全 文 ：中国新药杂志 0 27 0年第 6 1卷第 1 2期
旅麻醇提物对心肌细胞缺氧损伤的保护作用 ’
李建宇 ,李灵芝 ,张永亮 ,张新宁 ,龚海英
(武警医学院药化教研室 , 天 津 3 001 6 2 )
〔摘要 」 目的 : 探讨族麻 ( oP ten ilt al a ns er in a L . )对心 肌 细胞缺氧损伤 的保护作用 。 方法 : 采用原代培养的 SD
乳鼠心肌细 胞建立缺氧损伤实验模型 , 通过 M IT 法测定各组细 胞代谢率 , 生化方法测定乳酸脱氢酶 ( LD H ) 和肌酸
激酶 ( C K ) 的释放量 以及 细胞 内超氧化物歧化酶 ( S O D ) 活性和丙 二醛 ( M D A )含 量 。 结果 : 蔗麻 醇提物在 2 4 , 12 和
6 g’ L 一 ’ 浓度 能显著减少缺氧损伤心 肌细 胞 LD H 和 c K 的外漏量 , 并可显著提高细胞 内 s 0 D 活性 , 减少 M D A 的产
生 。 结论 : 族麻 对心 肌细 胞缺氧损伤具 有显著 的保护作用 , 其机制 之 一 可能是 清除缺氧导致 的心 肌细 胞 自由基堆
积 , 减少脂质过氧化 。
〔关键词 1 族麻 ; 心肌 细胞 ;缺 氧
[中图分类号 ] R 2 8 5 . 5 ; R 2 8 6 . 2 [文献标识码〕 A [文章编号 ] 10 0 3 一 3 7 3 4 ( 2 0 0 7 ) 12 一 0 9 4 4 一 0 3
P r o t e e it v e e fe
c t o f oP te
n 材月软 a n s e ir n a L . o n h y P o x i a inj u r y i n
n e o n a t a l r a t s c a r d i o m y o c y t e s
L l J i a n
一
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,
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,
Z H A N G Y o n g
一
li a n g
,
Z H A N G X i n
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,
G ON G H a i
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y i n g
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「A b s t r a e t」 O hj e c t i v e : T o s t u d y t h e p r o t e e ti v e e fe e t o f p o t e n t i ll a a n s e r in a L . o n n e o n a t a l r a t s
e a r d i a e m y o e y t e s inj u er d b y h y p
o x i a
.
M e t h o d s
: A m o d e l o f h y P o x ia inj u口 w a s e s t a b l is h e d u s i n g P r i m a 仃
e u l t u r a l m y o e y t e s in n e o n a t a l S D r a t s
.
T h e m e t a b o l i e a b i li t y o f th e e e l l s w a s d e t e e t e d b y M T
a s s a y
.
T h e
a e t i v i t i e s o f l a e ta t e d e h y d r o g e n a s e ( LD H )
a n d e r e a ti n e k i n a s e ( C K )
o u t o f e e ll s a n d s u p e or x i d
e d i s m u t a s e
( S O D ) in
e e l l s
, a n d t h e p or d u
e t i o n s o f m a l o n d ia l d e h y d e ( M D A ) in
e e l l s w e er m e a s u r e d w i t h b io e h e m i s t仃
a p p
r o a e h e s
.
R e s u 一st : 0 . 0 2 4 9 · m L 一 l , 0 . 0 12 9 · m L 一 ’ a n d 0 . 0 0 6 9 · m L 一 ’ o f th e e x t r a e t o f p o t e n t i l la a n -
s e r i n a L
.
i n a le o h o l e o u ld s i g n i if e a n tl y er d
u e e rh e r e l e a s e
o f L D H
,
C K fr o m m y o e y t e s a n d i n e r e a s e a e t iv i
-
t y o f S O D a n d i n h i b i t p r o d u e t i o n s o f M D A i
r l e e l l s d u r i n g h y p o x i a i n j
u yr
.
