electrophoresis
1: Negative cont rol; 2, 3: Hai ry root s; 4: Standard of oppine