全 文 ：第 24 卷第 3 期
2014 年 5 月
江 苏 大 学 学 报(医 学 版)
Journal of Jiangsu University(Medicine Edition)
Vol． 24 No． 3
May 2014
鳄嘴花正丁醇提取物对小鼠 Heps肝癌的抑制作用
刘旭1，郭文洁1，黄丹民1，2，高静1
(1．江苏大学药学院，江苏 镇江 212013;2．马来西亚百年生命科技有限公司，吉隆坡 57000)
［摘要］ 目的:研究鳄嘴花正丁醇提取物［Clinacanthus nutans (Burm． f．)Lindau n-butanol extracts，CN-N］对荷瘤小鼠
的体内抑瘤作用及延长生存时间作用。方法:肝癌细胞接种至 ICＲ小鼠右侧腋下，建立 Heps小鼠肝癌模型，随机分
成 4 组，对照组、环磷酰胺组、CN-N低剂量组(3 mg·kg －1·d －1)、CN-N高剂量组(10 mg·kg －1·d －1) ，每组 10 只，观
察 CN-N对荷瘤小鼠的抑瘤率、体质量、脾脏及胸腺指数、生存时间的影响。蛋白质印迹法检测增殖细胞核抗原(pro-
liferating cell nuclear antigen，PCNA)的表达，TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果:与对照组比较，CN-N低剂量组和高
剂量组肿瘤质量明显降低(t分别为 2． 261，3． 140，P 均 ＜ 0． 05) ，荷瘤小鼠脾脏指数、胸腺指数差异无统计学意义(P
均 ＞ 0． 05) ，PCNA表达均明显减少;CN-N 高剂量组生命延长率为 54． 8%，较对照组明显延长荷瘤小鼠生存期(t =
3． 416，P = 0． 003 1)。结论:鳄嘴花正丁醇提取物具有良好的抗肿瘤作用，高剂量 CN-N能提高荷瘤小鼠的生存期。
［关键词］ 鳄嘴花;正丁醇提取物;抗肿瘤;细胞凋亡
［中图分类号］ Ｒ965 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1671 － 7783(2014)03 － 0211 － 05
DOI:10． 13312 / j． issn． 1671-7783． y140002
［作者简介］刘旭(1988—) ，男，硕士研究生;高静(通讯作者) ，教授，博士生导师，E-mail:jinggao@ ujs． edu． cn
Inhibitive effect of Clinacanthus nutans (Burm． f．)Lindau
n-butanol extracts on Heps hepatoma in mice
LIU Xu1，GUO Wen-jie1，HUANG Dan-min1，2，GAO Jing1
(1． School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China;2． Bio Nice Industry Sdn Bhd，Kuala Lumbur 57000，Malaysia)
［Abstract］ Objective:To investigate the anti-tumor activity and life extention effect of Clinacanthus nu-
tans (Burm． f．)Lindau n-butanol extract (CN-N)on tumor loaded mice． Methods:Mice hepatoma carci-
noma cells (Heps，grown in donor mice)were transplanted subcutaneously into armpit of the ICＲ mice to
establish the tumor xenografts model． Tumor mice were randomized into four groups:control group，cytoxan
group，CN-N low dose group (3 mg·kg －1·d －1) ，CN-N high dose group (10 mg·kg －1·d －1)． Tumor
inhibition rate，body weights，immune organs index and life-prolonging effect were recorded． Proliferation of
tumor cells were detected by western blotting and apoptosis was examined by TUNEL assay． Ｒesults:Com-
