全 文 ：蕨麻多糖的提取及其清除自由基的作用
陈炅然1 , 王　琴2
(1.中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所 , 甘肃 兰州　730050;
2.兰州大学 生命科学学院 , 甘肃 兰州　730000)
　　摘要:采用热水提取 、乙醇沉淀 、Sevag 法获得蕨麻多糖;通过体外化学模拟试验 ,观察了该多
糖清除自由基的活性 。结果 ,蕨麻多糖得率为 3.8%;在体外化学模拟系统反应中 ,该多糖能显著
清除羟自由基 、超氧阴离子及体外培养的淋巴细胞产生的过氧化氢;蕨麻多糖对体外亚油酸脂质过
氧化无明显影响 。
关键词:蕨麻;多糖;自由基
中图分类号:S 853.74　　文献标识码:A　　文章编号:1000-6419(2004)04-0059-04
　　蕨麻为蔷薇科委陵菜属鹅绒委陵菜(Potenti lla
anserine)根 ,为藏医常用药 ,又名人参果 、延寿果 ,是
常用的滋补品。据文献记载 ,蕨麻中含有糅质 、糖
类 、蛋白质 、脂肪酸及委陵菜苷等。现代药理研究表
明 ,蕨麻水提物具有提高机体免疫力 、抗疲劳 、耐缺
氧和止泻抑菌的作用 。蕨麻多糖为蕨麻的活性成分
之一 ,杨桦等[ 1]从蕨麻中分离出多糖成分 ,并测定
了总糖含量 。为探讨蕨麻多糖的生物学活性 ,笔者
采用水提醇沉法从蕨麻中提取出了多糖组分 ,并分
析了其理化性质 ,观察了该多糖清除自由基的作用 。
1　材料与方法
1.1　药材
试验用蕨麻产自青海省玉树州 ,经中国农业科
学院兰州畜牧与兽药研究所新兽药工程研究室鉴定
为鹅绒委陵菜根 。
1.2　仪器和试剂
岛津 UV-3000紫外可见光分光光度计;联二氮
菲 、联苯三酚为美国丰特斯化学试剂公司产品;辣根
过氧化物酶为华美生物工程公司产品;FeSO4 、
H2O2 、硫脲 、酚红 、葡萄糖 、酵母聚糖为上海生工生
物工程技术服务有限公司产品 。其他试剂均为国产
分析纯试剂。
1.3　蕨麻多糖的提取
称取干燥的蕨麻粗粉 ,置于索氏提取器中 ,加入
收稿日期:2004-03-10
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30371056)
作者简介:陈炅然(1968 ), 女 , 辽宁省沈阳市人 , 副编
审 , 学士。
石油醚(60 ～ 90 ℃),于 90 ℃回流提取1 h脱脂 。将
药粉挥干溶媒后加入 800 mL/L 乙醇 ,90 ℃回流处
理 2次 ,每次 1.5 h ,离心后弃去药渣 ,挥干溶媒 ,加
水 ,温水浴浸提取 2次 ,每次 1.5 h。合并上清液 ,用
氯仿-正丁醇体积比 1∶4混合液萃取 2次 ,分离获得
水相 ,加入无水乙醇 ,静置过夜 ,收集 800 mL/L 乙
醇沉淀部位 ,过滤后溶于少量蒸馏水中 ,醇沉 2 ～ 3
次 ,直至上清液透明无色 。将沉淀物依次用 950
mL/L 乙醇 、无水乙醇 、丙酮 、乙醚反复洗涤 , 60 ℃
烘干至恒重 ,即得蕨麻多糖 ,计算得率 。
1.4　理化性质分析
采用碘-碘化钾反应 、茚三酮反应 、Molish反应 、
紫外分析等方法分析蕨麻多糖的理化性质 。
1.5　羟自由基的检测[ 2]
取 5 mmol/L 的邻二氮菲溶液 1.5 mL ,加 pH
7.4的 PBS 2.0 mL ,充分混匀后 , 加 7.5 mmol/L
FeSO4溶液 1.0 mL , 每加 1 管立即混匀 , 再加
1.0 mL/ L H2 O2 1.0 mL , 最后以蒸馏水补充至
10.0 mL。37 ℃保温 1 h ,以直径 0.5 cm 比色皿在
分光光度计测 D 536 nm值(损伤管)。蕨麻多糖或自
由基清除剂硫脲清除自由基试验的前期工作按上述
过程进行 ,之后分别加多糖 50 、100 、200 、400 mg/L
或硫脲(0.5 mmol/L),再加 H2O2 , 37 ℃保温 1 h ,测
加药管的 D 536 nm值。未损伤管不加 H2O2及多糖或
硫脲。表观羟自由基清除率(简称羟自由基清除率)
d按下式(以 3次平行测定均值)计算。
