全 文 ：第 卷 第 期 中 华 中 医 药 学 刊
年 月
耳叶牛皮消苷 代谢产物抗肿瘤及
诱导肿瘤细胞凋 亡机制 的研究
陶锋 ， 张如松
浙江医学高等专科学校药学系 ， 浙江 杭州 浙江 中医药大学药学院 ， 浙江 杭州
摘 要 ： 目 的 ：研 究耳叶牛皮消 苷 总代谢物 （ 对肿瘤 细胞 的 抑制作 用及诱导肿 瘤 细胞凋 亡机制 ： 方
法 ：采用 法 ，观察 对肿瘤 细胞的抑制率 以及 丨 ： 。评价其体 外抗肿 瘤作用 ； 通过流 式细炮术 （ 考 察
的诱导肿瘤 细胞凋 亡机制 。 结 果 对 多 种肿瘤细胞具有显 著抑 制作 用 ； 且 能诱导 细 胞凋 亡 ， 使
肿瘤细胞周 期 阻滞在 期 。 结论 具有 显著的抗肿瘤作 用 ， 且具有诱导肿瘤 细胞凋 亡的 能力 。
关键词 ： 耳叶牛皮 消 苷 代谢物 抗肿瘤
中 图分类号 文献标志码 文章编号
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一
白 首乌 系 萝摩科鹅绒藤 属植物耳叶牛皮消 （
的干燥块根 。 是一味常用
的扶正固本中药 ，研究表明 ， 甾 体是 白 首乌 的活性成分 ， ㈦
可以发挥有效清除体 内游离基 ，调节免疫等作用 ，达到
抗肿瘤 的功效 。 耳叶牛 皮消苷 是本课题组从 白首
乌 削本总苗 中分离 得 到 的单体化合物 （ 其结构见 °
。 前期研究中发现 ，耳叶牛皮消苷 具有较强 的体 内抗 一
肿瘤活性 但体外 抑瘤 活性 不强 因此可 以推断其抗肿
瘤活性可能与其体内 代谢相关 。 本次研究采用体外
试验 评价耳叶牛皮消苷 代谢产物 （ 对肿瘤细胞的
，
体外生长抑 制作用瓶过流式细胞术 （ 研究 诱
，，
目 丨树牛皮消苷 的结构 中
导肿瘤繊调亡的作用 。 细胞株 人宫颈癌 细胞 人 胃腺癌
细胞 人前列腺癌 细胞 ， 由 浙江省医 学科学院药物 药收稿 日 期 研穷所棍伴基金项 目 ： 浙江省医药卫生科学研究基金项 目 （ 丄 抓 。 丨 队 二 一 丄
作者简介 ： 陶锋 （ 丨 男 浙江湖 州人 讲师 博 士 ， 研究方 向 ： 动物 大 鼠 ’ 难性 ’ 购 自 浙江 中 医药
天然药物化学 大学动物 中心 ，许可证号 沪 ） 。
通讯作者 张如松 （ 男 教授 博 士研究生导 师 研究方向 ： 的分离 及配 制 取 只 大鼠 。 以
中药药效物质与创新药物 的研究开发 。 的剂量给予耳叶牛皮消苷 第 给药 后相同
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剂量再给药 次 ， 后 ，腹腔静脉取血 血液合并 。 置 胞的抑制作用见图 。 结果表 明 ， 对 种 肿瘤 细胞均
冰箱过夜 ，离心 （ ， 分离 出 血清 ， 灭 有较强增殖抑 制作 用 并呈现 出显著的 剂量 效应关系 。
活 置 弋 冰箱保存后经 甲 醇 ： 水 ： 同时表 显示 对 种肿瘤细胞的 。均小于耳叶牛
得到耳叶牛皮消苷 代谢总产物 共 。 皮 消苷 ， 说明耳叶牛皮消苷 经代谢后抗肿瘤作用增强 。
试 剂 培养基 含双抗 ， 公司 ；新生
小牛血清 ，杭州 四季青 生物工程材料研究所 ； 胰蛋 白