C o n c l u s i o n : P o t e n ` i ll a a n s e r i n a
L
.
h a s r e m a r k a b l y p or t
e e t i v e e fe
e t o n h y p o x i a inj u口 i n n e o n a t a l r a t s m y o e y t e s .
[ K e y w o r d s 〕 P o t e n ri l l a a n : e r i n a L . ; e a r d ia ( : ; n y o e y te s ; h y p o x i a
族麻 ( p o te n ` i ll a a n s e r i n a L . )俗称人参果 , 为蔷
薇科委陵菜属鹅绒委陵菜的地下块根 , 其性平味甘 ,
健脾益 肾 , 生津止渴 、 益气补血 。 富含淀粉 、 脂肪酸
及人体所需的 18 种氨基酸和多种维生素 ,具有较高
的医疗和营养价值 忆’ 3 。 《中药大辞典 》 、 《西 藏常用
中草药》等书均有记载 。 研究表明 l ’ 一 ` 〕 ,蔽麻中多糖
成分具有显著的提高免疫力与抗氧化活性 , 其总皂
昔及其单体旅麻昔对病毒性肝炎有较好的治疗效
果 。 另有实验证实 t ’ 一 ’ 〕 ,蔽麻可显著提高小鼠在减
压缺氧和窒息性 缺氧状态 的存 活率 和存 活时 间 ,
降低整体耗氧量 。 但蔽麻对缺氧导致 的心肌细胞
损伤是否具有保护作用 以及其抗缺氧作用的有效
部位或成分 , 迄今 尚未见文献 报道 。 本实验 采用
原代培养的心肌细胞观察截麻对心肌细胞缺氧损
伤 的影响 。
材料与方法
1 材料
1
.
1 药品与试剂 威麻购 自青海 , 粉碎后用 70 %
乙醇回流提取 , 减压除净乙 醇得浓缩浸膏 E P ot (每
克浸膏相当于 3 . 0 9 生药 ) , 可溶于水 ,呈棕褐色 ,本
实验以 D 一 Han k’ s 液进行药物溶解 , 药液澄清透 明 ;
丹参注射液 (正大青春宝药业有限公 司提供 ,批号 :
0 2 04 2 3 2 ) ; D M E M / F
一
12 培养 基 ( G i b e o ) ; 胎 牛血清
(中国医学科学院血液病研究所 ) ; 5 一嗅 一2 一脱氧尿唾
咤 ( B r d u ) ( S i g m a ) ;胰蛋 白酶 ( D i fe o ) 、噬哇兰 ( M T )
* 基金项 目 : 国家 自然科学基金 ( 3 0 6 7 27 4 )
、
9 4 4 一
C hi” e e s Jo u rna l ofN e wD rug s2 0 07
,
V o l
.
16 N
o
.
12
购 自北 京 鼎 国 生物 技 术 发 展 中心 ; 乳 酸脱 氢 酶
( L DH )
、 肌酸激酶 ( C K ) 、 超氧化物歧化酶 ( S O D )和
丙二醛 ( M D A )测试盒 , 均购 自南京建成生物工程研
究所 。
1
.
2 实验设备 医用型超净工作台 ( SW 一 CJ 一 lF
苏州 ) ;C o : 培养箱 ( oF mr a3 l l 美 国 ) ;倒置相差显微
镜 ( N i k o n T S 100 日本 ) ; 电热恒温培养箱 ( H G 30 3 一
3 A 南 京 ) ;普 通离 心机 ( L D S 一 Z A 北 京 ) ; 酶标 仪
( 6 8 0 B IO R A D 美 国 ) ; 紫外可 见分光光度计 ( U V 一
16 0 1 S H IM A D Z U 日本 ) , 数字式 测 氧仪 ( C Y S 一 l
型 , 北京 ) 。
1
.
3 动物 新生 1 一 3 d 的 S D 乳鼠 ,雌雄不限 , 由
军事 医 学 科学 院动 物 实验 中心 提供 , 许 可证 号 :
S C K
一
(军 ) 2 0 0 2 一 00 1 。
2 方法
2
.