d =[ D 536 nm(加药)值 -D536 nm(损伤)值] /
[ D536 nm(未损伤)值-D536 nm(损伤)值] ×100 %
1.6　蕨麻多糖对联苯三酚自氧化的抑制作用[ 3]
应用体外模拟化学反应 , 在含蕨麻多糖 200
59中国兽医科技　　第 34卷　　第 4期　　2004 年
mg/ L的 PB液中加联苯三酚 ,在两液混合后 10 min
内 ,每间隔 30 s测定 1次 D325 nm值 。以不加多糖的
PB液作为对照 ,比较分析蕨麻多糖对联苯三酚自氧
化的抑制效果。
1.7　蕨麻多糖对 H2O2的酚红氧化测定[ 4]
无菌分离小鼠脾淋巴细胞 ,依次用 Hank s液 、
1640培养基洗涤后调整细胞浓度为1×106/mL ,然
后于 24孔细胞培养板中每孔加入 2 mL 细胞悬液 ,
于 37 ℃ 、50 mL/L CO2 培养箱培养 24 h。培养结
束后用含有辣根过氧化物酶的酚红反应液洗涤 ,除
去细胞培养液 ,然后在细胞中加入酚红反应液 , 37
℃预热后加入刺激剂(调理的酵母聚糖)或蕨麻多糖
(50 、100 、200 、400 mg/L),或同时加入刺激剂和蕨
麻多糖(50 ～ 400 mg/L),继续培养 4 h ,离心收集上
清液。将上清液用 1 mol/ L NaOH 处理后测定
D 610 nm值 ,与空白对照比较 。
1.8　蕨麻多糖对亚油酸过氧化的影响[ 5]
将蕨麻多糖分别配为 0 、50 、100 、200 、400 mg/L
的溶液 ,分别与亚油酸在磷酸钾缓冲液中于 37 ℃温
育 5 min ,然后加入 FeSO4-EDTA ,反应 30 min后加
入三氯醋酸 、硫代巴比妥酸和丁羟基甲苯 ,沸水浴
10 min ,离心 ,测上清液的 D532 nm值 。
2　结果
试验中蕨麻多糖的得率为 3.8%;蕨麻多糖的
水溶液对茚三酮溶液无颜色反应;碘-碘化钾反应呈
阴性;Molish 反应为阳性;在紫外分光光度计 260
nm 和 280 nm波长处无紫外吸收峰 。
蕨麻多糖能显著清除细胞分泌的 H 2O2 , 与
H2O2 对照组相比具有显著差异(P <0.05 ,详见图
1);蕨麻多糖能抑制联苯三酚的自氧化 ,清除超氧阴
离子(详见图 2)。蕨麻多糖对羟自由基具有清除作
用 ,呈剂量-效应关系(详见图 3)。蕨麻多糖在体外
对亚油酸过氧化作用无影响。
3　讨论
本试验应用化学模拟体系研究了蕨麻多糖对羟
自由基的清除作用 ,对联苯三酚自氧化的抑制作用
及对调理酵母聚糖诱导的小鼠脾淋巴细胞释放
H2O2 的影响 。结果表明 ,该多糖具有清除羟自由基
的作用 ,并且随着多糖浓度的升高 ,清除羟自由基的
作用显著增强 ,呈现明显的量-效关系;对调理酵母
聚糖诱导的小鼠脾淋巴细胞释放 H2O2具有抑制
图 1　蕨麻多糖清除小鼠脾淋巴细胞中 H2O2的作用
1～ 9.分别为 100 mg/ L 酵母聚糖 、100 mg/ L 酵母聚糖+50
mg/ L蕨麻多糖 、100 mg/ L 酵母聚糖+100 mg/ L 蕨麻多糖 、
100 mg/ L 酵母聚糖+200 mg/ L 蕨麻多糖 、100 mg/ L 酵母
聚糖+400 mg/ L 蕨麻多糖 、50 mg/ L 蕨麻多糖 、100 mg/ L
蕨麻多糖 、200 mg/ L蕨麻多糖 、400 mg/ L 蕨麻多糖
图 2　蕨麻多糖对联苯三酚自氧化的抑制作用
图 3　蕨麻多糖对羟自由基的清除作用
1～ 4.分别为 50、100 、200 、400 mg/ L 蕨麻多糖溶液;5.为
0.5 mmol/ L 的硫脲溶液
作用;对联苯三酚自氧化具有抑制作用 。提示蕨麻
多糖具有抗氧化作用。
60 Chinese Journal of Veterinary Science and Techno logy　Vol.34　No.4　2004
　　随着自由基生物学及其在医药学研究中的不断
深入 ,活性氧自由基的致病机理引起了人们的极大
关注 。在生物体内不断地通过非酶反应与酶反应产
生活性氧 ,但在抗氧化酶及外源性和内源性抗氧化
剂的协同作用下活性氧不断地被清除 ,在生理情况
