全 文 ： Journal of Pharmaceutical Analysis 药物分析杂志
·1059· 药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 2016,36(6)
Chinese
　　*　 香港中药材标准（9211051）
　　**　 通信作者　Tel：13980038316；E-mail：028limin@126.com
第一作者　Tel：18820194128；E-mail：chunyan0229@126.com
HPLC法测定车前草中大车前苷和毛蕊花糖苷含量 *
赵春艳 1，2，李园园 2，王海星 2，黄椰青 2，张汉扬 2，李敏 1**
（1.成都中医药大学，成都 611137；2.香港城市大学，香港九龙塘 999077）
摘要　目的：建立测定车前草中大车前苷和毛蕊花糖苷含量的色谱方法，用于指导车前草药材的质量控制。
方法：在中国药典色谱条件的基础上，增加毛蕊花糖苷为指标性成分，改变流动相、柱温等条件，建立同时
测定大车前苷和毛蕊花糖苷的含量测定方法。色谱柱：Waters Xbridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流
动相：0.05%三氟乙酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~35 min，12%B→ 13%B；35~45 min，13%B→ 15%B；
45~50 min，15%B→ 17%B）；流速：1 mL·min-1；柱温：40 ℃；检测波长：330 nm；进样量：10 μL。结果：大
车前苷质量浓度在 0.49~250 mg·L-1范围内，毛蕊花糖苷质量浓度在 0.50~255 mg·L-1范围内，线性关系良
好。在稳定性、精密度试验中，大车前苷的 RSD分别为 0.22%和 0.36%，毛蕊花糖苷的 RSD分别为 0.15%
和 0.31%；在重复性试验中，车前和平车前中大车前苷的 RSD分别为 0.25%和 0.45%，毛蕊花糖苷分别为
0.20%和 0.11%。采用改进后的色谱条件和药典色谱条件测定车前草中大车前苷的含量，P<0.01，结果具
有显著性差异；改进后的色谱条件对于大车前苷及其类似物具有更好的分离效果。结论：改进后的色谱条
件结果准确，重复性好，可以用于车前草质量控制。
关键词：车前草；大车前苷；毛蕊花糖苷；HPLC；方法改进；含量测定；标准研讨
中图分类号：R 917　　　文献标识码：A　　　文章编号：0254-1793（2016）06-1059-06
doi：10.16155/j.0254-1793.2016.06.17
Study on the content determination of plantamajoside and
acteoside in Plantaginis Herba by HPLC*
ZHAO Chun-yan1，2，LI Yuan-yuan2，WANG Hai-xing2，HUANG Ye-qing2，
ZHANG Han-yang2，LI Min1**
（1. Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China；2. City University of Hong Kong，Hong Kong 999077，China）
Abstract　Objective：To establish an HPLC method for the determination of plantamajoside and acteoside in
Plantaginis Herba，so as to instruct the quality control of plantain herb．Methods：Base on the chromatography
condition in Chinese Pharinacopoeia，acteoside was used as a chemical maker for plantaginis Herbs．The mobile
phase and the column temperature have been optimized to simultaneously determine these two compounds．
HPLC analysis was carried out with a Waters Xbridge C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）．The HPLC
