全 文 ：大理大学学报
JOURNAL OF DALI UNIVERSITY
第1卷 第8期 2016 年8月
Vol.1 No.8 Aug. 2016
［DOI］10. 3969 / j. issn. 2096-2266. 2016. 08. 005
泡核桃（Juglans sigillata Dode．）又名漾濞核桃，
系胡桃亚科 Juglandaceae胡桃属 Juglans植物〔1〕，主
要分布在云南、贵州、四川等地〔2〕。2013年 3月，国
家质检总局批准对漾濞泡核桃实施地理标志产品
保护。核桃植株全身都是宝，除了其果仁可食用
外，核桃枝、核桃花、核桃壳、核桃叶等都可入药〔3〕。
核桃花即核桃花柱，又称核桃纽，长寿菜，龙须菜，
含有丰富的磷脂，有益于增强人体细胞活力，促进
人体造血功能，能有效降低血脂，胆固醇，预防动脉
硬化，此外核桃花酊剂可治疣子〔4〕。贾忠等〔5〕从核
桃花中分离鉴定了7个黄酮类化合物。赵磊等〔6〕采
用HPLC-DAD对核桃花中槲皮素与山奈酚进行了
含量测定，李少泓等〔7〕采用紫外分光度法对兰州的
核桃花总黄酮进行了含量测定。因核桃花的提取
物具有较深的颜色，对测定结果影响较大，故本实
验采用差示分光光度法消除背景吸收的干扰，测定
漾濞泡核桃花总黄酮含量，以期为漾濞泡核桃花的
进一步开发利用提供依据。
1 实验仪器与试剂
1.1 仪器 TU-1901双光束紫外可见分光光度计
（北京普析通用仪器有限责任公司）；CP224C电子
天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；电子恒温水浴锅
（上海科析试验仪器厂）；超声波清洁器（宁波新芝
生物科技股份有限公司）。
1.2 药品与试剂 芦丁（中国药品生物制品检定研
究院，批号：080-9303）；乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、
硝酸铝等试剂均为分析纯；漾濞泡核桃花2013年4
月采于漾濞县平坡镇（由大理大学药学与化学学院
杨月娥老师鉴定为 Juglans sigillata Dode.的花），样
品编号为1#~6#，将核桃花置阴凉通风的地方自然风
干，粉碎备用。
2 实验方法和结果
2.1 溶液制备
2.1.1 芦丁对照品溶液的制备 精密称取在40 ℃
下干燥至恒重的芦丁对照品5.5 mg置于25 mL量瓶
中加入适量50%乙醇溶解，定容，摇匀，得0.22 mg/mL
的芦丁对照品溶液。
2.1.2 样品溶液的制备 精密称取 1#样品 0.5 g，
置 100 mL的烧瓶中，加入 50%的乙醇溶液 10 mL，
加热回流 3次，每次 40 min，过滤，合并滤液后定容
至50 mL，即得样品溶液。
差示分光光度法测定漾濞泡核桃花中的总黄酮含量
苏 敏，杨盛春，周 萍*
（大理大学药学与化学学院，云南大理 671000）
［摘要］目的：优选漾濞泡核桃花总黄酮的提取工艺，建立漾濞泡核桃花总黄酮含量测定的方法。方法：在单因素考察基础上，
用正交试验法对漾濞泡核桃花总黄酮的提取工艺优选，并以芦丁为对照品，采用差示分光光度法测漾濞泡核桃花总黄酮含
量。结果：漾濞泡核桃花总黄酮最佳提取工艺为：提取溶剂50%乙醇，料液比1：20，沸水加热回流3次，每次40 min；漾濞泡核
桃花总黄酮浓度在11~77 μg/mL范围内与吸光度成良好线性关系（r=0.999 3），平均加样回收率为99.7%，RSD为1.94%，总黄酮
的含量为2.16%~2.82%。结论：此方法简单、准确、稳定、可靠，可作为漾濞泡核桃花总黄酮的含量测定。
［关键词］漾濞泡核桃花；差示分光光度法；总黄酮；含量测定
［中图分类号］R284 ［文献标志码］A ［文章编号］2096-2266（2016）08-0015-05
［基金项目］大理大学应用开发研究基金资助项目（KYYY201401）
［收稿日期］2015-11-11 ［修回日期］2016-03-28
［作者简介］苏敏，硕士研究生，主要从事药物分析研究 .
