全 文 ：收稿日期:2013 － 04 － 26
基金项目:辽宁省普通高等教育本科教学改革研究项目(201203041 － 4)
* 作者简介:佟少明(1972 －) ，男，辽宁大连人，博士，副教授，从事植物细胞生物学及分子生物学研究，E-mail:tongsm@ 163． com．
辽宁大学学报
自然科学版
第 40 卷 第 3 期 2013 年
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY
Natural Sciences Edition
Vol． 40 No． 3 2013
平车前根颈直接分化无性系建立的研究
佟少明* ，王晓旭，夏鸿飞，李 慧，姜长阳
(辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081)
摘 要:以平车前根颈、叶片和叶柄为外植体，直接诱导分化生长芽，并进行生长芽的生根、试管苗移栽和移
植的研究，建立起平车前的无性系．结果表明:根颈是直接分化出生长芽的理想材料，最佳分化培养基为MS +
蔗糖 30 g /L + 6 － BA1. 5mg /L;分化芽生根的理想培养基是 1 /2MS +蔗糖 15 g /L + IAA0. 2mg /L;平车前试管
苗移栽的理想基质是园土，移栽成活率为 100%，移栽成活苗定植的成活率为 100% ．实验证明:在适宜条件下
可由根颈直接分化建立平车前无性系．
关键词:平车前;生长芽;生根;无性系
中图分类号:Q945 文献标志码:A 文章编号:1000-5846(2013)03-0284-05
Clone Construction through Direct Differentiation
from Rootstocks of Plantago Depressa
TONG Shao-ming* ，WANG Xiao-xu，XIA Hong-fei，LI Hui，JIANG Chang-yang
(College of Life Science，Liaoning Normal University，Dalian 116081，China)
Abstract: In order to preserve the wild resources and meet the needs of germchits for planting，
rootstocks，leaves，and stipe without buds of Plantago depressa were used as explants to induce
direct differentiation． The results indicated that rootstocks without buds were the best one of the
three stuffs for direct differentiation inducing without callus，MS + BA1. 5 mg /L + sucrose30 g /L
was the perfect medium for direct differentiation induction;the best medium for rooting of
differentiated buds was 1 /2MS + IAA0. 2 mg /L + sucrose15 g /L;clays from garden was the best
substrate for transplanting of regeneration plants，the transplanting survival rate was 100% and
stable planting survival rate was 100% ． This experiment proved that clone through direct
differentiation from rootstocks of Plantago depressa can be established with perfect conditions．
Key words: Plantago depressa;growth buds;rooting;clone
DOI:10.16197/j.cnki.lnunse.2013.03.012
0 引言