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·1060· 药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 2016,36(6)
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车前草为车前科植物车前 Plantago asiatica L.和
平车前 P.depressa Willd.的干燥全草，具有清热利尿
通淋、祛痰、凉血解毒的功效，常用于治疗水肿尿少、
暑湿泄泻、痰热咳嗽、吐血衄血、臃肿疮毒［1］。苯乙
醇苷类化合物为车前草的主要有效成分，是由咖啡酰
基和苯乙酰基与葡萄糖直接相连组成的糖苷类成分，
包括车前草苷 A、B、C、D、E、F［2］及大车前苷［3］、天
人草苷 A［2］、毛蕊花糖苷［3］等。大车前苷和毛蕊花
糖苷为车前草主要活性物质，具有良好的抗菌［4-5］、
抗炎［5］、抗氧化［5-7］等生理活性。中国药典 2015年
版一部规定，以大车前苷的含量作为 2种车前草质量
控制的指标。然而，笔者在实验过程中发现，车前和
平车前中苯乙醇苷类成分组成差异较大，前者主要含
有大车前苷，而后者主含毛蕊花糖苷。因此，如果仅
以大车前苷作为衡量指标，不能有效地评价车前草的
质量。此外，在实验中还发现，采用中国药典含量测
定方法，大车前苷及其异构体色谱峰重叠，不能很好
地将两者分离，含量测定不准确。为进一步完善车前
草的质量控制，本文在中国药典基础上，增加毛蕊花
糖苷作为检测指标，并改善大车前苷及其异构体的分
离度，建立了一种简便，易于操作，准确、稳定，重现性
好的车前草的质量控制方法。
1 　仪器与试药
1.1　仪器　Agilent 1260 Series高效液相色谱仪（美
国 Agilent公司，包括二元泵、自动进样器、DAD检测
器、色谱工作站）；AC-120H型超声波提取器（功率
100 W，频率 40 kHz，MRC公司）；电子天平（百万分
之一，Shinko公司）。
1.2　 试 药 与 试 剂　 大 车 前 苷 对 照 品（批 号
20140428，经实验室纯化后纯度达 98%以上）及毛
蕊花糖苷对照品（批号 20140415，纯度 >98%）购于
宝鸡市辰光生物科技有限公司。乙腈、甲醇为色谱
纯，水为去离子水，其余试剂为分析纯。
1.3　实验材料　10批次车前草药材，采自不同产
地，经成都中医药大学生药教研室李敏教授鉴定，样
品 CQC-1、CQC-2、CQC-3、CQC-4、CQC-5为 车 前
科植物车前 P.asiatica L.的干燥全草，样品 PCQ-1、
PCQ-2、PCQ-3、PCQ-4、PCQ-5为车前科植物平车
前 P.depressa Willd.的干燥全草。
2　方法与结果
2.1　药典色谱条件　色谱柱：Waters Xbridge C18（4.6
mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈 -0.1%甲酸溶液
（1783）；流速：1 mL·min-1；检测波长：330 nm；柱温：
室温；进样量：10 μL。
2.2　改进色谱条件　色谱柱：Waters Xbridge C18
（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流 动 相：0.05%三
氟 乙 酸（A）-乙 腈（B），梯 度 洗 脱（0~35 min，
12%B→ 13%B；35~45 min，13%B→ 15%B；45~50 min，
15%B→ 17%B）；流速：1 mL·min-1；柱温：40 ℃；检
测波长：330 nm；进样量：10 μL。
mobile phase consisted of 0.05% aqueous trifluoroacetic acid （A） and acetonitrile （B） with a gradient program
（0-35 min，12%B→ 13%B；35-45 min，13%B→ 15%B；45-50 min，15%B→ 17%B） at the flow rate of 1
mL min-1，the column temperature was 40 ℃，the detection wavelength was 330 nm，and the injection volume
was 10 μL．Results：Good linearity of the proposed method was shown in the range of 0．49-250 mg·L-1