*通信作者：周萍，教授 .
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大理大学学报总第8期 医学
2.2 测定波长的选择 精密移取“2.1.1”对照品溶
液1 mL和“2.1.2”样品溶液2 mL，分别置于10 mL量
瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.2 mL摇匀，放置6 min，
加入 10%硝酸铝溶液 0.2 mL摇匀，放置 6 min，再加
入4%氢氧化钠1 mL，摇匀放置15 min后定容，采用
差示分光光度法在400~800 nm进行光谱扫描，结果
表明，芦丁对照品和样品在510 nm处均有最大吸收，
与文献〔7-8〕报道一致，故选择510 nm作为测定波长。
2.3 供试品溶液制备方法的考察
2.3.1 提取方法的选择 取1#样品10份（编号1至
10号），每份约 0.5 g，精密称定，分别加入 40%乙醇
10 mL，其中第 1、2号浸泡 12 h后直接过滤，第 3、4
号浸泡 12 h后加热回流 40 min后过滤，第 5、6号直
接加热回流 40 min后过滤，第 7、8号直接超声 40
min后过滤，第 9、10号浸泡 12 h后超声 40 min后过
滤，均定容至50 mL。分别取各试液2 mL，于10 mL
量瓶中，按“2.2”方法显色，以各样品提取液作为空
白对照，在 510 nm波长处测定吸光度，计算黄酮提
取率。结果表明加热回流提取法的黄酮提取率均
大于超声提取法，浸泡12 h后加热回流与直接加热
回流 2种提取方法吸光度接近，故本实验采用直接
加热回流的方法。
2.3.2 料液比的选择 精密称取 1#样品 7份，每份
约 0.5 g，以 3：1、6：1、9：1、12：1、15：1、20：1、25：1
的料液比加入 40%的乙醇，在沸水浴中加热回流
40 min后过滤，滤液定容为 50 mL。分别取各试液
2 mL，于10 mL量瓶中，按“2.2”方法显色，以各样品
提取液作为空白对照，在 510 nm波长处测定吸光
度，计算黄酮提取率。见图1。结果表明，料液比为
20：1时总黄酮提取率最大，故本实验采用的最佳料
液比为20：1。
总
黄
酮
提
取
率
/%
料液比
图1 料液比对提取率的影响
2.3.3 提取时间的选择 精密称取 1#样品 5份，每
份约0.5 g，加入40%的乙醇10 mL，分别在沸水浴中
加热回流20、30、40、50、60 min后过滤，滤液定容为
50 mL。分别取各试液 2 mL，于 10 mL量瓶中，按
“2.2”方法显色，以各样品提取液作为空白对照，在
510 nm波长处测定吸光度，计算黄酮提取率。见图
2。结果表明，加热回流 40 min时总黄酮提取率较
大，故本实验采用的最佳提取时间为40 min。
时间/min
总
黄
酮
提
取
率
/%
图2 提取时间对提取率的影响
2.3.4 提取温度的选择 精密称取 1#样品 6份，每
份约 0.5 g，加入 40%的乙醇 10 mL，分别在 40、50、
60、70、80 ℃，沸水浴中加热回流 40 min后过滤，滤
液定容为 50 mL。分别取各试液 2 mL，于 10 mL量
瓶中，按“2.2”方法显色，以各样品提取液作为空白
对照，在 510 nm波长处测定吸光度，计算黄酮提取
率。见图3。结果表明，随温度的增加，总黄酮提取
率变大，沸水时最大，故本实验采用的最佳提取温
度为沸水。
总
黄
酮
提
取
率
/%
温度/℃
图3 提取温度对提取率的影响
2.3.5 乙醇浓度的选择 精密称取 1#样品 8份，每
份约 0.5 g，加入 20%、30%、40%、50%、60%、70%、
80%、90%的乙醇 10 mL，分别在沸水浴中加热回流
40 min后过滤，滤液定容为 50 mL。分别取各试液
2 mL，于10 mL量瓶中，按“2.2”方法显色，以各样品
提取液作为空白对照，在510 nm波长处测定吸光度，
16
