全 文 ：第 35 卷第 10 期 西 南 大 学 学 报 (自然科学版) 2013年10月
Vol. 35 No. 10 Journal of Southwest University (Natural Science Edition) Oct. 2013
文章编号:1673-9868(2013)10-0050-06
单倍体川桑(M. notablis Schneid)
愈伤组织诱导及丛生芽分化培养
①
王茜龄， 余亚圣， 何宁佳，
赵爱春， 曾其伟， 余茂德
家蚕基因生物学国家重点实验室，西南大学 生物技术学院，重庆 400715
摘要:川桑(M. notabilis Schneid.)是分布在四川、云南等山区的珍稀濒危单种桑树，资源稀少，单倍体，是桑树研
究的重要材料． 实验的目的是通过植物组织培养手段培养川桑离体再生植株，保存川桑种质资源及展开桑树的基
础研究． 实验内容包括了选择外植体、优化培养基成分和探讨生长调节物质对川桑离体再生的影响． 结果表明:茎
段容易被污染、叶片只能诱导出愈伤组织、以腋芽作为外植体大大降低了外植体的污染率，并且较好地诱导出愈伤
组织和丛生芽;植物生长调节剂 TDZ、6-BA都能诱导出愈伤组织，但是只有 6-BA的培养基中没有丛生芽的发生;
最适培养基为改良 MS + 6-BA2. 0 mg /L + IAA0. 02 mg /L + TDZ 0. 1 mg /L + AgNO35. 0 mg /L +蔗糖 30 g /L +琼脂 6. 8
g /L． 其愈伤组织诱导率为 90%，丛生芽诱导率为 85. 7% ． 这为后续生根研究奠定了基础．
关 键 词:川桑;外植体;愈伤组织;丛生芽;植物生长调节剂
中图分类号:S888 文献标志码:A
川桑(M. notabilis Schneid. )原产于我国，分布在四川、云南等山区，在桑属植物分类学上为一个独立的
种，经体细胞染色体鉴定，川桑的染色体数为 14 条，为通常二倍体桑染色体数目的一半，被认为是自然单
倍体［1］． 由于单倍体中每种基因只有一个等位基因，所以在单倍体内的每个基因，无论是显性的或隐性的，
都要表现出对性状发育的作用． 因此，自然单倍体川桑是研究基因性质和功能的良好材料． 余茂德，等［2］
对川桑染色体倍数性、育性、枝条解剖结构、叶片过氧化物酶同功酶和 DNA 随机扩增多态型(ＲAPD)等方
面进行了研究，推测川桑可能是桑属(Morus. L)中分化最早的桑种． 2010 年由西南大学组织实施了自然单
倍体川桑的基因组测序，这将极大地推进桑树学科的发展，促进川桑资源的研究和利用． 但它结构奇特，
与二倍体桑存在严重的不亲和性，嫁接成活率极低，川桑种质资源的引进和保存有较大的困难． 因此，川
桑离体组织培养再生植株的研究对特殊川桑种质资源的保存、通过染色体加倍培育纯系以及桑树的功能基
因组研究具有重要意义． 桑树组织培养的的研究有较多的报道，一些基因型桑树品种获得了再生植株，但
主要集中在 M. alba，M. indica，而具有不同遗传特异性的品种在相同条件下的反应不同［3］． 川桑
① 收稿日期:2012-11-19
基金项目:国家自然科学青年基金资助项目(31101769) ;中央高校基本业务费专项资助项目(XDJK2011C033)．
作者简介:王茜龄(1978-) ，女，重庆垫江人，副教授，博士，主要从事桑树遗传育种与生物技术方面的研究．
通信作者:余茂德，教授，博导．
(M. notabilis Schneid. )这个独立桑种的组织培养至今未见报道． 因此，本文拟建立适合单倍体川桑离体再
生的体系，为解决川桑资源匮乏，引种难的问题提供理论和技术基础．
1 材料与方法
1. 1 材 料
2011 年 8 月、11 月取自于四川雅安市荥经县烟竹乡马尔槽山，其生理年龄距今至少几百年．
1. 2 方 法
1. 2. 1 外植体处理与消毒
将 30 ～ 40 cm的川桑茎段，剪去叶片，用 75%的酒精棉球擦拭冬芽的周围，用剪刀剪下带一个腋芽的
茎段或者用镊子拨开腋芽鳞片(叶片还未脱落，腋芽已被多层鳞片覆盖) ，切割腋芽和腋芽幼叶，用双蒸水
冲洗表面以后转入灭菌的三角瓶中，在超净工作台中用 75%的酒精浸泡 8 ～ 10 s，无菌水清洗 2 次后倒入
0. 1%的氯化汞消毒 7 min，无菌水清洗 5 次． 最后用灭过菌的滤纸吸干水分，接种于预先配好的培养基中
