全 文 ：版社，1985．
［5］ 曹小芳，何 林，赵志模，等． 朱砂叶螨不同抗性品系酯酶同工酶
研究［J］ ．蛛形学报，2004，13(2):95．
［6］ 乔海娟．夜蛾科部分属种昆虫醋酶同工酶的比较研究［D］ ． 陕西
师范大学硕士论文，2000．
［7］ Chattopadhyay GK． Sengupta，AK． Verma AK，et al． Esterase isozyme
polymorphism，specific and nonspecific esterase，syngenic lines devel-
opment and natural occurrence of a thermostable esterase in the tropical
silkworm Bombyx mori L［J］ ． Insect Biochem Mol Biol，2001，31:
1191．
［8］ Monteiro EＲ，Bronzato AＲ，Orasmo GＲ，et al． Genetic diversity analy-
sis of Capsicum spp germplasm bank accessions based on α /β esterase
polymorphism［J］ ． Genet Mol Ｒes，2013，12(2):1155．
［9］ Valentini LC，Mangolin CA． Collet SA，et al． Esterase polymorphisms
for analysis of genetic diversity and structure of soybean (Glycine max)
cultivars［J］ ． Gene Mol Ｒes，2011，10 (4) :2472．
［10］ Sala J，Mangloin CA，Franzoni J，et al． Esterase polymorphism and the
analysis of genetic diversity and structure in cactus populations descen-
ded from cereus peruvianus plants regenerated in vitro［J］ ． Biochem
Genet，2011，49(3) :270．
［11］ 张 丹，高健伟，郑有良，王波． 毛木耳种质资源的酯酶同工酶分
析［J］ ．生物技术通报，2006，增刊:482．
收稿日期:2015-10-22; 修订日期:2016-03-30
基金项目:林业行业公益重大项目(No． 201304802)
作者简介:周文才(1978-)，男(汉族)，江西永新人，江西省林业科学院助
理研究员，博士学位，主要从事林木遗传育种、经济林研究工作．
* 通讯作者简介:龚 春(1975-)，女(汉族)，江西南昌人，江西省林业科
学院研究员，硕士学位，主要从事经济林研究与开发利用工作．
基于 ITS序列鉴定三叶木通与白木通
周文才，王玉娟，孙 颖，占志勇，田 径，左继林，龚 春*
(江西省林业科学院，江西 南昌 330013)
摘要:目的 应用 ITS条形码鉴定三叶木通与白木通中药材。方法 对三叶木通与白木通的 8 份材料的核糖体 DNA ITS
区序列进行测定与分析，同时利用 MEGA v5． 1 软件分析遗传距离并构建 NJ树。结果 ①参试的 8 份材料的 ITS 区序列
全长均为 653 bp，整个 ITS序列区共有 8 个碱基位点(1． 23%)发生了变异，其中在第 56 位碱基上，三叶木通为“G”，白木
通为“A”，该位点可作为三叶木通与白木通鉴别的关键位点;②三叶木通和白木通的亲缘关系很近，但仍可以根据 ITS序
列进行聚类分析加以鉴别。结论 ITS序列可对三叶木通与白木通中药材作出鉴别。
关键词:ITS序列分析; 三叶不通; 白木通
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2016． 06． 044
中图分类号:Ｒ282． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)06-1402-03
Molecular Identification of Akebia trifoliata (Thunb．)Koidz． and Akebia trifoliata var．
australis Based on ITS Sequence
ZHOU Wen-cai，WANG Yu-juan，SUN Ying，ZHAN Zhi-yong，TIAN Jing，ZUO Ji-lin，GONG Chun*
(Jiangxi Academy of Forestry，Nanchang 330013，China)
