全 文 ：ChineseJournalofNewDrugs2009, 18(22)
2172　
中国新药杂志 2009年第 18卷第 22期
[基金项目 ] 　生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金(2007005)
[作者简介 ] 　但飞君 ,女 ,博士 ,主要从事天然产物的活性成分研究。联系电话:(0717)6397478。
·实验研究·
超声波提取红毛七多糖工艺研究
但飞君 1, 2 ,蔡正军 2 ,刘广志2 ,周大寨 1
(1湖北民族学院生物资源保护与利用湖北省重点实验室 ,恩施 445000;
2三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室 ,宜昌 443002)
[摘要 ] 　目的:建立超声波提取红毛七多糖的最佳工艺。方法:以多糖提取率为指标 ,在单因素试验的
基础上 ,采用正交试验对红毛七多糖的超声提取工艺进行优选 。考察了料液比 、超声波提取温度 、提取时间
及提取功率对红毛七多糖提取率的影响。结果:料液比和超声波功率对红毛七多糖提取率的影响起主要作
用 ,超声提取的最佳工艺为:红毛七料液比 1∶20,超声波功率为 70W,提取温度为 65℃,超声波提取时间 70
min。结论:该方法简便 、准确 、高效 ,在此工艺条件下多糖的提取率达 13.67%。
[关键词 ] 　红毛七;多糖;超声提取;正交试验
[中图分类号 ] R284.2　　　[文献标志码 ] A　　　[文章编号 ] 1003-3734(2009)22-2172-05
ExtractionofpolysaccharidesfromCaulophylum
robusutmMaxim.byultrasonictechnology
DANFei-jun1, 2 , CAIZheng-jun2 , LIUGuang-zhi2 , ZHOUDa-zhai1
(1 KeyLaboratoryofBiologicResourcesProtectionandUtilizationofHubeiProvince, HubeiInstitutefor
Nationalities, Enshi445000, China;2 HubeiKeyLaboratoryofNaturalProductsResearchandDevelopment,
ThreeGorgesUniversity, Yichang443002, China)
[ Abstract] 　Objective:Toestablishtheoptimalultrasonicprocedureforextractingpolysaccharidesfrom
CaulophylumrobusutmMaxim.Methods:Theoptimalconditionsofextractionprocessforpolysaccharidesfrom
CaulophylumrobusutmMaxim.wereselectedbyevaluatingtheextractiveyieldofpolysaccharidesasmarksbyor-
thogonalexperimentaldesign, investigatingtheratioofsolidtoliquid, andextractingtemperature, timeandpower.
Results:Themostimportantfactorsweretheratioofsolidtoliquidandextractingpower.Theoptimalprocedure
wasthatCaulophylumrobusutmMaxim.wasextractedwithultrasonictechnologyatsolid-liquidrationof1∶20, ex-
tractingpowerof70W, extractingtemperatureof65℃ andextractingtimeof70min.Conclusion:Theoptimal
procedureforextractingpolysaccharidesfromCaulophylumrobusutmMaxim.issimple, accurateandhighlyefi-
cientwiththepolysaccharidesyieldof13.67%.
