全 文 ：类叶升麻苷对缺糖缺氧诱导 PC12 细胞损伤的保护作用
高 莉， 彭晓明， 霍仕霞， 何 燕， 闫 明*
(新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所新疆维吾尔医方剂学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830049)
收稿日期:2015-05-20
基金项目:新疆维吾尔自治区科技支疆项目 (201491174)
作者简介:高 莉 (1980—)，女，博士，副研究员，主要从事中药新药筛选研究。E-mail:gaoli_ 535@ 163． com
* 通信作者:闫 明 (1959—)，男，硕士，研究员，主要从事创新药研究。E-mail:yanming21cn@ sohu． com
摘要:目的 观察类叶升麻苷对连二亚硫酸钠致 PC12 细胞缺糖缺氧损伤的保护作用。方法 以 1 mmol /L连二亚硫酸
钠诱导 PC12 细胞建立缺糖缺氧损伤模型，然后以 0. 1、1、10、100 μmol /L的类叶升麻苷拮抗其作用。倒置显微镜观
察 PC12 细胞形态学变化，MTT比色法测定细胞存活率，化学比色法测定细胞内乙酰胆碱 (Ach)水平、乙酰胆碱转
移酶 (ChAT)及乙酰胆碱酯酶 (TChE)活性。结果 采用缺糖缺氧损伤 PC12 细胞后，Ach 水平、ChAT 活力均降
低;与不同浓度的类叶升麻苷 (0. 1、1、10、100 μmol /L)共孵育 24 h后，各类叶升麻苷给药组均可提高 Ach水平及
ChAT活力，而 TChE活力无明显变化。结论 类叶升麻苷对连二亚硫酸钠联合无糖培养液造成 PC12 细胞缺糖缺氧损
伤具有显著的保护作用，其机制可能与提高 ChAT活性进而增加 Ach水平有关。
关键词:类叶升麻苷;PC12 细胞;连二亚硫酸钠;乙酰胆碱酯酶
中图分类号:Ｒ966 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2015)08-1821-03
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 08. 042
血管性痴呆 (vascular dementia，VD)是由一系列缺血
性脑血管疾病所导致的认知功能障碍综合征，在我国血管
性痴呆占各类痴呆发病的第一位。脑组织代谢旺盛，血流
量丰富，因此极易受到缺血的影响，引起神经细胞功能的
损害［1］。类叶升麻苷 (acteoside)是肉苁蓉的主要有效成
分，且含有量较高，经药理研究发现，其具有神经保护、
调节免疫、增强记忆力、抗肿瘤等生物活性，有较为广阔
的开发前景［2］。
本实验室前期实验结果提示类叶升麻苷对动物认知功
能障碍有一定的改善作用，其机制可能与抗自由基生成和
改善胆碱系统功能有关［3］。另外，也有学者研究证实类叶
升麻苷对胆碱能系统产生影响［4］。虽然，目前有报道显示
类叶升麻苷具有保护神经细胞的作用［5-6］，但类叶升麻苷对
缺糖缺氧 (oxygen-glucose deficiency，OGD)细胞模型的作
用未见相关报道。因此，为了进一步探讨类叶升麻苷对神
经细胞保护的机制，本实验利用体外培养 PC12 细胞缺糖缺
氧实验模拟体内的缺血状态，研究类叶升麻苷对连二亚硫
酸钠 (Na2S2O4)所致 PC12 细胞缺糖缺氧模型中胆碱系统
的影响，以乙酰胆碱 (acetylcholine，Ach)水平、乙酰胆
碱转移酶 (choline acetyltransferase，ChAT)活力及乙酰胆
碱酯酶 (acetylcholinesterase，AchE)活力为指标，探讨类
叶升麻苷增强学习记忆的机制。
1 实验材料
1. 1 药物 类叶升麻苷分子质量为 624. 59，由新疆维吾尔
医药研究所新疆维吾尔医方剂学重点实验室提供，其化学
结构经核磁共振波谱法和质谱法确认，高效液相色谱
(HPLC)面积归一化法鉴定其纯度为 95%。
1. 2 细胞株 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株 PC12 细胞购
自中国科学院细胞库。
1. 3 实验试剂与仪器 胎牛血清 (Hyclone 产品);完全
ＲPMI1640 培养液 (Gibco 产品);无糖 ＲPMI1640 培养液
(Gibco产品) ;氨苄青霉素钠和硫酸链霉素 (Amersco 公
司) ;连 二 亚 硫 酸 钠 (天 津 市 福 晨 化 学 试 剂 厂，
20100710);四甲基偶氮唑蓝 (美国 Amresco 公司) ;二甲
基亚砜 (天津市光复化工研究所) ;乙酰胆碱 (ACh)测
定试剂盒 (20130923)、乙酰胆碱转移酶 (ChAT)测试盒
(20130923)、乙酰胆碱酯酶 (TChE)测试盒 (20130923)、
BCA法蛋白定量测试盒 (20130918)均购自南京建成生物
