全 文 ：平车前多糖抗氧化作用研究
朱 月 ,李金香　(赤峰学院生命科学系,内蒙古赤峰 024000)
摘要　[目的 ]探寻平车前多糖对羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2 -·)的清除作用。 [方法 ]在热水浸提、分离纯化获取平车
前多糖的基础上 ,构建“邻二氮菲 -Fe2+氧化法产生羟自由基”和“邻苯三酚自氧化反应产生超氧阴离子自由基 ”的反应体系 ,通过紫外
可见分光光度法研究平车前多糖对体系中产生的羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2-· )的清除作用。 [结果]平车前多糖对羟自由基和超氧阴离子自由基均具有一定的清除作用 ,并在不同浓度范围内对自由基的清除作用呈上升趋势。 [结论]平车前多糖具有一
定的抗氧化作用。
关键词　平车前多糖;羟自由基;超氧阴离子自由基;清除作用
中图分类号　S567.21+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)30-16853-02
StudyonAntioxidationofPlantagodepressaPolysaccharide
ZHUYueetal　(DepartmentofLifeScience, ChifengColege, Chifeng, InnerMongolia024000)
Abstract　[ Objective] TheaimwastoexplorethescavengingactivityofPlantagodepressapolysaccharidetohydroxylfreeradical(· OH)and
superoxideanionfreeradical(O2 -·).[ Method] Plantagodepressapolysaccharidewasextractedbyhotwaterextraction, thenisolatedand
purified.Thehydroxylfreeradicalandsuperoxideanionfreeradicalwasgeneratedbythephenanthroline-Fe2+systemandtheautoxidation
reactionsystemofpyrogalolrespectively.SpectrophotometrywasusedtoobservetheeffectofPlantagodepressapolysaccharideonthefreerad-
ical.[ Result] TheresultsshowedthatPlantagodepresapolysaccharidehadscavengingefectsonO2-·and·OH, andatdiferentconcen-
trationstherewasarisingtrendofthescavengingactivity.[ Conclusion] ItwasdemonstratedthatPlantagodepressapolysaccharidehadcertain
antioxidationefect.
Keywords　 Plantagodepressapolysaccharide;Hydroxylfreeradical;Superoxideanionfreeradical;Scavengingactivity
作者简介　朱月(1958-),女,辽宁黑山人,教授,从事生物化学研究。
收稿日期　 2010-07-26
　　平车前(PlantagodepresaWild.)为车前科 1年生或 2
年生草本植物 ,又称牛甜菜 、驴耳杂茸。生于山坡 、河边 、田
埂 、路旁或宅畔 ,喜湿润 ,耐干旱 ,亦耐践踏 ,在全国各地均有
分布 [ 1] 。全草均可入药 ,具有清热利水 、明目祛痘 、降压等作
用 ,对伤寒杆菌 、副伤寒杆菌 、大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌等
有抑制作用。目前关于平车前多糖对羟自由基和氧自由基
清除作用的研究尚未见报道 [ 2] 。笔者通过热水浸提 、分离纯
化得到平车前多糖 ,研究了平车前多糖对羟自由基及超氧阴
离子自由基的清除作用及其规律 ,并揭示了平车前多糖的抗
氧化作用 ,旨在为平车前多糖的开发和利用提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　供试材料　平车前 ,采自内蒙古赤峰市红山区。
1.2　主要试剂与仪器 　 Na2 HPO4 、 NaH2PO4、邻二氮菲 、