， 瀘酶 ，上海生工公司 进 口分装 ；二甲基亚砜 ， 无锡海硕生物 有 一
限公司 四 甲 基偶氮唑盐 ） ，杭州昊天生物技术有限公 承 “ 一
司 。 杭 州 联科 生 物 技 术 有 限公 司 ； “
凯基生物科技发展有限公司 ； 碘化丙啶 （ 杭 ⋯ ▲⋯
州联科生物技术有 限公司 。
仪 器 细胞培 养 箱 美 国
“
公 司 ； 超净工作 台 苏 州安泰
空气技术公司 ；倒置显微镜 ： 日 本 公司 ； 酶 浓度 （ 卩
标仪 ：美 国 公司 ；流式细胞仪 ， 贝 克
曼库尔特商贸 （ 中国 ）有限公 司 。 图 不 同浓度 处理 后对 种
力 法 肿瘤细胞的抑制作 用 ±
法测 定 对 肿 瘤 细 胞 的 抑 制 率 及 流 式 细胞 术 检测 细胞调 亡 率
’流式细胞分析图主要
对数生长期的 、 、 细胞 ， 将所选的 细 显示 愧 区为机械损伤细胞 区为死细胞及晚期
胞数接种于 孔板上 孔 。 培养 后加药 ， 给 调亡细胞 区代表活细胞 区代表早 亡细胞 。
舰醒 为 、 、 、 、 。 同时制照翻 过测定 区 始量 ’ 可 以麵 诱导细細亡的能
空 白组 。 每组设 复孔 培养 后 每孔加人 力 。
⋯培养 后倾去培养液 分别 加人 表 与耳叶 牛皮 消苷 对 种肿瘤细胞
溶解 ， 振摇 后 。 用 酶标仪在 波 长处 测 定 的 綱。 ⋯
值 。 并算出不同浓度 对肿瘤细胞的抑 制 率 根据 药物
抑制率计算药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度 （ 。用 —
‘
—
软件计算 耳 叶牛皮消苷 士 ± ±
± 土 ±
抑制率计算公式 正飢明孔 给药忆〇 孔 配结果 （见插页 图 显示 正常对照组细胞调亡
流式 细胞术 （ 检测 细 胞凋 亡率 取对数生长期 率仅为 给药组 随 浓度 的升高 早期凋亡细胞逐
的 单细胞悬液 调整细胞密度 以 个 瓶 ， 接种 渐增多 ，细 胞凋 亡率逐渐增大 ， 当浓度达到 时 ，
于 培养瓶 中 ， 给药组终浓 度分别 为 、 、 凋亡率升至 ，与正常对照组相 比有极显著差异 （
另设对照组加入等量培养液 培养 离心 。 表明 《八人 可诱导 ？ ： 胞凋 亡 并具有量 效关
洗 次 ， 以去除 细胞悬 液中 的细胞碎 片 。 系 ， 见表 。
收集 个细胞 加 表 诱导 细胞调亡率的影响
吹打均匀 加人 避光 染 色 ， 组别 剂量 凋亡率 ％
测定 调亡百分率 。 正常对照组 ±
对 肿瘤 细胞 周 期 的 调 控 取对数生长
⋯ 、’
±
期的 单细胞悬液 调整细 胞密度 以 个 瓶 ，接 组 ±
种于 培养瓶中 ， 给药组加人 使终浓度为 、 ±
正常对照组加人等量培养液 ； 培养 离 注 与正常对照组 比较 ， 。
心 、 ， 洗 次 去除细胞悬 液中 的细胞碎 对 肿 瘤 细胞周 期 的 调 控 研究结果 （ 表
中 片 。 收集 个细胞 乙醇固定 ， 保 、插页 图 显示 ，正常对照组细胞 期 占
存 ， 洗去固定液 。 期 占 期 占 给药后 ，随着给药浓 度
医 后 加人 染 色混 匀 避光 后用 检 逐渐 升高 ， 期 比例逐渐降低 ， 期逐渐升高 ， 期