Abstract:Objective The aim of present study was to identify Akebia trifoliata (Thunb．)Koidz． and Akebia trifoliata var． aust-
ralis using the ITS barcode．Methods the rDNA ITS base sequences were measured and analyzed from 8 materials of Akebia trifoli-
ata (Thunb．)Koidz． and Akebia trifoliata var． australis，and on the basis of this，genetic distance was analyzed and Neighbor －
joining (NJ)tree was built using MEGA v5． 1． Ｒesults (1)The sequence length of each ITS of the 8 materials were 653 bp．
There were 8 mutation sites (1． 23%)in the whole ITS sequence． Akebia trifoliata (Thunb．)Koidz is ＇G＇ while Akebia trifoliata
var． australis is ＇A＇ in the first 56 bases，and then this site can be used as a key site for identification between these two species．
(2)There are very close genetic relationship between Akebia trifoliata (Thunb．)Koidz． and Akebia trifoliata var． australis，but
still can be identified by cluster analysis base on ITS sequence． Conclusion ITS Sequence can be used to authenticate the genu-
ineness of Akebia trifoliata (Thunb．)Koidz． and Akebia trifoliata var． australis．
Key words:Akebia trifoliata (Thunb．)Koidz．; Akebia trifoliata var． australis; ITS; Identification
三叶木通 Akebia trifoliata (Thunb．)Koidz． 和白木通 Akebia
trifoliata (Thunb．)Koidz． var． australis (Diels)Ｒehd，为木通科
(Lardizabalaceae)木通属(Akebia)植物，是常用中药材，主要分布
于黄河流域以南各省(区)［1］。长期以来，人们一直将其根、茎、
果实作为中草药，具有通筋活络、解毒、消炎、除湿、通乳等功
效［2，3］，此外其果实为肉质蓇葖果，营养丰富，甘甜味美，因此三
叶木通和白木通具有药用和食用双重价值，是极具开发价值的野
生植物资源。
白木通是三叶木通的变种，其表型很接近，其区别主要是三
叶木通叶边缘具波状圆齿或浅裂，先端常纯或略凹入，白木通叶
边全缘或近全缘，先端狭圆［1，4］。然而表型鉴定在很大程度上是
一种经验的总结，在实际操作中可能会因地理环境变化、生长发
育时期影响等多种因素发生变异而受到影响，因此传统的表型鉴
定方法很难进行准确鉴定。
随着分子生物学和生物信息学的发展，分子技术已被广泛应
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时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 6 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 6
用于药用植物鉴定。核糖体 DNA 内部转录间隔区又叫 ITS (in-
ternal transcribed spacer)序列，由 ITSl、5． 8 S和 ITS2 三部分构成。
被子植物的 ITS所受选择压力较小，核苷酸变异快，且在被子植
物中的长度保守，PCＲ扩增及测序简单易行，已广泛应用于被子
植物近缘物种间的分子鉴定、系统发育研究及种内变异等研
究［5 ～ 9］，本文通过测定三叶木通和白木通 rDNA 的 ITS 序列并进