进行培养．
1. 2. 2 基本培养基和培养条件
基本培养基是 MS培养基，附加赤霉素 GA30. 5 mg /L + 30 g /L蔗糖 +琼脂 6. 8 g /L，pH值调至 6. 0，
1. 01 kg /cm2(121 ℃)高压 18 min． 培养温度 25 ℃，培养箱中暗培养 1 周，转入光照培养，光照强度为
50 μmol /(m2·s) ;光期 14 h，暗期 10 h，室内相对湿度保持在 50% ～ 70% ．
1. 2. 3 外植体诱导丛生芽的实验设计
以带一个腋芽的茎段、腋芽叶片、腋芽为外植体，分别接种在适合茎段、叶片、腋芽的培养基中培养，
观察外植体的生长状态．
1. 2. 4 不同的消毒方式抑制茎段感染
借鉴张祖荣［4］的方法，采用了百菌清、乙醇、氯化汞、次氯酸钠、洗衣粉等消毒剂，4 种组合对茎段进
行消毒，一周以后观察统计污染的情况．
1. 2. 5 愈伤组织诱导的实验方案
1 )主要从 MS基本培养的 Ca2 +、肌醇和烟酸含量进行改良;
2)添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2 g /L;
3)6-BA的浓度为 1. 0 mg /L、3. 0 mg /L;
4)用人工合成的生长调节物质 N-苯基-N＇-1，2，3-噻二唑-5-脲(TDZ)代替细胞分裂素 6-BA，浓度为
2. 0 mg /L;
5)添加生长素 IAA，2，4-D． 设计的培养基:① 改良 MS +6-BA3. 0 mg /L + GA30. 5 mg /L +蔗糖30 g /L
+琼脂 6. 8 g /L;② ① + PVP2 g /L;③ 改良 MS + TDZ2. 0 mg /L + GA30. 5 mg /L + 蔗糖 30 g /L + 琼脂
6. 8 g /L;④ MS +6-BA3. 0 mg /L + IAA0. 3 mg /L + 2，4-D 0. 1 mg /L + PVP1. 0 g /L + GA30. 5 mg /L + AgNO3
2. 0 mg /L蔗糖 + 30 g /L +琼脂 6. 8 g /L．
改良 MS中大量元素 CaCl2 改变为葡萄糖酸钙，有机物质量浓度肌醇为 100 mg /L，烟酸 1. 0 mg /L，盐
酸吡哆醇 1. 0 mg /L，盐酸硫胺素 10 mg /L，甘氨酸 2. 0 mg /L，叶酸 0. 5 mg /L．
1. 2. 6 丛生芽诱导的实验方案
以改良 MS 为基本培养基，添加不同浓度的生长调节物质，配制的培养基为:⑤ 改良 MS + 6-BA
3. 0 mg /L + GA3 0. 5 mg /L +蔗糖 30 g /L +琼脂 6. 8 g /L;⑥ 改良 MS +6-BA6. 0 mg /L + GA30. 5 mg /L +蔗糖
30 g /L +琼脂 6. 8 g /L;⑦ MS +6-BA 2. 0 mg /L + IAA 0. 02 mg /L + TDZ 0. 1 mg /L + AgNO3 5 mg /L +蔗糖 30 g /
15第 10 期 王茜龄，等:单倍体川桑(M. notablis Schneid)愈伤组织诱导及丛生芽分化培养
L +琼脂 6. 8 g /L;⑧ MS +6-BA2. 0 mg /L + IAA0. 02 mg /L + TDZ 0. 5 mg /L + AgNO35 mg /L +蔗糖 30 g /L +琼
脂 6. 8 g /L;⑨ 改良MS +6-BA 2. 0 mg /L + IAA 0. 02 mg /L + TDZ 0. 1 mg /L + AgNO3 5 mg /L +蔗糖 30 g /L +琼
脂 6. 8 g /L．
2 结果与分析
2. 1 外植体诱导愈伤组织和丛生芽
将川桑茎段、腋芽和腋芽幼叶接入培养基中，5 d后茎段感染非常严重，感染率达 95%，腋芽和腋芽幼
叶都有愈伤组织产生． 如图 1，冬芽愈伤组织生长旺盛，感染少，愈伤组织诱导率 79. 7%以上;腋芽幼叶的
愈伤组织较少，但诱导率还是较高，为 75. 7% ． 随着时间的延长，愈伤组织逐渐膨大，但是愈伤组织不能
直接分化成丛生芽．
A. 茎段感染严重;B. 腋芽愈伤组织生长旺盛;C. 幼叶愈伤组织少;D. 腋芽愈伤组织膨大褐化;E. 幼叶愈伤组织膨大褐化．
图 1 茎段、腋芽，腋芽幼叶诱导的愈伤组织