[ Keywords] 　CaulophylumrobusutmMaxim.;polysaccharide;ultrasonicextracting;orthogonalexperi-
mentaldesign
　　红毛七为小檗科红毛七属植物类叶牡丹(Cau-
lophylumrobustumMaxim.)的根及根茎 ,具有理气
止痛 、祛风活血的功效 ,民间主要用于风湿 、胃腹疼
痛 、跌打损伤等的治疗 [ 1] 。文献报道红毛七具有抗
炎镇痛 、抗动脉粥样硬化 、增加细胞膜的通透性 、促
进受损组织修复 、抗肿瘤 、抗病毒 、抗心肌缺血和美
容等多种生物活性[ 2-5] ,多糖具有增强免疫功能 、抗
氧化 、抗肿瘤 、控制细胞分裂和分化 、调节细胞生长
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与衰老等多方面功能[ 6-7] 。这些药理活性是否与其
多糖成分有关有待研究 。超声波提取法在中草药化
学成分提取中具有省时 、节能 、提出率高等优点[ 8] ,
为此本实验对超声提取红毛七多糖进行工艺研究 ,
为进一步研究红毛七多糖的研究提供基础 。本实验
以多糖提取率为指标 ,通过单因素和正交试验法进
行红毛七多糖提取的最佳工艺优选 ,以期找出合理
可行的提取工艺。
仪器与试药
低温冷冻干燥仪 (美国 LABCONCO公司);
AL204电子天平(上海梅特勒 -托利多有限公司);S
-3100紫外分光光度计(美国 SCINCO公司);KQ
-100DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有
限公司), DHZ-9123A型电热鼓风干燥箱(上海一
恒科技有限公司);DZF-6021真空干燥箱(上海一
恒科技有限公司);LG10-2.4A高速离心机(北京
医用离心机厂);HH-6-恒温水浴锅(江苏金坛市
宏华仪器厂)。
红毛七为自采药材 , 2007年 7月采于湖北长阳
土家族自治区 ,经三峡大学汪鋆植教授鉴定为小檗
科红毛七属植物红毛七 (Caulophylum robustum
Maxim.)的 根。 葡 萄 糖 标 准 品 (AR, 批 号:
20070430,武汉洪山中南化工试剂有限公司);苯酚 、
乙醇 、乙酸乙酯 、丙酮 、无水乙醚 、浓硫酸 、氯仿 、正丁
醇均为分析纯 。
方法与结果
1　红毛七多糖提取与精制
取红毛七 200g,粉碎过 40目筛 ,乙酸乙酯回流
脱脂 3次 ,药渣晾干后以 70%乙醇回流 3次 ,晾干
得预处理的红毛七干粉 。
取预处理的红毛七干粉 5g,加入蒸馏水 ,按各
种设定条件(料液比 、提取时间 、超声功率 、提取温
度)进行超声波提取 。提取后 ,过滤 ,离心 ,得上清
液 ,浓缩 ,浓缩液经氯仿-正丁醇(4∶1)萃取 ,分出上
清层 ,除蛋白质。上清液离心 ,上清液加入乙醇至含
醇量为 80%,静置 ,离心 ,沉淀依次用无水乙醇 、丙
酮 、乙醚各洗 2次 ,真空干燥 ,即得精制红毛七多糖。
2　多糖含量测定方法的建立
2.1　葡萄糖标准曲线的制备 [ 9] 　精密称取 105℃
干燥至恒重的葡萄糖标准品 20mg,置 500mL量瓶
中 ,加蒸馏水溶解并稀释至刻度 , 配成 0.04 mg·
mL-1的标准溶液。然后精密移取标准溶液 0.4,
0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4 , 1.6, 1.8mL置于具塞试管
中 ,各以蒸馏水补充至 2.0mL,然后加入 6%重蒸
苯酚 1.0mL及浓硫酸 5.0mL,静止 10min,摇匀 ,室
温放置 20min后于 490nm测光密度 ,以 2.0mL水
按同样显色操作作为空白 ,以吸收度(A)对葡萄糖
浓度(C)作回归处理 ,得回归方程:Y=0.001 69+
0.045 24X。其相关系数 R=0.999 7。见图 1。
图 1　葡萄糖标准曲线
2.2　换算因子的测定　秤取干燥至恒重的红毛
七多糖精制品 20mg, 置 500 mL量瓶中 ,加适量
蒸馏水定容至刻度 ,摇匀 。量取溶液 2 mL于具
塞试管中 , 按测定标准曲线的方法测其吸收度 ,
平行实验 3次 ,求其平均值 。计算得红毛七多糖
换算因子 f=1.324。