FeSO4、H2O2 、三羟甲基氨基甲烷 、盐酸 、邻苯三酚 、95%乙醇 、
氯仿 、正丁醇 ,以上试剂均为分析纯 。UV-9100紫外可见分
光光度计(北京瑞利), FA1004N电子天平(上海精密仪器科
学有限责任公司), D2kw-4恒温水浴锅(江苏省金坛市杰瑞
尔电器有限公司), TDB低速离心机(湘仪离心机仪器有限公
司), p5-37c0.01级精密速显酸度计(上海天达仪器有限公
司), cs101-ab电热鼓风干燥箱(重庆试验设备厂), GSP-80-
02磁力搅拌器(山东电讯七厂)等 。
1.3　方法
1.3.1　平车前多糖的提取。将平车前整株洗净 ,于 70℃恒温
箱中烘干 ,研磨成粉末 ,过筛;称取过筛的平车前粉末 10 g,按
1∶20的料液比加入去离子水于锥形瓶中 ,摇匀 ,在 70 ℃恒温水
浴锅中浸提 2h,共浸提 3次 ,每次浸提液以 3 000r/min离心 10
min,收集上清液于烧杯中;将上清液于 70℃恒温烘干箱中浓
缩至一定体积 ,并用去离子水将黏附在烧杯壁上的多糖洗脱 ,
定容至 50ml,即得水溶性平车前粗多糖提取液。
1.3.2　平车前多糖的分离纯化。向粗多糖提取液中加入 3
倍体积的 95%乙醇 , 4℃培养箱中醇析 24h, 4 000r/min离心
8min,去上清液 ,将沉淀加入 1 ～ 2倍体积的无水乙醇(脱
脂),充分搅拌转移至烧杯中 ,静置 1 h, 4 000 r/min离心 8
min,去上清液 ,沉淀物即为粗多糖。采用透析法去除低聚
糖 、氨基酸 、单糖 、盐类等小分子杂质 ,并向粗多糖溶液中加
入等量的 Sevag试剂 ,剧烈振荡 20 ～ 30 min,将混合液转移至
分液漏斗内 ,静置一段时间后 ,混合液分为 3层 ,最上层为糖
溶液 ,中层和下层为变性的蛋白质和有机相。从分液漏斗的
下口将中层和下层的变性蛋白质和有机相缓慢放出 ,保留上
层的糖液 ,再将糖液加入等量的 Sevag试剂 ,重复上述操作 ,
至分液层中无变性蛋白质为止 ,获取除杂质的多糖溶液。向
多糖溶液中加入 1 ～ 2倍体积的无水乙醇 ,静置 1 h, 4 000
r/min离心 8 min,弃上清液 ,所得沉淀即为纯化的平车前多
糖。将平车前多糖在 70 ℃恒温烘干箱中烘干 ,备用。
1.3.3　平车前多糖对羟自由基的清除作用。称取平车前多
糖 50mg,定容至 50 ml,配成 1 mg/ml样品标准液。再以样
品标准液为原液 ,配制成不同浓度的样品液 ,构建平车前多
糖对羟自由基清除作用的反应体系(表 1)。按表 1加样后
在 37℃恒温水浴锅中保温 1.5h,在 536nm波长下测定各管
的光吸收值 ,计算平车前多糖对羟自由基的清除率(%)。
羟自由基清除率(%)=(A3 -A2)/(A1 -A2)×100
1.3.4　平车前多糖对超氧阴离子自由基的清除作用。①邻
苯三酚自氧化速率的测定。将表 2中的各试剂在 25 ℃恒温
条件下预热 10min后 ,按表 2加样顺序加入试剂 ,测定光吸
收值 [ 3] 。②加入不同浓度多糖后自氧化速率的测定 。按表 3
加样后 ,测定方法同①。计算平车前多糖对超氧阴离子自由
基的清除率(%)。
清除率(%)=〔■A2 -(■A4 -■A3)〕/■A2 ×100
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(30):16853-16854, 16857 责任编辑　乔利利　责任校对　况玲玲
表 1　平车前多糖对羟自由基清除作用的反应体系
Table1　 ThereactionsystemofPlantagodepressapolysaccharidetohydroxylfreeradical(· OH) ml
试剂
Reagent
空白(A0)
Blanktube
未损伤管(A1)Undamagedtube
A1-1 A1 -2 A1 -3
损伤管(A2)Damagedtube
A2 -1 A2 -2 A2 -3
样品管(A3)Sampletube
A3 -1 A3 -2 A3 -3缓冲液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0邻二氮菲 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8FeSO4 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5去离子水 4.0 2.7 2.7 2.7 2.2 2.2 2.2 1.7 1.7 1.7
0.1%H2O2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5不同浓度样品液 0.5 0.5 0.5