1 乳鼠心肌细胞的原代培养圈 新生 l 一 3 d 的
S D 乳鼠用 7 5% 酒精消毒后 , 取出心脏置于 4 ℃ 预冷
的 D 一 H a n ks 液中 , 吹打冲洗 3 遍 ,取 心室肌剪成约
1 m m , 大小组织块 ,加 0 . 25 % 胰 蛋白酶毛 . 0 2% E D -
T A
,
3 7 ℃消化 , 弃去首次消化上清液 ,收集其余各次
上清液加人等体积含 10 % 胎牛血清的 D M E M / F 一 12
培养基中止消化 , 离心 ( 1 0 0 0 : · m in 一 ’ , l o m i n )收集
心肌细胞 ,加入含 10 % 胎牛血清 的 D M E M / F 一 12 培
养基和 B r d u ( 终浓度 0 . 1 m m o l · L 一 ’ ) , 轻轻 吹打混
匀 , 接种于 25 m L 培养瓶中 ,于 37 ℃ 和 5% C O Z 培养
箱中孵育 70 m in , 使绝大部分非心肌细胞贴壁 。 吸
取培养瓶内细胞悬液计数 , 调整细胞浓度为 1 x l扩
个 · m L 一 ’ ,接种到 2 4 孔板 , 每孔 一 n , L ; 9 6 孔板 , 每孔
20 0 拜 L 。 48 h 细胞贴壁后 , 更换含 10 % 胎牛血清的
D M E M / F
一
12 培养基 (不含 B r d u ) , 以后每隔 Z d 换液
I 次 ,培养 4 d 后进行实验 。
2
.
2 心肌细胞缺氧损伤模型的建立图 取培养 4 d
的心肌细胞 ,换 无血清 D M E M / F 一 12 培养基连续培
养 12 h 后 , 用无糖 D 一 H a n k s 液 (预先充 入 95 % N Z -
5% C O
: 混合气饱和 3 0 m in )替代正常培养基 , 而后
迅速将培养板移人通有 95 % N Z 一5% C o Z 混合气的缺
氧装置中 , 用测 氧仪监测排 气 口 氧浓 度 ( < l % ) ,
3 7 ℃缺氧培养 6 h 后进行心肌细胞 M T T 实验及生
化指标的检测 。
2
.
3 实验分组 实验设正常对照组 、 缺氧模型组 、
藏麻醇提物高 、 中 、低浓度组 ( 浓度分别为 24 , 12 和 6
g
·
L
一 `
)
、 丹参对照 ( 0 . 15 9 · L 一 ` )组 ,共 6 组 ,每组 6 孔 。
2
.
4 缺氧损伤心肌细胞 M T T 实验 将接种于 96
孔板中搏动良好 、 生长密度无明显差异的心肌细胞
中国新药杂志 2 00 7 年第 16 卷第 12 期
按上述随机分为 6 组 , 缺氧模型组及旅麻干预组缺
氧处理 6 h ,正常对照组则于 37 ℃和 5 % C O : 培养箱
中同步孵育 6 h ,而后取出各组样本 ,每孔加人 2 0 林 L
M T T ( 5 9
·
L
一 ’
)
,于 37 ℃和 5% C O Z 孵箱中继续孵育
4 h
, 终 止培 养 , 倒 板 。 加 人 15 0 拜 L D M S O 振摇 15
m in
,使结晶充分溶解 , 于测定波长 57 0 n m 和 参考波
长 6 3 0 n m 处 ,测定各孔吸收度值 ( A ) 。 根据下式计算
M竹 代谢率 : MT 代谢率 / % 二 A 实验组 / A 正常姗组 x l o 。
2
.
5 心肌细胞外 L D H 和 C K 活性的测定 接种于
2 4 孔板的心肌细胞 ,各实验组处理同 “ 2 . 4 ” ,取各组
样本细胞培养上清液 ,用 比色法测定 L D H 和 C K 的
活性 ,实验操作按试剂盒说明进行 。
2
.