按下式计算换算因子:f=W×103 / C·D。式
中 , W为多糖重量(mg), C为多糖中葡萄糖的浓度
(μg·mL-1);D为多糖的稀释倍数 。
2.3　多糖含量测定与多糖得率计算　多糖含量测
定:将干燥好的多糖研磨 ,称取 10mg溶于适量热蒸
馏水中 ,冷至室温后定容至 50 mL,摇匀 ,作多糖待
测液。吸取多糖待测液 0.2mL,按苯酚-硫酸法测定
多糖含量 [ 9] 。
多糖得率计算:多糖得率计算 =C·D·f·W1 /
(10×W×103)。式中 , C为从回归方程求得的葡萄
糖浓度 ,单位 μg·mL-1;D为稀释倍数;f为多糖换算
因子;W1为多糖总重;W为样品质量(5g)。
3　超声波提取红毛七多糖单因素试验
3.1　料液比对多糖得率的影响　称取 5g预处理
好的红毛七干粉 ,采用提取温度为 50℃,超声功
率为 70W,超声提取时间为 30min,然后在料液比
为 1∶8 , 1∶10, 1∶15 , 1∶20, 1∶25的条件下提取红
毛七多糖 ,抽滤;同样条件进行第 2, 3次提取 ,合
并滤液测定提取物中的葡萄糖含量并计算多糖
的得率 。结果见图 2。
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图 2　料液比对多糖得率的影响
结果表明 ,红毛七多糖提取率开始随料液比增
加而增加 ,当料液比为 1∶15时 ,多糖得率最高 ,以后
多糖得率随料液比增加而略有减小 ,考虑到溶剂用
量 ,选择 1∶10, 1∶15, 1∶20这 3个水平作正交试验。
3.2　提取温度对多糖得率的影响　采用料液比为
1∶10 ,超声功率为 70W、超声提取时间为 30min,
然后在 35℃, 50℃, 65℃, 75℃的温度下提取红
毛七多糖 ,抽滤;同样条件进行第 2 , 3次提取 , 合
并滤液测定提取物中的葡萄糖含量并计算多糖
的得率 。结果见图 3。
图 3　提取温度对多糖得率的影响
结果表明 ,在 35 ℃ ～ 65℃温度范围内随提取
温度的升高 ,多糖得率不断增加 ,当温度为 65℃时
多糖得率达到最大值 ,温度继续升高多糖得率反而
有所下降 。故选择 55℃, 65℃和 75℃这 3个水平
作正交试验。
3.3　超声提取功率对多糖得率的影响　在料液比
为 1∶10,提取温度为 50℃,提取时间为 30min,然后
在 50, 70, 90W的超声功率下提取红毛七多糖 ,抽滤;
同样条件进行第 2, 3次提取 ,合并滤液测定提取物中
的葡萄糖含量并计算多糖的得率 。结果见图 4。
结果表明 ,多糖得率随提取功率的增大而增加 ,
多糖得率在 70W时达到峰值后随提取功率的增大而
略有减少。故选择 60, 70和 80W这 3个水平作正交
试验。
图 4　超声提取功率对多糖得率的影响
3.4　提取时间对多糖得率的影响　采用料液比为 1
∶10,提取功率为 70W,提取温度为 50℃,然后在 30,
50, 70, 90, 110min的提取时间下提取红毛七多糖 ,抽
滤;同样条件进行第 2, 3次提取 ,合并滤液测定提取
物中的葡萄糖含量并计算多糖的得率 。结果见图 5。
图 5　提取时间对多糖得率的影响
　　结果表明 ,多糖得率随着提取时间的延长而增
加 ,但 70min以后多糖得率变化趋于平缓。考虑能
耗 ,故选择 70 , 90, 110min这 3个水平作正交试验。
4　确定红毛七多糖最佳提取工艺条件的正交试验
结合单因素试验 ,以料液比 、提取温度 、提取时间
及超声波频率为影响因素 ,采用正交试验确定各因素
不同对红毛七多糖提取率的影响 ,选用 L9(34)正交
表安排实验 ,以多糖得率为指标 ,优选最佳工艺 ,为了
提高统计分析的可靠性 ,每一条件重复实验 3次 ,测
定结果取其平均值供统计分析用。因素水平安排见
表 1,结果见表 2。
表 1　因素水平表
水平
因　素
料液比(A)提取温度(B)/℃
提取功率(C)
/W
提取时间(D)
/min
1 1∶10 55 60 70
2 1∶15 65 70 90
3 1∶20 75 80 110
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表 2　正交试验及结果
实验号 A B C D 多糖得率 /%