总第8期 第1卷苏 敏，杨盛春，周 萍 差示分光光度法测定漾濞泡核桃花中的总黄酮含量
计算黄酮提取率。见图4。结果用40%乙醇总黄酮
的提取率最高，因此选择40%乙醇为提取溶剂。
总
黄
酮
提
取
率
/%
乙醇浓度/%
图4 乙醇浓度的选择
2.3.6 提取次数的考察 精密称取 1#样品 3份，每
份约0.5 g，加入40%的乙醇10 mL，分别在沸水浴中
加热回流1、2、3次，每次加热40 min后过滤，滤液定
容为50 mL。分别取各试液2 mL，于10 mL量瓶中，
按“2.2”方法显色，以各样品提取液作为空白对照，
在510 nm波长处测定吸光度，计算黄酮提取率。见
图5。结果表明，随着提取次数的增加，总黄酮提取
率变大，在提取3次的情况下总黄酮提取率最大，故
本实验采用的最佳提取次数为3次。
总
黄
酮
提
取
率
/%
次数/次
图5 提取次数对提取率的影响
单因素考察泡核桃花总黄酮的提取方法为加
入40%的乙醇料液比为1：20，在沸水浴中加热回流
3次，每次40 min。
2.4 正交试验考察 在单因素试验的基础上，对核
桃花总黄酮的提取工艺条件进行优化，选用L9（34）
正交试验，选择提取次数（A）、提取时间（B）、乙醇浓
度（C）、料液比（D）4个因素，每个因素选择 3个水
平。确立因素水平见表1，结果见表2。
正交试验结果表明，4种因素对提取结果影响
大小依次为提取次数>提取时间>料液比>乙醇浓
度。核桃花总黄酮提取最佳条件组合为A3B1C3D2，
即最佳条件为50%乙醇浓度，料液比为1：20，提取3
次，每次时间为40 min，总黄酮提取率最高。
表1 总黄酮提取正交因素及水平设计
水平
1
2
3
因素
A/次
1
2
3
B/min
40
50
60
C/%
30
40
50
D/(W：V)
1：15
1：20
1：25
表2 总黄酮提取的正交试验结果及分析
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
因素
A/次
1
1
1
2
2
2
3
3
3
1.743
1.453
1.950
0.497
B/min
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1.893
1.710
1.543
0.350
C/%
1
2
3
2
3
1
3
1
2
1.690
1.713
1.743
0.053
D/(W：V)
1
2
3
3
1
2
2
3
1
1.540
1.810
1.797
0.270
提取
率/%
1.72
1.83
1.68
1.71
1.30
1.35
2.25
2.00
1.60
表3 提取工艺方差分析
方差来源
A
B
D
C(误差)
离差平方和
0.373 5
0.183 9
0.139 0
0.004 3
自由度
2
2
2
2
均方
0.186 7
0.091 9
0.069 5
0.002 1
F值
87.08
42.88
32.40
1.0
P
<0.05
<0.05
<0.05
注：F0.05（2，2）=19.0。
2.5 验证性实验 精密称取 1#样品 3份，每份约
0.5 g，按正交试验的最佳条件提取样品溶液，按
“2.2”方法显色，以样品提取液作为空白对照，在
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大理大学学报总第8期 医学
510 nm波长处测定吸光度，计算黄酮提取率。结果
总黄酮提取率为2.19%，RSD为1.67%。
3 方法学考察
3.1 线性关系考察 精密吸取芦丁标准溶液 0.5、
1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL分别于 10 mL量瓶中，
按“2.2”方法显色，在 510 nm波长处测定吸光度。
以吸光度（Y）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，进行线
性回归分析，得到线性方程：Y=0.011 8 C+0.016，r=