测 。 由 带通滤光片接收 通过 散点 图 收集细 变化不大 。 当浓度达到 时 《 期占
胞 ，采用设门技术排除粘连细胞和在碎片 ，分析荧光直方图 期 占 期 占 此结果说明 ， 可以
上细胞各周期的百分率 。 数据用 机型的 软 作用 细胞增殖的 关卡 有利于诱导肿瘤细 胞
刊 件分析 。 两组间差异用 《 检验计算 。 分化 达到抑制肿瘤 细胞增殖的 冃 的 。 此结 果与上述流式
结 果 细胞分析测定 具有诱导 细胞凋亡的结果相 吻
对 肿 瘤细 胞的 增 殖抑 制 作用 对肿 瘤细 合 。
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表 对 细胞周期阻滞的影响 《 胞阻滞于 期 ，从而诱导肿瘤细胞分化 ， 达到抑制肿瘤
细胞增殖的 目 的 ，该结果与上述流式细胞分析结果相吻合 。
正常对照组 参考文献
】
：
注 ： 与正常对照组比较 ， 。 “
讨 论 ，
耳叶牛皮消苷 是从中药 白首乌 中提取出 来的一个
—
抗肿瘤活性 靴合物 ， 在細贿 巾发—化合 ’— ― ’
：物具有非常显著的体内抗肿瘤活性 ’但体外抗肿瘤活性 张如松 叶益萍 刘玉兰 白首乌留体总音的体外抗肿瘤細
弱 ，所以耳叶牛皮消苷 在代谢过程 中可能生成了抗肿瘤 中草药 ， ：
活性更强的成分 。 本研究就耳叶牛皮消苷 的体内 代谢 ⑷ 张如松 ， 叶益萍 ，沈月 毛等 白 首乌体外抑制肿瘤细胞的成分
总产物 进行 了考察 观察其对 、 和 研究 〗 药学学报 ， ：
的体外抗肿瘤作用 ，发现 的抗肿瘤活性强于耳叶 王一奇 刘玉兰 ，张如松 白 首乌新苷 抗肿瘤及诱导肿瘤细
牛皮消苷 。 胞凋亡作用的研究
染色法是一种常用 的细胞凋亡检测
技术 。 流式细胞分析图主要显示 个区 区为机械损伤
细胞 区为死细胞及晚期凋亡细胞 区代表活 细胞 ； ：
区代表早期凋亡细胞 。 〕 。 结果表 明 ， 正常对照组细胞 徐淑云 ’卞如 濂 ’陈修 ’ 等 药理试验方法学 版 北
调亡報为 给药组随给药浓度 的升高 早期凋亡细 氣人 民卫生出版社 ’施 ’
胞逐渐增多 ， 细胞凋亡率逐渐增大 ， 当 浓度达到
— 、 」 ■ “ 一 一 、 一 ， 一 、 ，时 凋亡率增加至 与正常对照组相 比有极显著差
异 。 表明 可诱导 细胞调亡 ’并具有
量 效关系 。
，
细胞周期是细胞增殖过程 中两次有丝分裂之间所有阶
段的总称 。 包括 个阶段即 合成 則 期 ） ，
合成期 ） ， 合成后期 ） 和 有丝分裂期 ） 。 的 ，
含量随各时相会发生周期性变化 。 正常细胞的 期
含量较为恒定 ， 而肿瘤增殖时 ， 期 量通常会迅速增
力口 ， 出 现异常 。 本次研究发现 随着 给药剂量升 ， ， ：
高 期 含量棊本稳定 说明肿瘤细胞并未大量增殖 ；
期 含量增加 说明肿瘤细胞 受损伤后进行 丨 丨 吐 。
修复 ，从而大量阻滞在 期 其中一部分损伤严重的细
胞则发生细 调亡 。 本次研究结果細 ， 能使肿瘤细
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