1 1 1 1 1 7.61
2 1 2 2 2 10.21
3 1 3 3 3 8.37
4 2 1 2 3 10.35
5 2 2 3 1 11.32
6 2 3 1 2 6.87
7 3 1 3 2 13.05
8 3 2 1 3 12.37
9 3 3 2 1 13.54
K1 26.19 31.01 26.85 32.47
K2 28.54 33.90 34.10 30.13
K3 38.96 28.78 32.74 31.09
K1(平均) 8.730 10.337 8.950 10.823
K2(平均) 9.513 11.300 11.367 10.043
K3(平均) 12.987 9.593 10.913 10.363
R 4.257 1.707 2.417 0.780
正交试验(表 2)结果显示 ,极差 R的大小顺序
为 A>C>B>D,即影响红毛七多糖提取率主次关
系依次是料液比 >超声功率 >提取温度 >超声时
间 。红毛七多糖的最佳提取工艺条件为 A3B2C2D1 ,
即料液比 1∶20,超声波功率为 70W,提取温度为 65
℃,超声波提取时间 70min。
表 3的方差分析结果显示 ,料液比 、超声波功率
各组因素间重复性差异极显著 ,对红毛七的多糖提
取率影响起主要作用 ,超声波提取温度和超声波提
取时间在此实验范围内没有显著差异 ,对测定结果
的影响较小 ,与直观分析结果(表 2)相吻合。
表 3　方差分析表
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A 30.797 2 33.402 9.000 显著
B 4.393 2 4.765 9.000
C 9.900 2 10.738 9.000 较显著
D 0.922 2 1.000 9.000
误差 0.92 2
5　验证实验
按照理论最佳工艺 A3B2C2D1 ,进行重复实验 3
次 ,红毛七多糖的提取率分别是 13.65%, 13.62%
和 13.74%,均高于正交试验的最大值 13.58%,其
平均值为 13.67%。证明在所试验的范围内 ,该工
艺为超声波提取红毛七多糖的最佳工艺。
6　超声波提取与传统水提法的比较
超声波提取与传统水提法的比较见表 4。
表 4　超声波提取与传统水提法的比较
提取方法 料液比 提取时间/min
提取温度
/℃
多糖得率
/%
超声波提取 1∶8 30 50 1.81
传统水提法 1∶8 120 50 0.67
讨　　论
多糖类化合物因其不良反应小 、能提高机体的
免疫功能并抑制肿瘤的生长 ,而受到广泛的重视 。
超声提取技术是利用超声波产生的强烈振动 、高的
加速度 、强烈的空化效应 、搅拌作用等 ,从而使药物
的有效成分较快进入溶剂的一种提取方法。由表 4
可知 ,超声提取方法比传统水提取方法具有提取时
间短 、提取率高等优势 ,提取过程温度也较低 ,避免
了高温对红毛七多糖分子结构的分解。
多糖常用的含量测定方法有苯酚 -硫酸法 、蒽
酮-硫酸法 、地衣酚-硫酸法等。其中苯酚-硫酸法是
多糖含量测定较为经典有效的方法之一 。其原理为
多糖在浓硫酸作用下 ,水解生成单糖 ,并迅速脱水与
苯酚缩合成橙黄色化合物 ,该化合物颜色深浅与糖
的浓度成正比。本实验结果表明苯酚-硫酸法测定
红毛七多糖方法简便易行 、且供试液稳定 、重现性
好 、便于实际应用 。另外 ,自动生化分析仪法 、高效
毛细管电泳法 、高效液相色谱法等直接测定法 ,这些
现代仪器测定方法准确 、快速 、灵敏 ,但未广泛应用 。
本实验通过单因素试验 ,以苯酚 -硫酸法测定多
糖的含量为指标 ,考察了料液比 、超声波提取时间 、
超声波功率和提取温度 4个因素对红毛七多糖提取
率的影响。通过正交试验确定液料比和超声波功率
对红毛七多糖提取率的影响起主要作用 ,红毛七多
糖提取最佳工艺为料液比 1∶20,超声波功率为 70
W,提取温度为 65℃,超声波提取时间 70min,经验
证实验得到红毛七多糖提取率达 13.67%。本实验
对红毛七多糖提取工艺研究得到的最佳工艺经济 、
简单 、稳定 、可行 ,对于红毛七药材合理充分开发利
用具有重要的意义。
[ 　参　考　文　献　]
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(下转第 2178页)