pared with the control group，CN-N low dose group and high dose group showed remarkable inhibition of
tumor weight (t = 2． 261，3． 140，both P ＜ 0． 05) ;no significant differences on spleen and thymus index of
tumor-bearing mice(both P ＞ 0． 05)． PCNA expression levels were greatly reduced when treated with low or
high concentration of CN-N． Compared with the control group，CN-N high dose group significantly extended
the survival time(t = 3． 416，P = 0． 003 1)． Conclusion:CN-N exhibited good antitumor activity and sig-
nificantly prolonged the survival time of the tumor-bearing mice．
［Key words］ Clinacanthus nutans;n-butanol extracts;antitumor;apoptosis
肝癌是全世界最普遍最致命的恶性肿瘤之一，
且治疗手段非常有限［1］。目前，肝癌的治疗方法主
要为外科手术切除及肝移植，但只适用于 10% ～
25%的患者［2］，因为大部分患者被确诊时已是肝癌
晚期［3］。治疗肝癌的一线药物主要有有 5-氟尿嘧
啶、长春新碱、环磷酰胺、顺铂和阿霉素等，但大多是
非选择性的细胞毒药物，毒副作用强［4］。大部分肝
癌患者因条件限制无法接受有效治疗，因此，研发高
效低毒的抗肝癌新药极为必要。
鳄嘴花［Clinacanthus nutans (Burm． f．)Lindau］
属于爵床科鳄嘴花属，是泰国传统药物中广泛应用的
药用植物，分布于中南半岛、马来半岛以及我国的广
西、广东、云南、海南等地。在马来西亚，泰国等地，鳄
嘴花作为一种传统的药材用于治疗蛇叮咬，精神紧
张，糖尿病，类风湿关节炎，肝炎以及抗病毒等。鳄嘴
花氯仿提取物对肿瘤细胞有显著的抑制作用［5］，但鳄
嘴花正丁醇提取物(Clinacanthus nutans (Burm． f．)
Lindau n-butanol extracts，CN-N)是否有抗肿瘤作用，
未有公开报道。本研究旨在建立小鼠 Heps 肝癌实
体瘤模型，探讨 CN-N 的抗肿瘤效果并初步研究其
可能机制。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
实验用小鼠肝腹腔积液瘤 Heps 细胞由江苏省
肿瘤医院提供，小鼠腹腔积液传代;注射用环磷酰胺
购自通化茂祥制药有限公司(产品批号 130601) ;
TUNEL试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公司;
β-肌动蛋白、PCNA抗体购自 Santa Cruz公司。
环磷酰胺用生理盐水配成 2 mg·mL －1的溶液，
备用;鳄嘴花由马来西亚百年生命科技有限公司提
供。鳄嘴花全株干品粉末 1． 5 kg，于 5 L 95%乙醇
浸泡 2 周，抽滤取滤液，料渣烘干，95%乙醇提取 2
次，料液比分别为 1 ∶ 5，1 ∶ 3，时间分别为 2． 5、2 h，
抽滤取滤液。料渣烘干，用 60%乙醇提取 2 次，料液
比分别为 1 ∶ 5，1 ∶ 3，时间分别为 2． 5、2 h，抽滤取滤
液。合并所有滤液，浓缩得浸膏。冷冻干燥得干粉，
正丁醇提取，冷冻干燥得干粉，配成所需浓度，备用。
1． 2 动物分组及处理
ICＲ小鼠 94 只，SCXK(苏)2013-0011，4 ～ 5 周
龄，体质量 18 ～ 22 g，由江苏大学动物中心提供;建
立肿瘤皮下移植瘤模型［6］:在腹腔积液瘤模型鼠腹
腔内培养 Heps腹腔积液瘤株，7 d 后，将腹腔积液瘤
模型鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡 5 min，腹腔穿刺
取腹腔积液，计数并用生理盐水稀释至细胞密度为 2
×107个 /mL;取 0． 2 mL Heps (4 × 106个 /只)瘤细胞
悬液接种于 ICＲ小鼠右侧腋下，48 h 后，游标卡尺测
量瘤体的长径和宽径，计算肿瘤体积。
将造模成功的小鼠根据肿瘤体积平均分成 4
组，每组 11 只，分别为对照组，环磷酰胺组，CN-N低
剂量组，CN-N高剂量组;分别给予生理盐水，20 mg /
kg环磷酰胺，3、10 mg /kg CN-N。环磷酰胺组于腹