平车前(Plantago depressa)又名车轮菜、牛舌草等，为车前科车前属多年生草本植物．平车前为
临床上的常用中药，全草和种子均可入药．两者皆有清热、利尿、明目、祛痰等功能;用于治疗小便黄
少、暑湿泄泻、尿路感染、目赤涩痛、痰多咳嗽［1，2］．近年来，人们发现车前还有治疗慢性支气管炎，百
日咳、腮腺炎、急性黄疸性肝炎、痛风性关节炎、口舌生疮、高血压、青光眼、小儿腹泻、细菌性痢疾的
功效［3］，平车前还可作食用野菜和畜禽的青饲料．由于平车前重要的药用、食用和饲用价值，多年来
人们对其进行大量的采挖，使得野生平车前资源急剧减少，寻求平车前快速繁殖的方法迫在眉睫．此
平车前属植物的研究报道多集中于其药用价值及成分分析方面［4 ～ 8］，平车前组织培养、外植体直接
分化并建立无性系的报道较少．本研究的目的在于利用组织培养技术探索出适合平车前快速繁殖的
途径，进而建立平车前的无性系，有利于平车前的大量繁殖，获得好的经济价值及生态意义．
1 材料与方法
1. 1 材料灭菌及培养条件
在大连郊区山坡上的采摘平车前植株冲洗干净．将根颈、叶柄和叶片剪成 5cm 左右的若干个小
段或小块放到磨口广口瓶中用自来水洗涤振荡，再用安利洗涤液(体积分数为 0. 05%)洗涤 10 min，
用自来水将材料上的泡沫冲洗干净．在经过杀菌消毒处理的超净工作台上将材料用酒精(体积分数
为 70% ～75%)灭菌 12 s左右后，立即用无菌水振荡洗涤 4 次，加入 HgCl2 溶液(浓度为 0. 05%)浸
泡 14 min，迅速用无菌水洗涤 4、5 次［9］即获得平车前无菌材料．将材料转移到覆有干净无菌滤纸的
无菌培养皿中，准备剪切接种［10，11］．固体培养基中琼脂含量为 4. 5 g /L，pH 5. 8 ～ 6. 0，每日持续光照
12 h，光照强度为 2 000Lx，培养温度为 24 ℃ ．
1. 2 方法
1. 2. 1 不同浓度配比的 6 － BA 和 NAA 对平车前根颈、叶柄和叶片直接分化的影响
以 MS 为基本培养基，并添加不同浓度配比的 6 － BA 和 NAA、不同浓度的 6 － BA，配制 11 种生
长芽分化培养基．从获得的无菌材料上剪取根颈、叶片、和叶柄，其中直接将根颈切成 0. 2cm 的块状、
叶柄长度为 0. 5 cm 左右的段状、叶片为边长 0. 5 cm 左右块．将以上 3 种材料分别接种于经过灭菌
的这 11 种分化培养基中，置于光照培养箱中进行直接分化生长芽的诱导培养．直接分化试验重复 3
次，每种培养基接种培养 50 个材料．
1. 2. 2 平车前生长芽的继代、增殖培养
将根颈分化的生长芽从基部剪下，接种到以 MS 为基本培养基，附加 6 － BA 1. 5 mg /L 和蔗糖
30 g /L的培养基中于恒温光照条件下进行继代增殖培养．
1. 2. 3 不同生长素对平车前生长芽生根的影响
配制四种生长芽生根培养基，即 1 /2MS +蔗糖 15 g /L + IAA 0. 2 mg /L、1 /2MS +蔗糖 15 g /L +
IBA 0. 2 mg /L、1 /2MS +蔗糖 15 g /L + NAA 0. 2 mg /L、1 /2MS +蔗糖 15 g /L + 2，4 － D 0. 2 mg /L，
将培养基进行灭菌．将增殖后的生长芽从基部剪下，接种到这四种生根培养基上．接种时生长芽形态
学下部的生长点插入培养基(下同) ，于变温光照条件下进行生根培养．试验重复 3 次，每种培养基接
种培养 45 个材料．
1. 2. 4 不同浓度碳源对平车前生长芽生根的影响
以 1 /2MS + IAA 0. 2 mg /L 为基础培养基，配制 5 g /L、15 g /L、25 g /L 3 种浓度，3 种碳源即蔗
糖、麦芽糖和葡萄糖 9 种培养基，将生长芽从基部剪下接种到这 9 种生根培养基中，于光照培养箱中
进行诱导生根培养．不同浓度碳源对平车前生长芽生根的影响试验重复 2 次，每种培养基接种培养
30 个材料．
582第 3 期 佟少明，等:平车前根颈直接分化无性系建立的研究
1. 2. 5 不同基本培养基对平车前生长芽生根的影响
通过上述试验确定的生长素(即 IAA 0. 2 mg /L)和碳源(蔗糖 15 g /L) ，附加到 1 /2MS、MS、B5、
White和 N65 种不同的基本培养基中，再把剪下的生长芽接种到上述生根培养基上后，于变温光照
条件下进行生根诱导培养，试验中每种培养基接种 30 个生长芽，重复 2 次．
1. 2. 6 试管苗的移栽与定植