行分析，旨在从分子水平对其提供鉴定依据。
1 材料和方法
1． 1 材料 采集三叶木通和白木通新鲜叶片，用酒精表面消毒后
置于硅胶快速干燥，用于后续 DNA 提取，具体材料及来源见
表 1。
1． 2 基因组 DNA的提取 称取约 0． 5 g干燥叶片，经液氮研磨成
粉末后，采用 SDS － CTAB 法提取材料 DNA，置于 － 20 ℃冰箱保
存备用。
1． 3 ITS序列的 PCＲ 扩增 ITS 序列扩增引物参照 Kitaoka 等实
验设计［10］，上下游引物分别为 Akebi － F(5＇－ GCTCCTACCGATT-
GAATGGT － 3 ＇)和 Ake － 26SＲ(5 ＇ － GTAAGTTTCTTCTCCTCCGC
－ 3＇)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。扩增反应体系
为 25 μl，其中 2． 5 μl 10 × Buffer、2． 0 μl dNTP (含 Mg2 +、2． 5
pmol /μl)，上下游引物各 1μl(10 μmol /L)，0． 2 μl Taq DNA 聚合
酶(2． 5 U /μl)、2μl模板 DNA (20 ng /μl)，ddH2O 定容至 25 μl。
PCＲ反应程序为:94 ℃预变性 4 min;94 ℃变性 1 min，55 ℃ 30
s，72 ℃ 1 min，30 个循环;72 ℃ 5 min;4 ℃保存。PCＲ 反应在
ABI公司生产的 GenAMP 9700 扩增仪上进行。
表 1 ITS序列区的长度及 G + C含量
编号 品种 采集地
ITS1
长度
/bp
G + C /%
5． 8S
长度
/bp
G + C /%
ITS2
长度
/bp
G + C /%
ITS
长度
/bp
G + C /%
SYJD 三叶木通 景德镇 269 64． 68 163 54． 60 221 67． 87 653 63． 25
SYWN 三叶木通 武宁 269 65． 06 163 54． 60 221 67． 87 653 63． 40
SYYS 三叶木通 玉山 269 64． 68 163 54． 60 221 68． 33 653 63． 40
SYNC 三叶木通 南昌 269 64． 68 163 54． 60 221 67． 87 653 63． 25
BMNC 白木通 南昌 269 65． 80 163 54． 60 221 67． 87 653 63． 71
BMND 白木通 宁都 269 64． 68 163 54． 60 221 67． 87 653 63． 71
BMJJ 白木通 九江 269 65． 06 163 54． 60 221 67． 87 653 63． 40
BMCY 白木通 崇义 269 65． 43 163 54． 60 221 67． 87 653 63． 55
1． 4 PCＲ 产物的测序 PCＲ 产物经纯化后，根据上下引物在 ABI
3730 测序仪上进行双向测序，再根据测序结果拼接出完整序列。
纯化、序列测定和拼接均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
1． 5 序列分析 根据 GenBank中木通的 ITS序列范围确定 rDNA
内转录区 ITSl、5． 8S 及 ITS2 的界限，获得 ITS 全长序列，将所得
序列利用 DNAMAN v6． 0 软件进行比对，并辅以人工校对，利用
MEGA v5． 1 软件获得序列 G + C含量信息，根据 Kimura － 2 参数
计算遗传距离，用 NJ 邻近法构建系统发育树，并以自展检验法
(bootstrap test)作 1000 次可信度分析。
2 结果
2． 1 三叶木通和白木通的 ITS 序列分析 根据 GenBank 中木通
试验 材 料 的 ITS 序 列 范 围 (GenBank 登 录 号:FJ868728，
FJ868728)，确定 rDNA内转录区 ITSl 和 ITS2 与 5． 8S 序列及 ITS
全长。测得样品 ITSl、5． 8S rDNA 和 ITS2 全序列共为 653 bp，其
中 ITSl序列长度为 269 bp，5． 8S rDNA 序列长度为 163 bp，ITS2
序列长度为 221 bp。说明 ITS序列长度保守性很高。
表 2 ITS序列变异位点
编号
变异位点 /bp
56 86 132 133 194 222 227 591
SYJD G T T A A G A T
SYWN G T T G A G A T
SYYS G T T A A G A C
SYNC G T T A A A C T
BMNC A T T A A G C T
BMND A C G A G G C T
BMJJ A C T A A G C T