0.999 3，结果表明芦丁在 11~77 μg/mL范围内线性
关系良好。
3.2 显色稳定性试验 取同一样品溶液 2 mL，于
10 mL量瓶中，按“2.2”方法显色，以样品提取液作
为空白对照，分别放置 0、0.5、1、2、4、6 h，在 510 nm
波长处测定吸光度，RSD为 1.56 %。实验结果表
明，样品6 h内显色稳定性良好。
3.3 样品稳定性试验 取放置时间为 0、0.5、1、2、
4、6 h的同一样品试液 2 mL，于 10 mL量瓶中，按
“2.2”方法显色，以样品提取液作为空白对照，在
510 nm波长处测定吸光度，RSD为2.19 %。实验结
果表明，样品在6 h内稳定性良好。
3.4 仪器精密度试验 取同一样品溶液 2 mL，平
行6份，于10 mL量瓶中，按“2.2”方法显色，以样品提
取液作为空白对照，在 510 nm波长处测定吸光度，
RSD为1.05 %。实验结果表明，仪器精密度良好。
3.5 重复性试验 精密称取 1#样品 6份，每份约
0.5 g，按“2.1.2”项下制备样品溶液，按“2.2”方法显
色，以样品提取液作为空白对照，在 510 nm波长处
测定吸光度，代入回归方程计算黄酮提取率。测得
核桃花中总黄酮平均含量为 2.24%，RSD为 2.05%，
实验结果表明，该方法的重复性良好。
3.6 加样回收率试验 取已知总黄酮含量（2.24 %）
的 1#样品约 0.25 g，平行 6份，精密称定，加入芦丁
标准溶液适量，按“2.1.2”项下制备样品溶液，按
“2.2”项下方法显色，以样品提取液作为空白对照，
在 510 nm波长处测定吸光度，计算加样回收率。
见表4。
表4 加样回收率试验
序号
1
2
3
4
5
6
称样量/g
0.250 1
0.250 4
0.249 8
0.250 7
0.250 1
0.250 0
样品含
量/mg
5.602
5.609
5.596
5.616
5.602
5.600
加入量/mg
5.600
5.600
5.600
5.600
5.600
5.600
检测量/mg
11.21
11.10
11.14
11.06
11.33
11.27
回收率/%
100.1
98.1
99.0
97.2
102.3
101.3
平均回收
率/%
99.7
RSD/%
1.94
3.7 样品含量测定 精密称取 1#~6#核桃花粉末各
3份，每份约0.5 g。按“2.1.2”项下制备样品溶液，按
“2.2”方法显色，以样品提取液作为空白对照，在
510 nm波长处测定吸光度，代入回归方程计算黄酮
提取率。见表5。
表5 样品含量测定
样品号
含量/%
1#
2.24
2#
2.82
3#
2.72
4#
2.16
5#
2.51
6#
2.28
4 讨论
目前已有文献报道核桃花内含有大量天然黑
色素，且该色素易溶于水和乙醇〔9〕，李少泓等〔7〕采
用紫外分光度法对核桃花中总黄酮进行含量测
定，但并未考虑核桃花提取液中色素对实验结果
的影响。另有文献报道采用比色法测总黄酮含量
时会产生较大误差〔10-11〕。预实验中，扫描未显色样
品提取液，在 510 nm处吸光度大于 0.2，测样品溶
液时，以空白试剂为参比测得的吸光度比以未显
色样品溶液为参比时的吸光度大。由吸光度过高
或过低引起较大测量误差时采用差示分光光度法
能提高其精密度、准确度、灵敏度，故本实验采用
差示分光光度法。以 NaNO2-Al（NO3）3- NaOH显
色，并以等量未显色的提取液作为参比，在 510 nm
处测定漾濞泡核桃花中的总黄酮含量，消除背景吸
收的干扰。该方法操作简单，有良好的稳定性、重复
性和准确度。
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总第8期 第1卷苏 敏，杨盛春，周 萍 差示分光光度法测定漾濞泡核桃花中的总黄酮含量
［参考文献］
〔1〕张海珠，邓水来，张海，等 .泡核桃多糖中单糖的组分及
测定〔J〕.中成药，2012，12（34）：12-14.