技术研究所。
1. 4 实验仪器 净化工作台 (苏净，SW-CJ-1F);CO2 培
养箱 (日本 SANYO公司MCO-18AIC型) ;倒置光学显微镜
(上海光学六厂，37XB) ;全波长酶标仪 (Thermo Fisher
Scientific 1510 型)。
2 实验方法
2. 1 细胞培养 PC12 细胞用含 10%的胎牛血清的 ＲPMI
1640 培养基培养，置 37 ℃、5% CO2 孵箱中，2 ～ 3 d 换液
1 次，3 ～ 4 d传代 1 次，取对数生长期细胞用于实验。
2. 2 PC12 细胞 OGD 模型的建立及给药［7］ 实验设正常
组、模型组和类叶升麻苷治疗组。各组处理如下，模型组:
根据文献［8］方法加入 1 mmol /L的 Na2S2O4处理细胞 2 h，
建立缺糖缺氧细胞模型;类叶升麻苷治疗组:根据前期药
物浓度筛选选取 0. 1、1、10、100 μmol /L 的类叶升麻苷与
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Na2S2O4处理细胞 2 h后的细胞共孵育 24 h;正常组则只加
入等体积的 ＲPMI 1640 培养基。
2. 3 四甲基偶氮唑蓝 (MTT)检测细胞存活数［9］ 取对
数生长期的 PC12 细胞，细胞计数为 3 × 104 个 /mL 均匀的
铺于 96 孔板，100 μL /孔，于培养箱中培养 48 h 后用
1 mmol /L Na2S2O4 造模，3 h后按分组要求予以不同处理，
培养 48 h后每孔加终质量浓度为 5 mg /mL MTT 反应 4 h
后，吸去上清 (注意避免吸走甲瓒结晶)，每孔加入 200
μL DMSO，振荡待孔内结晶完全溶解后于 490 nm 处测
OD值。
2. 4 乙酰胆碱相关指标测定 取对数生长期的 PC12 细胞，
细胞计数为 5 × 104 个 /mL 铺 48 孔板，200 μL /孔，于培养
箱中培养 48 h后用 1 mmol /L Na2S2O4 造模 300 μL /孔，3 h
后按分组要求予以不同处理，培养 48 h后，取每孔培养液
和细胞悬液按照试剂盒说明书分别测定乙酰胆碱 (Ach)
水平、乙酰胆碱转移酶 (ChAT)活力、乙酰胆碱酯酶
(TChE)活力。
3 统计学方法
实验结果以均数 ±标准差 (x ± s)表示。所有数据均
采用 SPASS 16. 0 统计软件进行单因素方差分析，t检验法
比较各组间差异，P ＜ 0. 05 表示组间差异有统计学意义。
4 结果
4. 1 类叶升麻苷对缺糖缺氧损伤 PC12 细胞形态的影响
细胞形态观察可见，正常组细胞为多角形贴壁细胞，树突
明显，折光度强，细胞数量多，而模型组用 1 mmol /L
Na2S2O4 损伤，细胞数减少，树突回缩，且折光度减弱。
模型中 PC12 细胞的损伤及药物保护的形态学表现基本一
致，但随着加药浓度的不同，各给药组细胞损伤程度减轻，
呈现一定的药物保护形态，与模型组相比，细胞树突增多
且有聚集的现象。见图 1。
4. 2 对细胞存活率的影响 PC12 细胞用 1 mmol /L
Na2S2O4 造模 3 h后，其抑制率达到 35. 9%，与正常组相比
具有统计学意义 (P ＜ 0. 01)，表明造模条件可靠，造模成
图 1 类叶升麻苷对缺糖缺氧损伤 PC12 细胞形态的
局部图 (200 ×)
功。各个给药组与模型组相比，亦可见给药组细胞存活率
增加，即类叶升麻苷可抑制 Na2S2O4 对 PC12 细胞所致的缺
糖缺氧损伤，在 1 ～ 100 μmol /L 范围内，随着给药浓度的
升高，保护作用越强，且存在浓度依赖关系。见图 2。
注:与正常组比较，＊＊P ＜ 0. 01;与模型组比较，##P ＜ 0. 01
图 2 类叶升麻苷对 PC12 细胞 OGD模型存活率的影响
(x ± s，n =6)
4. 3 乙酰胆碱相关指标的测定 实验结果表明，1 mmol /L
Na2S2O4 能引起 PC12 细胞 Ach 水平、ChAT 活力及 ChAT /
TChE比值均降低 (P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05) ;与不同浓度类叶
升麻苷共孵育后，四组类叶升麻苷剂量均可显著提高 Ach
水平及 ChAT活力 (P ＜ 0. 01)，对 TChE 活力无明显影响，
而 ChAT /TChE比值逐渐升高。见表 1。
表 1 类叶升麻苷对 Na2S2O4 所致 PC12 细胞 Ach以及 ChAT、TChE的影响 (x ± s，n =6)
组别
剂量 /
(μmol·L －1)
Ach /
(μg·mgprot － 1)
ChAT /
(μg·mgprot － 1)
TChE /
(μg·mgprot － 1)
ChAT /TChE
正常组 10. 8 ± 0. 35 0. 77 ± 0. 09 1. 48 ± 0. 39 0. 54 ± 0. 11