腔注射给药，其余组灌胃给药，每只小鼠的注射量均
为 0． 2 mL，1 次 /d，连续 11 d。每天观察小鼠的生
长、体质量、饮食和活动度;游标卡尺测量肿瘤长径
(a)和宽径(b) ，计算肿瘤体积，V = 1 /2·a·b2。
11 d 后颈椎脱臼处死小鼠，剥离肿瘤，称重。
取小鼠脾脏、胸腺并称重。计算公式:抑瘤率(%)
= (对照组平均瘤重 －给药组平均瘤重) /对照组
平均瘤重 × 100 %;脾脏指数 =脾脏质量(g) /体质
量(g) ;胸腺指数 =胸腺质量(g)/体质量(g)。
1． 3 生命延长实验
实验方法同上，将造模成功的 50 只 ICＲ小鼠根
据肿瘤体积平均分成 5 组，每组 10 只，分别为对照
组，环磷酰胺组，CN-N1 组，CN-N2 组，CN-N3 组;分
别给予生理盐水，20 mg /kg环磷酰胺，1、3、10 mg /kg
CN-N，方法同“1． 2”。记录小鼠死亡天数，绘制存活
曲线，计算延长率，延长率 =(给药组平均存活时间
－对照组平均存活时间)/对照组平均存活时间。
1． 4 肿瘤组织形态学观察
取肿瘤组织，4%低聚甲醛固定、脱水、石蜡包
埋、切片。苏木精-伊红(HE)染色，普通光镜下观察
肿瘤组织坏死，血管充血等情况。
1． 5 TUNEL法检测肝癌细胞凋亡
实验方法参照 TUNEL试剂盒说明书进行。
1． 6 蛋白质印迹法检测 PCNA的表达
取“1． 2”中对照组，CN-N低剂量组(3 mg /kg) ，
CN-N高剂量组(10 mg /kg)肿瘤组织，每组随机抽
取 3 个样，提取蛋白，BCA 法测定蛋白含量。进行
SDS-PAGE凝胶电泳后，转移到硝酸纤维素膜，封闭
后分别加入 β-肌动蛋白、PCNA，4 ℃孵育过夜，洗膜
以后加入对应二抗，室温摇床孵育 2 h后，TBST洗 3
次，每次 10 min。ECL发光剂显示阳性条带，在 Ty-
phoon分子成像系统上记录结果。
1． 7 统计学分析
采用 SPSS 19． 0 软件，数据以平均数 ±标准差
(珋x ± s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，
多个处理组与对照组的比较采用 Dunnett-t 检验，P
＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 CN-N对 Heps肝癌生长的作用
给药第 11 天时存活小鼠的肿瘤形态见图 1。
肉眼观，与对照组相比，其他 3 组肿瘤体积减小。给
药到第 11 天时，环磷酰胺组小鼠死亡 3 只。环磷酰
胺组，CN-N 低剂量组，CN-N 高剂量组 3 组抑瘤率
212 江苏大学学报(医学版) 第 24 卷
分别为 73． 4%，41． 0%，61． 7%，与对照组比较，肿
瘤质量明显降低(F = 9． 069，P = 0． 001)。与 CN-N
低剂量组比较，CN-N 高剂量组肿瘤质量更低(t =
2． 695，P = 0． 013 6)。从第 3 天开始，给药组肿瘤体
积增速放缓。从第 4 天开始，药物显著抑制肿瘤生
长，表明 CN-N有明显的抑制肿瘤生长的作用，且高
剂量效果更佳。见图 1。
a:P ＜ 0． 05，与对照组比较
图 1 鳄嘴花正丁醇提取物对小鼠肿瘤生长的作用
2． 2 CN-N对小鼠体质量及免疫器官指数的影响
与对照组比较，CN-N 低剂量组和高剂量组小
鼠体质量差异无统计学意义，表明 CN-N 对小鼠体
质量没有明显抑制作用。见图 2。
与对照组比较，环磷酰胺组去瘤体质量明显降
低(t = 3． 440，P = 0． 002 7) ，CN-N 低剂量组和高剂
量组荷瘤小鼠去瘤体质量变化差异无统计学意义(t
分别为 0． 796 3，0． 934 6，P 均 ＞ 0． 05) ，表明 CN-N
对荷瘤小鼠去瘤体质量无影响。见表 1。
与对照组比较，环磷酰胺组荷瘤小鼠的脾脏
指数明显降低(t = 3． 914，P = 0． 000 9) ，CN-N 低
剂量组和高剂量组荷瘤小鼠脾脏指数差异无统计
学意义(t = 0． 3012，1． 366，P 均 ＞ 0． 05) ，初步表
明 CN-N对荷瘤小鼠脾脏可能没有明显的毒副作
用。见表 1。
与对照组比较，环磷酰胺组胸腺指数明显降低
(t = 4． 549，P = 0． 000 2) ，CN-N 低剂量组和高剂量
组荷瘤小鼠胸腺指数差异均无统计学意义(t =
0． 685 1，0． 5055，P均 ＞ 0． 05) ，初步表明 CN-N对荷
瘤小鼠胸腺可能没有明显的毒副作用。见表 1。
图 2 鳄嘴花正丁醇提取物对荷瘤小鼠体质量的影响
表 1 各组小鼠去瘤体质量及免疫器官指数的比较
n =10，珔x ± s
组别
去瘤体质量
(g) 脾脏指数
(%) 胸腺指数(%)
对照组 25． 0 ± 3． 6 0． 64 ± 0． 21 0． 34 ± 0． 17