〔2〕赵家全 .影响漾濞泡核桃树生长结实的主要因素及应对
措施〔J〕.林业调查规划，2013，38（3）：73-77.
〔3〕陆斌，宁德鲁，暴江山 .核桃花药用价值与加工技术研究
发展〔J〕.中国果蔬，2006（4）：41-43.
〔4〕付苗苗 .核桃的营养保健功能及药用价值研究进展〔J〕.中
国食物与营养，2014，20（10）：74-76.
〔5〕贾忠，张培芬，陶保全，等 .核桃花的黄酮类化学成分研
究〔J〕.中国药学杂志，2009，4（44）：496-497.
〔6〕赵磊，李阳，侯嘉，等 .核桃花中槲皮素与山奈酚含量的
高效液相色谱-二极管阵列检测器法测定〔J〕.时珍国医
国药，2011，22（5）：1257-1259.
〔7〕李少泓 .核桃花中总黄酮的含量测定研究〔J〕.中华中医
学刊，2012，30（4）：915-917.
〔8〕郑佳，卢先明，易超宇，等 .金盏花总黄酮提取工艺研究
及含量测定〔J〕.中药研究，2014，37（3）：1-7.
〔9〕余晓焕，高虹，黎碧娜，等 .核桃花天然色素提取工艺的
研究〔J〕.江苏调味副食品，2007，24（1）：16-18.
〔10〕陈英红，张晓荧，罗浩铭，等 .苦碟子提取物中总黄酮含
量测定方法的探讨〔J〕.时珍国医国药，2012，23（2）：
313-315.
〔11〕池玉梅，于生，郭戎，等 .差示分光光度法测定猫爪草中
总黄酮的含量〔J〕.江苏中成药，2007，39（12）：56-58.
The Determination of the Content of Total Flavonoids in Juglans sigillata Dode by
Differential Spectrophotometry
Su Min，Yang Shengchun，Zhou Ping*
（College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）
〔Abstract〕Objective: To optimize extraction technology of total flavonoids from the flower of Juglans sigillata Dode and establish its
content determination method. Methods: On the basis of single factor test，orthogonal experiment was used to to optimize extraction
technology of total flavonoids from the flower of Juglans sigillata Dode. With Rutin as the reference substance, differential
spectrophotometry method was adopted to determine the content of total flavonids of the flower of Juglans sigillata Dode. Results: The
optimum extraction conditions were described as follows: ethanol volume scores 50%, the solid / liquid ratio 1：20, 3 times of heating
reflux，and the time duration for each extraction was 40 min. Total flavonoids of the flower of Juglans sigillata Dode showed good linear
relationship in the range of 11~77 μg/mL（r = 0.999 3），the average recovery was 99.7%，RSD=1.94%. The content of total flavonoids
was 2.24% . Conclusion: The method was simple，accurate，stable and reliable, and could be used to measure the content of total
flavones of the flower of Juglans sigillata Dode.
〔Key words〕flower of Juglans sigillata Dode；differential spectrophotometry；total flavonoids；content determination
（责任编辑 李 杨）
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