下活性氧可维持于有利无害的极低水平[ 6] 。平衡
浓度的活性氧中一部分可履行生理作用 ,而另一部
分可损伤生物分子。已有研究表明 ,生物体的细胞
不时受到活性氧的攻击而发生损伤 ,不过损伤分子
可以得到修复 、置换 、降解 、代谢和重新合成 ,因此不
会发生活性氧的损害[ 7] ,而在衰老 、应激及某些病
理情况下活性氧产生增多或清除能力减弱 ,活性氧
可对机体造成严重损伤[ 8] 。关于多糖的抗氧化作
用已有诸多报道 ,如油柑多糖具有清除羟自由基 、超
氧阴离子和抑制脂质过氧化的作用[ 9] ;山茱萸多糖
能有效地清除羟自由基 、抑制猪油和芝麻油的氧化 ,
对超氧阴离子具有一定的清除作用[ 10] ;党参多糖 、
野菊花多糖对超氧阴离子和羟自由基均有良好的清
除作用[ 11 , 12] 。有关蕨麻多糖的抗氧化作用尚未见
文献报道 ,本试验结果表明 ,蕨麻多糖对羟自由基 、
超氧阴离子均有良好的清除作用 ,对调理酵母聚糖
诱导的小鼠脾淋巴细胞释放的 H2O2具有抑制作用 。
这一研究结果为蕨麻多糖的合理开发利用提供了理
论依据。
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Extraction of Potentilla anserine polysaccharide and its effects
of scavenging oxygen free radicals
CHEN Jiong-ran1 , WANG Qin2
(1.Lanzhou Institute of Animal Science and Veterinary Pharmaceut ics , Chinese Academy of
Agricultural Sciences , Lanzhou 730050 , China;2.College of Li fe Science ,
Lanzhou University , Lanzhou 730000 , China)
　　Abstract:Object of the experiment w as to ext ract Potent il la anserine polysaccharide and to determine its
effects of scavenging oxygen free radicals.The Potenti lla anserine polysaccharide w as ex t racted w ith hot water
at 95 ℃ and precipitated by alcohol.The protein in the ex tractions w as removed by the sevage method.The
scavenging actions of the Potenti lla anserine polysaccharide on hydroxy l radical , superoxide
61中国兽医科技　　第 34卷　　第 4期　　2004 年
传染性腔上囊病病毒 HN01超强毒株 VP2
基因的克隆和序列分析
贾　 1 , 周　斌2 , 张素芳2 , 王旭东2 , 赵玉军1 , 陈溥言2
(1.沈阳农业大学 畜牧兽医学院 , 辽宁 沈阳　110161;
　　　　　2.南京农业大学 农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室 , 江苏 南京　210095)
　　摘要:根据GenBank中登录的传染性腔上囊病病毒(IBDV)标准强毒株 52-70株基因组序列 ,
设计并合成了 1对扩增 IBDV VP2基因的特异性引物 。以 IBDV超强毒分离株 HN01感染发病鸡
腔上囊组织中提取的病毒 RNA为模板 ,用 RT-PCR扩增出了 1.45 kb的 cDNA产物 ,将扩增的 IB-
DV HN01株 VP2 基因克隆于 pMD 18-T 载体上 ,获得了 pMD 18-T-VP2 重组质粒。将 IBDV