将培养着生长旺盛，根系发达试管苗的培养瓶打开瓶塞，将试管苗转移到有水的烧杯中，置于阳
光不能直射的实验台上，炼苗 3d 后移栽到上半层分别为干净河沙、炉灰渣和园土，下半层为肥沃园
土的温室花盆中，移栽试验重复 2 次，共移栽 300 株．
把在温室中移栽成活的试管苗定植到山坡下水库旁的开垦地上，共定植 100 株．
2 结果及分析
2. 1 不同浓度配比的 6 － BA 和 NAA 对平车前根颈、叶柄和叶片直接分化的影响
在只添加 6 － BA 的培养基上，材料接种 8 ～ 10 d左右，观察到根颈切口处及中段膨大，15 d后有
绿色芽点产生．接种 15 d后 1 号 － 6 号培养基中根颈也见膨大，逐渐形成愈伤组织．单独使用 6 － BA
会促进根颈生长芽的分化，6 － BA 浓度不同对根颈生长芽的诱导效果有较大差异根颈，6 － BA 浓度
为 1. 5 mg /L 时生长芽诱导率最高为 86%(表 1) ，生长芽长势很好(图 1)．当配合 NAA 使用时，根颈
易分化成愈伤组织，随着培养时间增加，在添加 NAA 的培养基中的根颈外植体极易分化不定根，影
响生长芽的分化．另外，接种 8 d后叶片、叶柄切口处开始膨大，15 d 后叶片切口分化出少量白色愈
伤组织，但一直未见生长芽点产生．随培养时间延长，由切口处分化的愈伤组织逐渐褐化，部分直接
分化大量不定根．由此可见，在 MS +蔗糖 30 g /L + 6 － BA 1. 5mg /L 培养基上，根颈是平车前分化生
长芽的理想外植体．
表 1 不同浓度配比的 6 － BA和 NAA对平车前不同材料直接分化的影响
序号 NAA BA 接种数(个)
分化苗数(个)
叶片 叶柄 根颈
1 0． 1 0． 5 50 0 0 0
2 0． 1 1． 0 50 0 0 8
3 0． 1 1． 5 50 0 0 6
4 0． 1 2． 5 50 0 0 5
5 0． 1 3． 0 50 0 0 0
6 0 0． 5 50 0 0 0
7 0 1． 0 50 0 0 0
8 0 1． 5 50 0 0 43
9 0 2． 0 50 0 0 37
10 0 2． 5 50 0 0 24
11 0 3． 0 50 0 0 8
2. 2 平车前生长芽的继代、增殖培养
继代、增殖培养 28d观察统计，在以 MS 为基本培养基，附加 6 － BA 1. 5 mg /L 和蔗糖 30 g /L 的
培养基中获得大量的生长芽，平均每个接种的生长芽增殖了 4. 62 倍．
2. 2. 1 不同生长素对平车前生长芽生根的影响
接种后每隔 7 d观察一次生根情况并进行详细记录，生根培养 28 d后观察统计结果见表 2．由表
可见，在以 IAA 为生长素进行生根的生长芽长势最好(见图 2)且生根率达到 100% ．在添加 IAA 培
养基上，生长芽培养至第 8 d开始生根．从苗长势、平均生根数及根平均长等方面看，光照变温条件下
利于平车前生长芽生根的生长素依次为 IAA、NAA、IBA 和 2，4 － D．观察发现，培养基中不添加生长
素，生长芽也能生根．因此，IAA 是平车前生长芽生根的最适生长素．
682 辽宁大学学报 自然科学版 2013 年
表 2 生长芽变温光照下生根情况
激素配比(mg /L)
IAA IBA NAA 2，4 － D
接种数
(个)
生根率
(%)
平均每株生
根数(条)
根平均长
(cm) 苗长势
0 0 0 0 45 100 2． 23 1． 56 +
0． 2 0 0 0 45 100 5． 67 3． 89 + + +
0 0． 2 0 0 45 86． 7 4． 47 2． 78 +
0 0 0． 2 0 45 95． 6 5． 12 3． 13 + +
0 0 0 0． 2 45 0 0 0d +
注:+ + +长势很好;+ +长势较好;+长势一般．
2. 2. 2 不同浓度碳源对平车前生长芽生根的影响
接种后每隔 7 d观察生长芽生根情况，培养至第 28 d后统计结果见表 3．观察发现以蔗糖为碳源
的培养基对根的诱导效果要好于以葡萄糖和麦芽糖为碳源的培养基，不同碳源的培养基，15 g /L 的
浓度诱导效果要优于其他两种浓度碳源的培养基．以蔗糖为碳源的生根诱导培养基，根系呈绿色，白
色嫩根常见，且添加蔗糖 15 g /L 的培养基上苗长势最好(见图 3)、平均根数较多且根平均长最长．因
此诱导平车前生长芽生根的理想碳源是蔗糖，理想浓度为 15g /L．
表 3 平车前生长芽恒温光照下生根情况