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2.3 (E)-6-[ (E/Z)-3-(1-吡咯烷基)-1-(4-甲基苯
基)丙烯基 ] -2-吡啶丙烯酸乙酯(6)　N2保护下 ,三
苯基-2-吡咯烷乙基磷溴化物 (按文献 [ 6, 7]自制 ,
(24.6g, 0.0559 mol),甲苯(210mL),冰浴冷却至 0
℃,缓缓加入 1.6mol·L-1正丁基锂 /正已烷溶液(37
mL, 0.0592mol),控制内温≤5 ℃,加毕于室温反应
6h,滴加 4(13.2g, 0.045mol)/甲苯(140mL)溶液 ,
加毕于 75℃反应 3 h,室温过夜 。加入 2mol·L-1盐
酸(140mL),搅拌 15min。分液 ,弃有机层 ,水层用
甲基叔丁基醚(30mL×3)洗涤 ,水层加入甲基叔丁
基醚(200mL),用浓氨水调 pH=9,分液 ,有机层用
水(20mL×3)洗涤 ,有机层用无水 MgSO4干燥 3h,
过滤 ,滤液浓缩 ,得深红色油状物 6(16.4g, 收率
97.5%, HPLC测定 E/Z约为 5∶6)。
2.4　阿伐斯汀(1)　6(10g, 0.0265mol), 98%浓
硫酸(16mL), 120℃反应 10min,冷却后 ,加入甲醇
(110mL),回流 1h,减压蒸除约 50mL甲醇 ,倾入
200g碎冰中 ,加入甲基叔丁基醚(100mL),浓氨水
调 pH=9 ,分液 ,水层用醚(20mL×2)提取 ,合并醚
层 。醚液用水洗三次 ,减压浓缩 ,得深红色油状物
(HPLC测定 E/Z约为 7∶3),用 95%乙醇(90mL)溶
解 ,加入 2mol·L-1氢氧化钠(20mL),回流 30min,
减压除去乙醇 ,剩余液用 1mol·L-1硫酸溶液调 pH
=7,减压蒸干 ,得红色固体 。用热异丙醇(20mL×
4)提取 ,合并提取液 , 4℃析晶过夜 ,过滤得粗品 1,
粗品用异丙醇重结晶 ,得白色固体 1(3.93g,收率
42.4%), mp222 ～ 224℃(分解)(文献 [ 4] :220℃
分解),元素分析 C22H24N2O2 ,测定值(计算值)%:
C75.54(75.83), H6.94(6.94), N7.95(8.04);IR:
3417(m, υNH);3050(m, υCH);2973, 2915, 2873(m,
υCH);1681 (s, υC=O);1640 (s, υC=C);809 (s,
δC-H);1HNMR(CDCl3):1.94(s, 4H);2.42(s, 3H);
3.06(s, 4H);3.53(d, 2H);6.65(d, 1H);7.08(d,
2H);7.20(d, 1H);7.25(d, 2H);7.39(d, 1H);7.44
(t, 1H);7.58(d, 1H);7.61 (t, 1H);13 CNMR
(CDCl3):21.29;23.38;52.46;53.79;121.67;122.
54;124.96;129.08;129.53;134.41;136.75;137.
58;139.29;143.89;153.89;155.80;172.73;MSm/
z:349.1863[ M+1] +。
结果与讨论
所得产物经元素分析 、红外 、氢核磁共振 、碳核
磁共振 、质谱确认结构 。对关键中间体(E)-3-[ 6-
[ (4-甲苯基)羰基 ] -2-吡啶基 ]丙烯酸乙酯 (4)的合
成过程中 ,选择经 HECK反应制备 ,缩短反应步骤 ,
并具有较高的反式构型选择性 ,同时针对文献中用乙
腈为溶剂 ,采用封管反应的条件做出改进 ,采用 DMF
作为溶剂 ,直接回流 ,避免封管 ,降低对设备的要求 ,
改进后反应步骤缩短 ,反应条件比较温和 ,对设备要
求降低 ,总收率为 17%,有较好的工业应用前景。
[ 　参　考　文　献　]
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编辑:王宇梅 /接受日期:2008-12-17
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编辑:周卓 /接受日期:2009-04-23