for plantamajoside and 0.50-255 mg·L-1 for acteoside．In the test of stability and precision，the RSDs of
plantamajoside and acteoside were respectively 0.22%，0.36% and 0.15%，0.31%．In the test of repeatability，the
RSDs of plantamajoside and acteoside in P．asiatica L．and P．depressa Willd．were respectively 0.25%，0.45%
and 0.20%，0.11%．It was found that the quantity of plantamajoside is significantly different from the method in the
Chinese pharmacopeia （P<0.01）．The developed method showned adequate separation for pantamajoside from its
analogue．Conclusion：The developed method is accurate and repeatable，and therefore suitable for the quality
control of Plantaginis Herba．
Keywords：Plantaginis Herba；plantamajoside；acteoside；HPLC；method improvement；content determination；
standard discussion
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2.3　供试品溶液的制备　精密称取车前草粉末（过
3号筛）0.5 g于 50 mL离心管中，加入 60%甲醇溶液
20 mL，超声处理（功率 100 W，频率 40 kHz）15 min，
离心 10 min（约 4 000×g），转移上清液于 50 mL量
瓶中，残渣重复提取 2次，溶剂用量分别为 20 mL及
10 mL，合并提取液，以 60%甲醇溶液稀释至刻度，混
匀，用 0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.4　混合对照品储备液的制备　精密称取大车前苷
和毛蕊花糖苷的对照品各 10 mg，分别置于 10 mL量
瓶中，加入 60%甲醇（含 0.5%磷酸）溶液定容，即
得单一成分的对照品储备液，4 ℃保存备用；精密量
取大车前苷和毛蕊花糖苷的单一成分对照品溶液各
5 mL于同一 10 mL量瓶中，加入 60%甲醇（含 0.5%
磷酸）溶液稀释至刻度，混匀，用 0.22 μm微孔滤膜
滤过，即得混合对照品储备液。
2.5　线性关系考察　精密量取上述混合对照品储备
液 0.01、0.3、1.25、2.5、5 mL，分别置于 5个 10 mL量
瓶中，以 60%甲醇（含 0.5%磷酸）溶液稀释至刻度，
混匀，即得 1~5号混合对照品溶液；精密量取 10 μL，
按改进后的“2.2”项色谱条件进样测定，记录峰面
积，以质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进
行线性回归，得到大车前苷和毛蕊花糖苷的回归方程
（n=5）：
Y=16.25X-11.23　r2=1.000
Y=15.69X+10.44　r2=0.999 8
结果表明，大车前苷质量浓度在 0.49~250 mg·L-1
范围内，毛蕊花糖苷质量浓度在 0.50~255 mg·L-1范
围内线性关系良好。
2.6　精密度和稳定性试验　精密量取“2.5”项下 3
号混合对照品溶液 10 μL，按改进后的“2.2”项色谱
条件连续进样 5次，记录峰面积，计算得大车前苷和
毛蕊花糖苷的 RSD（n=5）分别为 0.22%和 0.15%；
并于室温下放置 0、2、4、6、8、12、24 h后，按改进
后的“2.2”项色谱条件进样测定，计算大车前苷和
毛蕊花糖苷峰面积的 RSD（n=7）分别为 0.36%和
0.31%。结果表明仪器精密度良好，对照品溶液在
24 h内基本稳定。
2.7　重复性试验　分别精密称取车前粉末（CQC-1）
和平车前粉末（PCQ-1）各 5份，分别按“2.3”项
下方法制备供试品溶液；分别精密吸取供试品溶液
各 10 μL，按改进后的“2.2”项色谱条件进样测定，