BMCY A T G A G G C T
序列分析显示，三叶木通 ITSl 的(G + C)%含量在 64． 68%
～ 65． 06%之间，ITS2 的(G + C)%含量在 67． 87% ～ 68． 33%之
间。白木通 ITSl 的(G + C)%含量在 64． 68% ～ 65． 80%之间，
ITS2 的(G + C)%含量为 67． 87%。整个 ITS 序列区共有 8 个碱
基位点发生了变异，占了总共序列的 1． 23%，且变异位点稳定，
碱基的变异类型为 G － A、T － C、T － G、A － G 和 A － C，这些位点
可作为种质材料 DNA 指纹鉴别的信息位点。值得注意的是在
ITS序列的第 56 位碱基上，三叶木通样品全为“G”(见表 2)，而
白木通样品在该位点都由“A”取代了“G”，该位点可作为三叶木
通与白木通鉴别的关键位点。
2． 2 三叶木通和白木通的遗传距离及系统发育分析 利用
MEGA v5． 1 软件，以 Kimura － 2 参数计算遗传距离，结果(表 3)
表明三叶木通与白木通各个材料之间的遗传距离都很近，其中遗
传距离最大的仅为 0． 009，最小的为 0． 002。将上述 8 个序列用
邻接法(NJ)构建系统发育树(图 1)，结果表明，8 个样本可分为
两大组，第 1 组全为三叶木通，第 2 组全为白木通。由此可见，可
以通过系统发育树可以区分三叶木通和白木通的遗传进化关系，
进而为其鉴定提供依据。
表 3 ITS基因序列之间的遗传距离
编号
编号
SYJD SYWN SYYS SYNC BMNC BMND BMJJ BMCY
SYJD
SYWN 0． 002
SYYS 0． 002 0． 003
SYNC 0． 003 0． 005 0． 005
BMNC 0． 008 0． 009 0． 009 0． 008
BMND 0． 003 0． 005 0． 005 0． 003 0． 005
BMJJ 0． 005 0． 006 0． 006 0． 005 0． 003 0． 002
BMCY 0． 006 0． 008 0． 008 0． 006 0． 002 0． 003 0． 005
3 讨论
三叶木通和白木通在中国的分布非常广泛，由于环境的差异
而引起了表型的变异，这种变异使其具有广泛的遗传多样性，存
在丰富的形态学变异［11，12］。白木通是三叶木通的变种，两者在
形态上十分相似，按照传统形态学鉴定方法存在较大的局限性，
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因此从分子水平寻找快速准确鉴别方法显得很有必要。
图 1 基于 ITS序列构建的系统发育树
ITS序列分析技术具有技术简单、结果准确、稳定性好等优
点，Li等［13］建议将 ITS序列纳入到国际条形码鉴定的核心序列，
适用于种子植物鉴定研究。保曙琳等［14］对长江中下游地区野生
菱和栽培菱的 rDNA ITS序列进行分析，发现虽然菱属各居群间
rDNA ITS的差异较小，但是仍然可以用于鉴别野生菱和栽培菱;
易骏等［15］对孩儿参的 ITS 区间碱基序列进行测定，表明利用 ITS
区序列可以鉴别不同种质来源的孩儿参;马小军等［16］利用 ITS
序列对野山参和栽培参的不同品种进行了鉴别;罗玉明和夏至
等［17，18］分别利用 ITS序列可以准确鉴别紫苏与其他变种;这些都
说明 ITS序列在植物种质鉴定研究中发挥着重要作用。
本文通过测定并比较三叶木通和白木通的 ITS序列，发现样
品的 ITS1 和 ITS2 序列变异位点共有 8 个，根据信息位点和序列
对位排列，发现三叶木通和白木通的 ITS序列有 1 个具有鉴别意
义的碱基位点，即在第 56 位碱基上，三叶木通样本全为“G”，而
白木通在该位点全为“A”，因此该位点可作为三叶木通与白木通
鉴别的关键位点，也表明 ITS序列用于三叶木通和白木通的分子
鉴定是可行的。
G + C含量通常是反映亲缘关系的一个重要依据，亲缘关系
越亲近其 G + C含量越接近［19］。遗传距离是评价样本亲缘关系
的直接指标，利用遗传距离进行聚类分析可以更直观地了解样品
间的亲缘关系。本实验中各样本间的 G + C含量都很接近，预示
着各样本间亲缘关系很近，随后的分析结果表明三叶木通和白木
通的遗传距离很近，验证了其很近的亲缘关系。尽管如此，聚类
结果仍然可以将两者明显地区分出来，进一步表明利用 ITS序列
信息可以用于三叶木通和白木通的鉴定。
本研究利用 ITS序列的差异对三叶木通和白木通进行鉴定，
为其分子鉴定提供了依据。项目组还将继续收集不同地域的三
叶木通和白木通资源，为开展更全面的分子鉴定、系统发育等研
究提供基础。
参考文献:
［1］ 中国科学院中国植物志编辑委员会． 中国植物志(第二十九卷)
［M］．北京:科技出版社，2001:4．