碳源种类及浓度(g /L) 接种数(个) 生根率(%) 平均每株生根(条) 根平均长(cm) 苗长势
蔗糖 5 30 93． 3 4． 67 2． 91 + +
15 30 100 5． 07 3． 07 + + +
25 30 100 6． 28 2． 71 + +
麦芽糖 5 30 93． 3 4． 57 2． 52 +
15 30 73． 3 4． 36 2． 92 + +
25 30 75 4． 53 2． 27 +
葡萄糖 5 30 100 3． 29 2． 49 +
15 30 100 5． 85 2． 66 + + +
25 30 100 3． 91 2． 24 + +
注:+ + +长势好;+ +长势较好;+长势一般．
2. 2. 3 不同基本培养基对平车前生长芽生根的影响
接种培养至第 28 d时对生根状况进行观察统计，结果见表 4． 观察表明，接种到培养基中的第
7 ～ 8 d已有植株开始生根．在相同生长素(即 IAA 0. 2 mg /L)和碳源(蔗糖 15 g /L)条件下，5 种基本
培养基中以 1 /2MS 为基本培养基中平车前生长芽生根状态最好． 在 1 /2MS +蔗糖 15g /L + IAA
0. 2 mg /L这种培养基上，生长芽生根率达到 100%且试管苗长势旺盛，平均每株试管苗生根 7. 22
条、每条根的平均长度 3. 12 cm，主根粗壮，根系为绿色，并有白色嫩根长出．以 N6 为基本培养基的
生根诱导培养基，虽然生根状况很好，但根系呈现红色(见图 4)．因此，1 /2MS 是平车前生长芽生根
的理想基本培养基，1 /2MS +蔗糖 15 g /L + IAA0. 2 mg /L 是车前草生长芽生根培养的理想培养基．
表 4 平车前生长芽变温光照下生根情况
基本培养基 接种数(个) 生根率(%) 平均每株生根数(条) 根平均长(cm) 苗长势
1 /2MS 30 100 7． 22 3． 12 + + +
MS 30 93． 3 5． 29 1． 86 + +
B5 30 100 5． 06 2． 22 + +
White 30 33． 3 2． 23 2． 34 －
N6 30 86． 7 6． 77 2． 89 +
注:+ +长势好;+长势一般;－长势差．
2. 2. 4 试管苗的移栽与定植
移栽后 30 d统计证明:平车前试管苗移栽的理想基质为园土，移栽成活 300 株，成活率为 100%
(图 5)．
定植后 30 d统计证明:平车前试管苗定植成活 100 株，成活率 100% ．定植成活的试管苗生长良
好，当年开花结果，保持了野生平车前的植物学性状．
782第 3 期 佟少明，等:平车前根颈直接分化无性系建立的研究
图 1 平车前的分化芽 图 2 IAA对平车前生根的诱导 图 3 15 g·L －1的蔗糖对平车前生根的诱导
图 4 N6 对平车前生根的诱导 图 5 移栽的试管苗
3 讨论
诱导平车前不同外植体直接分化生长芽的实验证明:根颈是最适合直接分化的外植体，这表明
在相同培养条件下细胞的结构和生理状态的不同会导致不同组织产生不同的反应［12，13］． 该试验表
明，6 － BA能促进平车前根颈直接分化生长芽，但对叶片、叶柄直接分化生长芽无促进作用．在添加
不同浓度配比的 6 － BA和 NAA的生长芽分化培养基中，三种外植体都极易形成愈伤组织，随着培养
时间的增加愈伤组织会再分化形成不定根，影响生长芽的诱导，所以在生长芽诱导培养基中应避免
添加 NAA．当培养基中添加的 6 － BA 浓度发生变化时，对平车前生长芽的诱导情况有显著影响，最
适浓度为 1. 5 mg /L．在生长芽生根诱导中，培养基中不添加生长素，生长芽也能生根，由此可见平车
前离体组织本身含有内源生长素．以蔗糖为碳源的生根诱导培养基，根系呈绿色，白色嫩根常见，说
明根系进行光合作用，生长状况很好，随着培养时间的延长，由于植物本身的光合作用，蔗糖5 g /L、
蔗糖 15 g /L的培养基中试管苗根长度、根长势，苗长势并无太大差异．以 N6 为基本培养基的生根诱
导培养基，虽然生根状况很好，但根系呈现红色，说明花青素较多，根系的光合作用较弱．本次研究成
功地获得了平车前根颈的直接分化的生长芽，建立了平车前无性系．
参 考 文 献 :
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(责任编辑 李 超)
882 辽宁大学学报 自然科学版 2013 年