表 2　邻苯三酚自氧化速率测定的加样量
Table2　Theorderofaddingsamplefordeterminationofautoxidation
rateofpyrogallol ml
试剂Reagent
空白管(A1)Blanktube
邻苯三酚自氧化管(A2)Pyrogalolautoxidationtube
0.05mol/Ltris-HCl缓冲液(pH值 8.2) 3.8 3.8
0.01mol/LHCl 0.2 0.1
0.005mol/L邻苯三酚 0.1
表 3　加入不同浓度多糖后自氧化速率测定的加样量
Table3　Theorderofaddingsamplefordeterminationofautoxidation
rateunderdiferentconcentrationofpolysaccharide ml
试剂Reagent
空白管(A1)Blanktube
样品空白管(A3)Blanktubeofsamples
样品管(A4)Sampletube
0.05mol/Ltris-HCl缓冲液(pH值 8.2) 3.8 3.8 3.8
0.01mol/LHCl 0.2 0.1
0.005mol/L邻苯三酚 0.1不同浓度样液 0.1 0.1
2　结果与分析
2.1　平车前多糖对羟自由基的清除作用　分别配制浓度为
0.02、0.06、0.10、0.14、0.18和 0.20 mg/ml的平车前多糖样
品液 ,测定其对羟自由基的清除作用。结果(图 1)表明 ,在一
定浓度范围内 ,平车前多糖对羟自由基有一定程度的清除作
用 。样品液浓度在 0.02 ～ 0.14 mg/ml范围内 ,平车前多糖对
羟自由基的清除作用随着浓度的增大而增大 ,但增幅不明
显;浓度继续增加 ,平车前多糖对羟自由基仍具有清除作用 ,
但清除能力呈下降趋势。
2.2　平车前多糖对超氧阴离子自由基的清除作用　分别配
制浓度为 0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.40、0.80和 1.00 mg/ml
的平车前多糖样品液 ,测定其对超氧阴离子自由基的清除作
用。结果(图 2)表明 ,在一定浓度范围内 ,平车前多糖对超氧
阴离子自由基具有一定的清除作用。样品液浓度在 0.04 ～
0.40 mg/ml范围内 ,平车前多糖对超氧阴离子自由基的清除作
用呈上升趋势 ,上升趋势也不十分明显;浓度继续增加 ,对超氧
阴离子自由基仍具有清除作用 ,但清除能力呈下降趋势。
3　结论与讨论
根据 Feton反应的原理 [ 4]可以判断 ,如果平车前多糖对
羟自由基具有清除作用 ,则在波长 536nm处光吸收值变化不
明显 ,故可通过测定 Feton反应体系中加入不同浓度平车前
多糖后光吸收值的变化 ,来判断平车前多糖对羟自由基的清
除能力。根据邻苯三酚自氧化速率测定的原理 [ 5] ,如果邻苯
三酚自氧化体系中加入不同浓度的平车前多糖后 ,光吸收值
减少 ,则说明平车前多糖对超氧阴离子自由基有清除作用。
图 1　平车前多糖对羟自由基的清除作用
Fig.1　ThescavengingefectofPlantagodepressapolysaccharide
tohydroxylfreeradical
图 2　平车前多糖对超氧阴离子自由基的清除作用
Fig.2　ThescavengingefectofPlantagodepressapolysaccharide
tosuperoxideanionfreeradical
该研究表明 ,平车前多糖具有一定的抗氧化作用。在一
定的浓度范围内 ,平车前多糖对羟自由基和超氧阴离子自由
基均具有不同程度的清除作用。样品液浓度在 0.02 ～ 0.14
mg/ml范围内 ,平车前多糖对羟自由基的清除作用随着浓度
的增大而增大 ,但增幅不明显;浓度继续增加 ,平车前多糖对
羟自由基仍具有清除作用 ,但清除能力呈下降趋势。样品液
浓度在 0.04 ～ 0.40 mg/ml范围内 ,平车前多糖对超氧阴离子
自由基的清除作用呈上升趋势 ,上升趋势也不十分明显;浓
度继续增加 ,对超氧阴离子自由基仍具有清除作用 ,但清除
能力呈下降趋势。这可能是由于在有自由基引发剂存在的
条件下 ,多糖与单糖类似也可以自动氧化产生新的有机自由
基 ,使多糖本身产生的有机自由基与它清除的自由基达到平
衡 ,而在低浓度下 ,减少了多糖分子与自由基引发剂的反应
概率 ,表现出多糖清除氧自由基的作用 [ 6] 。
(下转第 16857页)
16854 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年