记录峰面积，计算得车前中大车前苷和毛蕊花糖苷
的平均含量（n=5）分别为 0.932%、0.017%，RSD分
别为 0.25%和 0.20%；平车前中大车前苷和毛蕊花
糖苷的平均含量（n=5）分别为 0.090%、1.095%，
RSD分别为 0.45%和 0.11%。故该方法重复性
良好。
2.8　回收率试验　　精密称取已知大车前苷含量
为 0.359%及毛蕊花糖苷含量为 0.011%的同批车前
药材 0.25 g，共 6份，每份加入大车前苷 0.9 mg和毛
蕊花糖苷 0.03 mg，按“2.3”项下方法，制成车前供试
溶液；精密称取已知大车前苷含量为 0.089%及毛
蕊花糖苷含量为 1.352%的同批平车前药材 0.25 g，
共 6份，每份加入大车前苷 0.22 mg和毛蕊花糖
苷 3.38 mg，按“2.3”项下方法，制成平车前供试溶
液。取上述 2种供试溶液，按改进后的“2.2”项色
谱条件测定峰面积，得到车前中大车前苷平均回收
率（n=6）为 102.2%（RSD=1.9%），毛蕊花糖苷平均
回收率（n=6）为 101.8%（RSD=3.9%）；平车前中大
车前苷平均回收率（n=6）为 102.0%（RSD=2.4%），
毛蕊花糖苷平均回收率（n=6）为 100.3%（RSD=
0.57%）。
2.9　样品测定　取各产地车前草药材粉末（过 3
号筛）0.5 g，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶
液；分别精密吸取“2.5”项下 3号混合对照品溶
液与供试品溶液各 10 μL，按改进后的“2.2”项
色谱条件进样测定，采用外标法计算样品中大车
前苷和毛蕊花糖苷的含量，结果见表 1，色谱图见
图 1。
2.9　改进的色谱条件与药典色谱条件比较　采用
改进后的色谱条件和药典色谱条件分别对市售大
车前苷对照品及车前和平车前中的大车前苷进行
测定，结果见表 1。HPLC图谱见图 2。由结果可
知，采用药典色谱条件进行测定时，大车前苷色谱
峰包埋了其他杂质峰（图 2-A），因而易造成测定结
果偏高，而改进后的色谱条件能够有效地解决此问
题（图 2-B）；采用 2种不同的色谱条件进行测定，
结果（表 1）存在显著性差异（P<0.01），故采用本
文改进后的色谱条件进行测定，测定结果更加准确
可靠。
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表 1　2种车前草中大车前苷和毛蕊花糖苷的含量（n=2）
Tab. 1　The content of plantamajoside and acteoside in Plantaginis Herba
编号
（No.）
产地
（origin）
批号
（batch No.）
基原
（source）
改进后色谱条件 药典色谱条件
大车前苷
（plantamajosde）/%
毛蕊花糖苷
（acteoside）/%
大车前苷
（plantamajosde）/%
1 香港牛潭尾（Ngau Tan Mei HongKong） CQC-1 P.asiatica L. 0.359** 0.011 0.385**
2 四川成都（Chengdu Sichuan） CQC-2 P.asiatica L. 0.941 0.019
3 河南许昌（Xuchang Henan） CQC-3 P.asiatica L. 1.764 0.011
4 湖北十堰（Shiyan Hubei） CQC-4 P.asiatica L. 1.216 0.023
5 广西藤县（Tengxian Guangxi） CQC-5 P.asiatica L. 0.378 0.019
6 辽宁永甸（Yongdian Liaoning） PCQ-1 P.depressaWilld. 0.089** 1.352 0.114**
7 辽宁宽甸（Kuandian Liaoning） PCQ-2 P.depressaWilld. 0.148 1.780
8 辽宁毛甸子（Maodianzi Liaoning） PCQ-3 P.depressaWilld. 0.080 0.896
9 辽宁凤城（Fengcheng Liaoning） PCQ-4 P.depressaWilld. 0.019 0.278
10 辽宁宽甸（Kuandian Liaoning） PCQ-5 P.depressaWilld. 0.112 1.169
　注（note）：2种测定色谱条件结果 **P<0.01，存在显著性差异（quantification result from two HPLC analysis **P<0.01，significant difference）