HN01株 VP2基因序列测定结果与已发表的其他 IBDV 毒株 VP2基因序列进行分析比较 ,绘出系
统进化树。结果表明 , HN01 株与欧洲超强毒株 UK661 、日本超强毒株 OKYM 、香港超强毒株
HK46等非常相似 ,而与经典强毒株 、弱毒株和变异株相差较大 。
关键词:传染性腔上囊病病毒;VP2基因;克隆;序列分析
中图分类号:S 852.659.4　　文献标识码:A　　文章编号:1000-6419(2004)04-0062-05
　　鸡传染性腔上囊病病毒(Infectious bursal dis-
ease virus , IBDV)属于双股双节 RNA病毒科 ,禽双
股双节 RNA病毒属 ,基因组由 2个双链 RNA 节段
A和 B 组成 。A 节段(3.3 ～ 3.4 kb)包括 2个完整
的阅读框 ORF1 和 ORF2。ORF1编码分子质量为
110 ku 的前体蛋白(H2N-VPX-VP4-VP3-COOH),
经加工变为成熟的 VP2 、VP3和 VP4。现已证实 ,
VP2和 VP3是主要的结构蛋白 ,为主要的宿主保护
性抗原。其中 VP2可诱导产生保护性中和抗体 ,具
有血清型特异性[ 1 , 2] ;VP3为群特异性抗原[ 3] ;VP4
　　　　　
收稿日期:2003-12-08
基金项目:国家“ 863”计划项目(2002AA245051)
作者简介:贾 (1975 ), 男 , 河南省淇县人 , 硕士生。
陈溥言为通讯作者。
在病毒蛋白成熟过程中起重要作用[ 1] 。ORF2编码
VP5 ,它与病毒的致病性有关 ,参与病毒的释放和传
播[ 4] 。B节段(2.8 ～ 2.9kb)编码分子质量为 90 ku
的蛋白 VP1 , VP1 是病毒 RNA 依赖的 RNA 聚合
酶 ,与病毒 RNA 复制有关[ 5] 。近年来发现 , IBDV
Ⅰ型强毒株 VP2核苷酸序列的 2个酶切位点 Acc Ⅰ ～
Spe Ⅰ间存在着 1个编码 145个氨基酸残基的高度
可变区 ,在其中形成 3个重要结构 ,即 2个亲水区和
1个七肽区 。已经证明 , 2个亲水区与 VP2抗原决
定簇的形成有关 ,亲水区内氨基酸残基的改变将导
致 IBDV毒株型的变异;而七肽区的保守性与IBDV
致病力有关 ,其内的丝氨酸被取代则将导致毒力的
下降。
鸡传染性腔上囊病(IBD)是一种世界性流行的
传染病 , 20世纪80年代初就已成为危害养鸡业的
radical and hydrogen perio xide w ere invest ig ated in vi tro in this study.Results w ere as follow s:The ext ract ion
rate w as 3.8% .The Potent il la anserine polysaccharide can scavenge hydro xyl radical , superoxide radical in
chemical imitation experiments in v itro and siginificantly inhibit the production of H2O2 in splenic cells.No sig-
inificant effect of the polysaccharide was observed on lipid perioxidation induced by FeSO4-EDTA in linoleic
acid.It w as concluded from the results mentioned above that the Potenti lla anserine poly saccharide has the sig-
inificant antioxidant activity.
Key words:Potenti lla anserine;poly saccharide;oxygen free radical
62 Chinese Journal of Veterinary Science and Techno logy　Vol.34　No.4　2004