6 心肌细胞内 SO D 活性及 M D A 含 t 的测定
接种于 24 孔板的心肌细胞 , 同 “ 2 . 4 ” 分组处理 , 实
验结束后 , 用黄嘿吟氧化酶法测定细胞 内 S O D 活
性 ;用硫代巴 比妥酸比色法测定细胞内 M D A 含量 ,
实验操作按试剂盒说明进行 。
2
.
7 统计学处理 结果 以 无 士 ; 表示 , 数据用 S P S
统计软件进行组 间 t 检验 , 尸 < 0 . 05 即认 为有统计
学差异 。
结 果
1 蔗麻醇提物对缺氧损伤心肌细胞的 M T T 实验
缺氧模 型组较正常对照组吸收度值明显降低 ,
M T T 代谢率显著降低 (尸 < O , 01 ) ; 与缺氧模 型组相
比 ,旅麻醇提物各浓度组吸收度值均显著增加 , M T
代谢率显著提高 (尸 < 0 . 01 ) 。 结果见表 1 。
表 1 旅麻醉提物对缺级损伤心肌细胞的 M T T 试验结果
组 别 浓度 / g · L M ,j , 代谢 率 /%
正常对照
缺氧模型
旅麻醇提物
旅麻醇提物
截麻醇提物
丹 参
1 0 0 0 士 0
.
0 a
3 0 9 土 7 9
::
0
.
J7 士 0
.
0 2 a
0
.
0 5 * 0
.
0 1
0
.
2 7 土 0
.
0 2 a
0
.
2 7 土 0
.
0 2 a
0
.
1 2 土 0
.
o l a
0
.
3 2 士 0
.
0 2 压
巧 9 . 0 土 8 . 9 a
16 2
.
3 士 1 0
.
4 a
6 8
.
9 士 3 5 a
18 8
.
2 士 1 1
.
8
“
与缺 氧模型组相 比 , a : P < 0 . 01
2 蔗麻醇 提物对 缺氧损 伤心 肌细胞 L D H , C K ,
S O D 活性和 M D A 含 t 的影响
与正常对照组 比较 , 缺氧模 型组 心肌 细胞 内
SO D 活性显著下降 ( 尸 < 0 . 01 ) , L DH 和 C K 活性显
著增加 ( p < 0 . 0 1 ) , M D A 含量显著增加 ( p < 0 . 0 5 ) ;
而蔗麻醇提物各浓度组与缺 氧模型组相 比 , 均可显
著提高缺氧损伤心肌细胞内 S O D 活性 (尸 < 0 . 01 ) ,
减少 M D A 的产生 和 L D H , C K 的活性 ( 尸 < 0 . 01 或
p < 0
.
0 5 )
。 结果见表 2 。
一 9 4 5 一
中国新药杂志 2 0 0 7年第 16卷第 12期
表 2旅麻醉提物对缺妞扭伤心肌细胞 L D H, C K , S O D 活性和 M D A 含工的影晌
组 别 浓度 / g · L 一 l SO D / U · L 一 l M D A / n m o l · m l - LD H / U · L 一 、
正常对照
缺氧模型
旅麻醇提物
蔗麻醉提物
孩麻醉提物
丹 参
12 0
.
4 8 士 1 6
.
6 4 a
4 0
.
1 3 士 7
.
9 2
8 4
.
4 1 上 4
.
0 7 .
8 0 9 9 土 6
.
9 1
“
7 6
.
1 0 士 6
.
8 4 口
10 6
.
5 8 土 1 1
.
6 6 .
7
.
2 5 士 0
.
4 2 `
8
,
9 1 土 1
.
6 5
4
.
5 8 士 t
.
3 7 “
6
.
7 4 士 0
.
8 9 b
6
.
8 7 土 0
.
6 8 b
4
.
5 3 士 0
.
s l
a
7 6
.
0 3 土 16
.
8 5 a
2 2 0
.
79 土 2 9 7 6
1 1 6
.
1 3 士 15
.
0 5
a
1 2 7
.
7 8 士 20
.
0 7 a
1 5 6
.
3 5 士 2 7 5 l a
10 5
.
3 3 土 2 0
.
17
a
C K / U
·
m L
一
l
2
.
6 7 士 0
.