A.车前（P.asiatica L.） （CQC-2） 　B.平车前（P.depressa Willd.） （PCQ-2） 　C.混合对照品（mixed reference substances）
1.大车前苷（plantamajoside）　2.毛蕊花糖苷（acteoside）
图 1　车前草样品 HPLC色谱图（改进后的色谱条件下）
Fig. 1　HPLC chromatograms of Plantaginis Herba（from developed HPLC condition）
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3 　讨论
3.1　色谱条件的优化　本实验曾试用乙腈 -磷酸
及乙腈 -甲酸等流动相系统，但大车前苷与其类似
物（经 HPLC-MS/MS鉴别）分离效果均不理想。经
进一步优化最终确定了本文所述的流动相；在该色
谱条件下，大车前苷和毛蕊花糖苷与其他色谱峰分离
良好。本文对改进色谱条件进行方法学考察，结果表
明，该法稳定可行，结果可靠，可作为车前草质量控制
方法的补充。
3.2　提取方法的考察　在大车前苷和毛蕊花糖苷含
量测定实验中，曾以 60%甲醇为溶剂，比较了超声提
取和回流提取，结果表明二者无差异，故选择了简单
的超声提取方式；对比甲醇、10%甲醇、30%甲醇、
60%甲醇、80%甲醇、乙醇的提取效果，结果表明以
甲醇提取优于乙醇提取，其中以 60%甲醇为提取溶
剂时大车前苷和毛蕊花糖苷的峰面积最大，效果最
佳；同时对提取时间进行了考察，结果表明供试品分
别超声提取 15、30或 60 min，大车前苷和毛蕊花糖
苷的含量差异不大，因此在保证提取率的基础上，以
节约时间及成本为前提，选择超声提取 15 min；提取
次数考察实验中发现，第 4次提取液中大车前苷的
提取量占第 1次提取量的 0.69%，未检测到毛蕊花糖
苷，故提取 3次即可。
3.3　大车前苷的稳定性考察　通过对大车前苷对照
品溶液（溶于 60%甲醇）的稳定性研究，结果发现，
大车前苷在常温、中性及碱性环境中不稳定。故大车
前苷对照品溶液应于酸性环境中低温保存。因此，本
实验采用 60%甲醇（含 0.05%磷酸）为溶剂制备大
车前苷对照品溶液。
3.4　含量测定指标的选择　大车前苷和毛蕊花糖苷
为同系物，属于二糖类的苯乙醇苷类化合物，其母核
均由苯丙烯酸和苯乙醇部分分别通过酯键和糖苷键
与β-吡喃葡糖连接，前者葡萄糖 C-3’位上连有葡
萄糖，后者连有鼠李糖［8-9］。毛蕊花糖苷在植物体内
的生物合成途径已有报道，其苯丙烯酸部分来源于
苯丙氨酸或肉桂酸，羟基苯乙基来源于络氨酸或络
胺［10］。虽然，大车前苷具体的生物合成途径未见报
道，但是根据其结构特性，可推断它具有与毛蕊花糖
苷类似的合成方式［11］。同大车前苷一样，毛蕊花糖
苷具有抗氧化［12］、抗炎［13］等生理活性。根据实验结
果可知，平车前中大车前苷的含量极低，部分批次含
量低于药典规定的最低检测限，而毛蕊花糖苷的含量
约为大车前苷的数十倍；车前中大车前苷的含量亦
为毛蕊花糖苷的数十倍；2种车前草中所含的主要化
合物及其含量差异显著，故笔者建议采用车前草所含
的 2种主要苯乙醇苷类成分——大车前苷和毛蕊花
糖苷来对车前草进行质量控制。
3.5　市售对照品纯度探讨　通过对几个不同厂家所
售大车前苷对照品进行实验，发现目前市售大车前
苷对照品按改进的实验色谱条件测定，纯度均小于
98%，故改进车前草 HPLC含量测定色谱条件，能够
有效地检测市售对照品的纯度，利于车前草对照品纯
度的提高。
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A.中国药典色谱条件（ChP HPLC condition） 　B.改进后的色谱条件（developed HPLC condition）
1.大车前苷（plantamajoside）
图 2　2种色谱条件下大车前苷对照品 HPLC色谱图
Fig. 2　HPLC chromatograms of plantamajoside reference substance by two different HPLC conditions
Journal of Pharmaceutical Analysis药物分析杂志
·1064· 药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 2016,36(6)
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（本文于 2015年 11月 19日收到）