按 “1.2.1.3”方法测定的吸光值分别为 0.250 3、0.250 0、
0.249 5、0.249 5、 0.250 1、 0.250 0、 0.250 3, RSD为
0.033 6%,说明仪器的精密度良好 。
2.2.3　重现性试验 。准确称取干燥的(50 ℃, 4 h)茄根粉
末(过 100目筛)1g,共 4份 ,按 “1.2.1.2”方法制备供试品
溶液 ,精密吸取 0.1 ml,按 “1.2.1.3”方法测定的吸光值分别
为 0.322 1、0.324 8、0.333 5、0.3231, RSD为 0.520%,说明该
方法具有良好的重现性。
2.2.4　稳定性试验。精密吸取对照品溶液 0.2、0.1 ml,分
别按 “1.2.1.3”测定方法显色后在室温下避光放置 ,于 0、
30、 60、 90、 120 min时测吸光值 ,其 RSD为 0.465 8%,说明
显色溶液在 120 min内稳定性良好。
2.2.5　加标回收率试验。准确称取干燥的(50 ℃, 4 h)茄
根粉末(过 100目筛)1 g,共 9份 ,分成 3组 ,各组分别加
0.50、1.00、1.50ml绿原酸标准溶液(1.33mg/ml),依次加入
9.50 、9.00、8.50 ml75%甲醇 ,准确称重 。在 50℃条件下超
声提取 2.5h,取出 ,冷却 ,称量 ,用 75%甲醇补足重量。过
滤 ,取滤液 0.1 ml于 10 ml容量瓶中 ,按 “1.2.1.3”方法测定
吸光值。得平均加标回收率为 97.47%, RSD为 3.64%
(表 2)。
表 2　加标回收率试验结果
Table2　Testresultsofrecoveryofstandardaddition
编号
No.
样品含量∥mg/g
Samplecontent
本底量∥mg
Originalamount
加标量∥mg
Addedamount
吸光值
Absorbance
测得总量∥mg
Totalmeasurement
回收率∥%
Recoveryrate
平均值∥%
Mean
RSD
%
1 2.442 0.665 0.368 0 2.952 95.01 97.47 3.64
2 2.443 0.665 0.372 0 2.986 96.07
3 2.456 0.665 0.370 8 2.976 95.35
4 2.721 2.451 1.330 0.453 3 3.676 97.22
5 2.449 1.330 0.450 6 3.653 96.67
6 2.456 1.330 0.448 8 3.638 96.09
7 2.448 1.995 0.546 8 4.407 99.19
8 2.458 1.995 0.546 7 4.469 100.36
9 2.453 1.995 0.551 0 4.505 101.28
3　结论与讨论
3.1　供试品制备方法的考察　该试验比较了不同浸提方法
(冷浸 、回流和不同温度下超声)、不同提取时间的提取效果 ,
考察了不同浓度溶剂及不同固液比的提取率 ,发现 50 ℃超
声浸提 2.5h,固液比为 1∶10,提取溶剂为 75%甲醇时提取效
率较高。
3.2　显色条件的考察　该试验考察了最大吸收波长 ,显色
剂用量 ,显色温度 ,显色时间和 Na2CO3用量对显色反应的影
响 。发现适宜的显色条件为:显色剂用量 0.5 ml, 20%
Na2CO3溶液用量 0.75ml,显色温度 40 ℃,显色时间 50 min,
测定波长 768 nm。
3.3　方法学的验证　通过 Folin-Ciocalteu比色法的效能指
标试验 ,证实了方法的线性关系良好(R2 =0.999 6),线性范
围为 0.009 6 ～0.076 8 mg(绿原酸为对照品),方法精密度试
验的 RSD值为 0.033 6%;重现性试验的 RSD值为
0.520 4%;稳定性试验的 RSD值为 0.465 8%(0 ～ 2 h);平均
加标回收率为 97.47%, RSD值为 3.64%。
综上所述 ,该研究采用超声辅助浸提法制备茄根供试
品 ,建立了 Folin-Ciocalteu比色法测定茄根中总多酚含量的
方法。测得茄根中总多酚含量为 0.272%,方法的 RSD为
0.98%。且方法的精密度 、稳定性 、回收率等指标均满足测定
需要。
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(上接第 16854页)
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1685738卷 30期　　　　　　　　　　　　　　　　李双双等　茄根中总多酚含量的测定