模型组 6. 11 ± 0. 87＊＊ 0. 23 ± 0. 03＊＊ 1. 07 ± 0. 02 0. 21 ± 0. 01*
类叶升麻苷 0. 1 13. 49 ± 1. 5## 0. 53 ± 0. 09## 1. 59 ± 0. 21 0. 34 ± 0. 08
类叶升麻苷 1 8. 84 ± 0. 98## 0. 58 ± 0. 08## 1. 59 ± 0. 31 0. 37 ± 0. 09
类叶升麻苷 10 10. 26 ± 2. 05 0. 63 ± 0. 17## 1. 6 ± 0. 38 0. 48 ± 0. 03##
类叶升麻苷 100 12. 57 ± 0. 51## 0. 71 ± 0. 01## 1. 03 ± 0. 09 0. 69 ± 0. 06##
注:与正常组比较，＊＊P ＜ 0. 01，* P ＜ 0. 05;与模型组比较，##P ＜ 0. 01
5 讨论
PC12 细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆的细胞
株，细胞膜上有胆碱能 M、N 受体等，已广泛用作研究神
经细胞分化、离子通道、受体的实验材料［1］，缺糖缺氧损
伤 PC12 模型作为一种快速、敏感的体外中枢神经缺血模型
是目前较为公认的研究脑缺血模型，常用于评价药物潜在
的神经保护作用［7］。
神经元损伤和死亡是由供血不足、营养物质 (葡萄
糖)缺乏及代谢物的累积所导致的［8-9］。神经元缺氧导致
糖、蛋白质、脂质代谢障碍，产生内源性细胞毒素，最终
使细胞死亡。近年来［10］，人们对血管性痴呆的发病机制
进行了大量的研究，越来越多的证据表明胆碱能系统参与
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了血管性痴呆的发生。血管性痴呆发生时中枢胆碱能系统
受损，其认知损害机制涉及胆碱能递质及其受体等方面的
改变。而且临床实验研究已证明，胆碱能治疗策略血管性
痴呆有效［11-12］。贾建平等［13］学者的临床研究发现，血管
性痴呆患者脑脊液 (CSF)中 Ach 水平较对照组显著降
低，且下降幅度与痴呆程度成正关。众所周知，Ach 是中
枢神经系统内神经细胞突触传递过程中的一种关键性神经
递质，它由 ChAT 催化合成，TChE 催化分解［14］，其
ChAT /AchE比值显著影响 Ach 的表达水平［15］，所以本实
验选用乙酰胆碱水平、乙酰胆碱转移酶活力及乙酰胆碱酯
酶活力为测试指标，研究类叶升麻苷对 OGD 模型的保护
作用。
本实验采用 Na2S2O4 结合无糖培养液模拟脑缺血损伤
神经的状态，进行研究类叶升麻苷对离体的缺糖缺氧细胞
模型的保护作用。MTT是广泛地用于检测细胞存活和增殖
的指标，它可以敏感的测量细胞代谢状态。实验中显示，1
mmol /L Na2S2O4 可引起 PC12 数量减少，树突回缩，其生
存能力显著下降，与 0. 1 ～ 100 μmol /L 不同剂量类叶升麻
苷共孵育后均能显著增强细胞存活率，且呈现剂量依赖性。
以上结果表明，类叶升麻苷在 0. 1 μmol /L剂量下即可明显
抑制 (P ＜ 0. 01)缺糖缺氧对细胞的损伤作用，能够保护
PC12 细胞在体外受到的缺糖缺氧诱导损伤，对缺血造成的
神经损伤具有潜在保护性作用。另外，实验中未观察到类
叶升麻苷对 PC12 细胞的毒性。
进一步对 Ach 水平以及 ChAT、TChE 活性检测发现，
PC12 细胞经缺糖缺氧诱导损伤后，细胞内 Ach 水平、
ChAT活性明显下降以及 ChAT /TChE 比值显著下降 (P ＜
0. 05)，提示 Na2S2O4 可能通过降低 ChAT 活力以及 ChAT /
TChE比值 (P ＜ 0. 01) ，从而降低 Ach 水平。与不同剂量
类叶升麻苷共孵育 24 h后，各组的细胞内 Ach水平、ChAT
活性以及 ChAT /TChE比值均明显不同程度的增高，在 1 ～
100μmol /L剂量下随着类叶升麻苷浓度升高，Ach 水平和
ChAT活性随剂量逐步升高，TChE 则无明显变化。这些结
果表明，类叶升麻苷能够通过升高 ChAT 活力以及 ChAT /
TChE比值，促进 Ach合成增加，增强 Ach的神经递质传导
作用，从而保护 OGD诱导的 PC12 细胞细胞损伤，且呈现
一定的剂量依赖性。
综上所述，类叶升麻苷可改善 PC12 细胞形态，显著提
高细胞存活率，对 Na2S2O4 所致的 PC12 细胞损伤有显著保
护作用;其保护作用可能与升高 ChAT 活力以及 ChAT /
TChE活力比值，从而增高 Ach水平有关，表明类叶升麻苷
具有开发应用于预防和治疗脑缺血类血管性痴呆以及脑中
风后遗症等药物的潜能。
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