2. 2 消毒方式抑制茎段污染
茎段利用常规的消毒方式，感染非常严重． 本次实验设计了 4 种消毒方式及 1 周以后调查实验结果如
表 1 所示:用百菌清、洗衣粉、次氯酸钠预处理以后再用 HgCl2 消毒对茎段的污染都有一定的抑制作用，但
是随着消毒的程序和时间增加，死亡率也增加． 特别是 10%的次氯酸钠，0. 1%吐温和 0. 1% HgCl2 组合消
毒，接种 1 周后基本全部死亡． 试验结果表明，用 1 /800 百菌清 20 h + 75%乙醇 1 min + 0. 1% HgCl28 min
能有效抑制茎段污染，并能使茎段腋芽再生长．
表 1 消毒方式对茎段污染的影响
消毒方式
接种茎段
/个
存活数
死亡数
/个
死亡率
/%
污染率
/%
1 /800 百菌清 20 h + 75% 乙醇 1 min + 0. 1% HgCl2 8 min 65 18 13 20 52. 3
洗衣粉 0. 4%15 min +6%NaClO 2 0 min +0. 1% HgCl2 5 min 20 4 9 45 35
10% NaClO，0. 1%吐温 20 min + 0. 1% HgCl2 5 min 28 0 27 96. 4 3. 6
洗衣粉 0. 4%15 min + 75% 乙醇 1 min + HgCl2 8 min 64 5 42 65. 6 26. 5
2. 3 培养基对川桑诱导再生的影响
植物生长调节物质 6-BA、TDZ都能较好的诱导出愈伤组织，诱导率能达到 100% ． 在培养基③中，随
25 西南大学学报(自然科学版) http:/ / xbbjb. swu. cn 第 35 卷
着时间的延长，愈伤组织褐化更加严重． 添加聚乙烯吡咯烷酮 2 g /L 没有抑制愈伤组织褐化，腋芽和叶片
的愈伤组织诱导率都有不同程度下降． 改良的 MS和 TDZ在川桑愈伤组织诱导中起着重要的作用． 在培养
基④中，MS培养基不变，添加了 6-BA、IAA、2，4-D、同时添加了聚乙烯吡咯烷酮 2 g /L，其愈伤组织诱导
率最低，腋芽的愈伤组织诱导率为 23. 8%，腋芽幼叶的愈伤组织诱导率为 45. 8% ．
表 2 培养基对川桑愈伤组织诱导的影响
培养基的种类
腋芽
/个
愈伤组织
愈伤组织诱导率
/%
叶
/片
愈伤组织
愈伤组织诱导率
/%
① 20 20 100 9 9 100
② 21 20 95. 2 21 12 57. 1
③ 7 7 100 18 18 100
④ 21 5 23. 8 24 11 45. 8
2. 4 川桑丛生芽的诱导
接种 1 个月后的实验结果如表 3 和图 2，川桑腋芽在培养基⑨中明显比其它培养中生长良好，在切
口处有愈伤组织，但愈伤组织的量较少，叶片展开快，长势非常好，经过 2 个月的培养，80%的腋芽外
植体都诱导出了丛生芽． 结果表明，6-BA 和 TDZ 都能诱导出愈伤组织，愈伤组织生长旺盛． 如图 2 所
示，生长调节物质只有 6-BA的情况下，浓度过高，抑制外植体的生长，愈伤组织的褐化也更加严重． 添
加 IAA，抑制了愈伤组织的生长，但是有助于外植体的生长． TDZ 的浓度在 0. 1 ～ 0. 5 mg /L 范围内，对
川桑外植体没有明显的影响，从培养基④与⑨的实验结果表明，2，4-D抑制了腋芽外植体的分化，MS培
养基的改良促进了腋芽外植体的生长和分化． 最佳培养基的组合为改良 MS + 6-BA2. 0 mg /L + IAA0. 02
mg /L + TDZ 0. 1 mg /L + AgNO35 mg /L +蔗糖 30 g /L +琼脂 6. 8 g /L．
表 3 培养基对丛生芽诱导的影响
培养基的种类
接种腋芽
/个
愈伤组织
/个
丛生芽
/个
⑤ 42 37 0
⑥ 40 36 0
⑦ 36 30 0
⑧ 42 36 3
⑨ 42 38 36
改良 MS +6-BA2. 0 mg /L + IAA0. 02 mg /L + TDZ 0. 1 mg /L + AgNO3 5 mg /L +蔗糖 30 g /L +琼脂 6. 8 g /L．
图 2 ⑨培养基诱导的丛生芽
35第 10 期 王茜龄，等:单倍体川桑(M. notablis Schneid)愈伤组织诱导及丛生芽分化培养
3 结 语
植物生长调节物质参与器官的分化调节，6-BA能够促进芽的分化，侧芽的萌发［5 － 6］，刘明辉等［7］在