环磷酰胺组 20． 7 ± 2． 0a 0． 37 ± 0． 08a 0． 095 ± 0． 05a
低剂量组 24． 0 ± 2． 4 0． 66 ± 0． 21 0． 38 ± 0． 10
高剂量组 23． 9 ± 1． 7 0． 54 ± 0． 12 0． 37 ± 0． 11
F值 6． 163 7． 389 15． 59
P值 0． 001 5 0． 000 5 0． 000 1
a:P ＜ 0． 05，与对照组比较
2． 3 CN-N对荷瘤小鼠的寿命延长效果
对照组，环磷酰胺组，CN-N1 组、N2 组、N3 组存
活时间分别为(19． 9 ± 5． 9)d，(29． 9 ± 7． 2)d，
(21． 8 ± 7． 1)d，(25． 4 ± 7． 2)d，(30． 8 ± 10． 4)d
(F = 4． 716，P = 0． 002 9)。环磷酰胺组延长率达
50． 3%，较对照组显著延长荷瘤小鼠生存期(t =
3． 465，P = 0． 002 8) ;CN-N1 组和 N2 组延长率分别
为 9． 5%，27． 6%，与对照组比较差异均无统计学意
义(t = 0． 667 8，1． 909，P 均 ＞ 0． 05) ;CN-N3 组延长
率为 54． 8%，与对照组比较延长作用明显(t =
3． 416，P = 0． 003 1)。结果表明，CN-N 高剂量可明
显延长荷瘤小鼠的存活时间。见图 3。
2． 4 各组肿瘤组织的形态结构
对照组肿瘤细胞体积大，呈多边形或类圆形，细
胞核大深染，核质比增大，核分裂象易见。肿瘤细胞
密集排列呈实体团块，浸润于周围的肌肉和脂肪组
织内。肿瘤间质无明显炎细胞浸润，可见充血、出血
现象，多数为轻、中度。环磷酰胺组肿瘤细胞形态与
对照组相同，但肿瘤细胞异型性明显，肿瘤凋亡和
(或)坏死程度较对照组明显，肿瘤间质无明显炎细
312第 3 期 刘旭，等．鳄嘴花正丁醇提取物对小鼠 Heps肝癌的抑制作用
胞浸润，充血、出血较对照组轻。CN-N 给药组肿瘤
细胞形态与对照组相同，肿瘤凋亡和(或)坏死程度
较对照组明显，并且呈一定剂量依赖的趋势。见
图 4。
2． 5 肿瘤组织凋亡情况
结果显示，对照组凋亡不明显，环磷酰胺组凋亡
明显，CN-N低剂量组凋亡较对照组多但较环磷酰
胺组少;CN-N 高剂量组凋亡同环磷酰胺组，表明
CN-N可能引起肿瘤细胞的凋亡从而发挥抗肿瘤作
用。见图 5。
2． 6 蛋白质印迹法检测 CN-N对 PCNA的影响
结果显示，CN-N给药组 PCNA表达量低于对照
组，且高剂量组表达比低剂量组更低，表明 CN-N 能
够降低 PCNA的表达。见图 6。
1:对照组;2:环磷酰胺组;3:CN-N1组;4:CN-N2组;5:CN-N3组
图 3 鳄嘴花正丁醇提取物对荷瘤小鼠存活时间的影响
图 4 各组肿瘤组织的形态结构(HE染色 ×100)
图 5 TUNEL法检测细胞凋亡结果(×100)
图 6 各组 PCNA蛋白的表达
3 讨论
全球每年有超过 50 万患者被确诊患有肝
癌［7 － 8］。临床上治疗肝癌的药物以化疗药物为主，
但其毒副作用较大。在预防肝癌发生，减轻患者痛
苦，提高生存质量，延长生存时间等方面，植物来源
的药物有独特的优势。其中，紫杉醇、长春新碱、鬼
臼毒素是较成功的抗肿瘤药物，例如，拓扑替康和伊
立替康(喜树碱半合成的衍生物)用于治疗卵巢癌、
小细胞肺癌和结肠癌［9 － 10］。
在泰国、马来西亚等东南亚国家，鳄嘴花作为一
种传统草药用于治疗带状疱疹、蚊虫叮咬、肝炎和蛇
咬伤，其主要成分有豆甾醇，羽扇豆醇，β-谷甾醇，桦
木醇，异牡荆素，6 种碳苷黄酮和牡荆素等;其中，羽
扇豆醇、桦木醇、异牡荆素有抗肿瘤作用，这为本研
究提供了一定基础。本实验表明，CN-N 对异体移
植瘤有很好的抑制作用，给药后第 3 天开始，肿瘤体
积增长速度放缓。给药 11 d后，高剂量组抑瘤率高
达 61． 7%。
生存期的延长是考察抗肿瘤药的一个重要指
412 江苏大学学报(医学版) 第 24 卷
标，本实验显示 CN-N 高剂量组荷瘤小鼠的生存期
明显延长，生命延长率达 54． 8%，显示出 CN-N具有
较好的应用前景。
CN-N对小鼠去瘤体质量、胸腺指数、脾脏指数
无影响，不排除其有较小毒副作用的可能。CN-N
显示出了良好的抗肿瘤作用，其抑瘤作用可能与诱
导凋亡和抑制细胞增殖有关，但其有效成分到底是
什么，以及诱导凋亡、抑制细胞增殖的分子机制还有
待进一步研究。
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［收稿日期］ 2014 － 01 － 17 ［编辑］ 刘星星
《江苏实用心电学杂志》2014 年征稿征订启事
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