［2］ 中国医药研究所． 中药志(第三卷)［M］． 北京:人民卫生出版社，
1960:270．
［3］ 李金光．木通属植物的化学成分分析研究概括［J］．中国野生植物，
1991，(1) :11．
［4］ 中科院植物研究所．中国高等植物图鉴(补编第一册)［M］． 北京:
北京科技出版社，1982． 482．
［5］ Bellarosa Ｒ ，Simeone M C ，Papini A ，et al． Utility of ITS sequence
data for phylogenetic reconstruction of Itatlian Querces spp［J］． Mol
Phylogenet Evol ，2005，34(2):355．
［6］ Kress WJ，Liu AZ，Newman M，et al． The molecular phylogeny of Al-
pinia (zingiberaceac) :a complex and polyphyletic genus of gingers
［J］． Am J Bot ，2005，92(1) :167．
［7］ Zhang YB，Shaw PC，Sce CW，et al． Molecular authentication of Chi-
nese herbal materials［J］． J Food Drug Anal，2007，15:1．
［8］ Balasubramani S P，Murugan Ｒ，Ｒavikumar K，et al． Development of
ITS sequence based molecular marker to distinguish Tribulus terrestris
L． (Zygophyllaceae) from its adulterants［J］． Fitoterapia，2010，81
(6) :503．
［9］ 严寒静，房志坚，余世孝，等．不同种源何首乌的 ITS 序列分析及其
亲缘关系研究［J］．西北植物学报，2008，28(5):0922．
［10］ Kitaoka F，Kakiuchi N，Long C F，et al． Difference of ITS sequences
of Akebia plants growing in various parts of Japan［J］． J Nat Med，
2009，63(3) :368．
［11］ 李秀华，肖娅萍，谢 娇，等． 三叶木通种质资源形态多样性研究
［J］．陕西师范大学学报(自然科学版)，2007，35(4) :88．
［12］ 李 丽，陈绪中，姚小洪，等．三种木通属植物的地理分布与资源调
查［J］．武汉植物学研究 2010，28(4):497．
［13］ Li D Z，Gao L M，Li H T，et al． Comparative analysis of a large data-
set indicates that internal transcribed spacer (ITS)should be incorpo-
rated into the core barcode for seed plant［J］． Proc Natl Acad Sci USA，
2011，108(49) :19641．
［14］ 保曙琳，丁小余，常 俊，等． 长江中下游地区菱属植物的 DNA 分
子鉴别［J］．中草药，2004，35(8):926．
［15］ 易 骏，廖芳平，郑伟文，等． 不同种质来源孩儿参的 rDNA ITS 区
序列分析及鉴别［J］．中草药，2013，44(10):1318．
［16］ 马小军，汪小全，肖培根，等，野山参与栽培参 rDNA 内转录间隔区
(ITS)序列比较［J］．中国中药杂志，2000，25(4):206．
［17］ 罗玉明，张卫明，丁小余，等． 紫苏属药用植物的 rDNA ITS 区 SNP
分子标记与位点特异性 PCＲ 鉴别［J］． 药学学报，2006，41(9):
840．
［18］ 夏 至，李贺敏，张红瑞，等．紫苏及其变种的分子鉴定和亲缘关系
研究［J］，中草药，2013，44(8):1027．
［19］ Ｒodríguez － Trelles F，Tarrío Ｒ，Ayala F J． Evidence for a high ances-
tral GC content in Drosophila［J］． Mol boil Evol，2000，17(11) :
1710．
·4041·
时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 6 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 6