8 2 a
10
.
2 9 出 1
.
8 6
4
.
2 1 土 l
`
3 8 .
4
.
1 8 土 0
.
6 2 a
3
.
6 1 土 0
.
4 7
“
3
.
0 7 土 0
.
5 8
a
4,6八U2盛
与缺氧模型组 比较 , a : p < 0 饥 油 : P < 0 . 05
讨 论
琉拍酸脱氢酶是唬拍酸氧化呼吸链 中重要的复
合酶之一 ,唬拍酸脱氢酶的活性 , 可以反映心肌细胞
缺氧损伤的程度 。 M竹 实验原理 ,就是利用琉拍酸
脱氢酶可 以催化唾哩兰 ( MT ) 生成 紫红色 不溶性
有色产物的特性 , 通过吸收度的测定来反映各组的
细胞活性 。 本实验结果表 明 , 缺氧模型组 比正常对
照组吸收度值显著性 降低 , 表 明细胞 内唬拍 酸脱
氢酶的活性 已经降低 ,细胞呼吸功能受损 , 说明缺
氧 6 h可以损害心肌细胞代谢能力 。 与缺氧模型组
相 比 , 获麻醇提 物各 浓度组可 以显 著提高细胞 活
性 ,说明威麻醇提 物能对抗缺氧对 心肌细胞唬 拍
酸脱氢酶的活性的损害 , 维持缺氧损伤 细胞 的呼
吸功能 。
乳酸脱氢酶是参与细胞能量代谢的一个重要的
酶 ,可以催化乳酸生成丙酮酸 , 同时产生 A T P 。 缺氧
导致细胞急性损伤时 , 细胞膜完整性遭到破坏 ,细胞
通透性增加 , L D H 将从胞浆 中释放出来 , 因此 L DH
是反映胞膜完整性的重要检测指标 。 C K 也是重要
的心肌酶之一 , 其释放量 直接反映 了心肌 缺氧损
伤的程度 。 故细胞外 L D H 和 C K 活性越 高 , 表 明
细胞损伤越严重 。 本 实验结果显 示 , 与缺 氧模型
组比较 ,旅 麻醇提物各浓度 组均可显著减少缺 氧
条件心肌细胞 L D H 及 C K 的外漏量 , 说明蔽麻在
急性缺氧 条件下 , 一 定程 度保持了心肌 细胞 膜 的
完整性 。
心肌缺血缺氧时 ,活性氧爆发性产生 ,而组织中
清除氧 自由基的 s O D 活性则降低 ,导致氧 自由基堆
积 , 使膜脂质过氧化而致细胞损伤 。 冯愉态等 〔’ ” 〕认
为 ,中药保护心脑血管耐受缺氧的机制之一可能是
提高了机体清除氧 自由基的能力 。 李园媛 等 [川 报
道威麻能减慢空气对高原菜籽油的氧化速度 。 本课
题组前期实验也证实蔗麻醇提物能对抗氧 自由基引
起的红细胞老化 16 〕 。 本实验结果显示 , 蔗麻可 以显
著提高缺氧损伤心肌细胞 内 S O D 活性 , 减少脂质过
氧化产物 M D A 的产生 。 表明旅麻醇提物可通过增
强心肌细胞清除 自由基的能力 , 对抗缺氧导致的细
胞膜氧化损伤 。
[作者简介〕 李建 宇 ( 1 979 一 ) , 男 , 硕 士 研 究 生。 联系 电
话 : ( 0 2 2 ) 6 0 5 7 8 1 8 6 , E 一 m a i l : lij ia n y u l l s @ 16 3 e o m 。
[通讯作者 1 李灵芝 ( 19 63 一 ) , 女 , 博士 生导师 , 主 要从事
抗老年病 药物研究 。 联系电话 : ( 0 2 2 ) 6 0 5 7 8 1 84 , E 一m a i l : ll z h x
@ t
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.
e o m
。
参 考 文 献
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仁3 ]
仁4 〕
〔5 」
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编辑 : 朱振家 /接受 日期 :2 0 6 一 0 8 一 2 9
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