对桑树腋芽的离体培养中发现细胞分裂素 BA可能是桑树腋芽萌发的必需物质，本人在前期桑腋芽离体
培养中发现，在不添加生长调节剂的培养基中，桑树冬芽叶片略为展开后就不再生长． 谢寅峰等［8］培养
青钱柳茎段时也发现不添加任何生长调节物质的腋芽萌发率很低(25%以下)． 因此本文采用 6-BA 为最
基本的植物生长调节剂，只有 6-BA的情况下，无论浓度高低，腋芽和腋芽幼叶外植体只能诱导出愈伤
组织，添加生长素 IAA和 2，4-D以后愈伤组织的生长量减少，腋芽外植体生长状况差． TDZ 是人工合成
的苯基脲衍生物之一，具有很高的细胞分裂活性，具有植物生长素和细胞分裂素的双重功能，在植物组
织培养中得到广泛应用［9 － 12］． 桑树组织培养中，据文献报道，Somika(2001)研究了 TDZ 对桑和对桑树
子叶、胚轴、叶片、根及叶柄的分化影响;黄艳红(2003)研究表明 TDZ 对桑树叶柄，幼茎，子叶愈伤组
织的诱导有促进作用;笔者 2011 年开始使用 TDZ诱导桑树冬芽离体再生植株，实验表明 TDZ 能促进冬
芽再生． 本实验结果也表明，TDZ 对单倍体川桑的愈伤组织和丛生芽的再生都有促进作用． 但是只有
TDZ的情况下，愈伤组织生长旺盛，难以分化出丛生芽． 单倍体川桑的丛生芽来自腋芽的内部，而不是
愈伤组织细胞分化而来的． 初步获得单倍体川桑腋芽外植体离体再生丛生芽的适合培养基为改良 MS +
6-BA 2. 0 mg /L + IAA 0. 02 mg /L + TDZ 0. 1 mg /L + AgNO3 5 mg /L +蔗糖 30 g /L +琼脂 6. 8 g /L． MS培养
基已经被证明是最适合桑树组织培养的基本培养基，但是氯离子含量较高，有些“忌氯植物”对氯离子
非常敏感，当吸收量达到一定程度后，就会影响植物的产量和品质． 本实验表明改良 MS 对桑树的腋芽
离体再生也有促进作用，说明了桑树也可能是“忌氯植物”． 改良的 MS 主要是减少了氯离子，增加了一
些有机物的含量．
本实验只对川桑诱导出了愈伤组织和丛生芽，诱导再生植株还存在着一些问题:
1)川桑生根困难，林寿康(1987)在培养桑树花药再生单倍体植株中，采用了 3 种方法进行根系诱导，
发根率达到了 95% ． 本试验中也引用的这些方法，除此之外，还试验了 B5，White等培养基，但未能诱导成
功;
2)川桑取材困难，每次取材要花 3 d时间，很难保证外植体新鲜;
3)川桑资源稀缺，本试验第一次以单倍体野生桑资源为材料，由于资源稀缺，一次不能进行大量的试
验． 所以本文对川桑的愈伤组织和丛生芽诱导有了初步的实验结果，为川桑的离体再生植株及基础研究奠
定了基础，但川桑根系的再生还需进一步探索和试验．
参考文献:
［1］ 余茂德． 川桑(M. notabilis C． k． Schn)的细胞学研究［J］． 蚕学通讯，1988(2) :21 － 22．
［2］ 余茂德，向仲怀，冯丽春，等． 自然单倍体川桑的发现与研究［J］． 蚕业科学，1996，22(2) :67 － 71．
［3］ 曹 伟，刘 佳，由香玲，等． 桑树组织培养研究进展［J］． 森林工程，2011，27(3) :1 － 4．
［4］ 张祖荣． 贝利氏相思的组织培养和快速繁殖［J］． 西南大学学报:自然科学版，2007，29(3) :86 － 90．
［5］ SONG J T，CHOI J N，SONG S I，et al． Identification of a Potexvirus in Korea Galic Plants［J］． AgricuIturaI Chemistry and
BiotechnoIogy，1995，38(1) :55 － 62．
［6］ NAIK S K，PATTNAIK S，CHAND P K． In Vitro Propagation of Pomegranate (Punica granatum L. cv. Ganesh)Through Axil-
lary Shoot Proliferation from Nodal Segments of Mature Tree［J］． Scientia Horticulturae 1999，79:175 － 183．
［7］ 刘明辉，王国忠，徐家萍． 桑树冬芽组织培养品种效应研究［J］． 中国蚕业，2003，24(1) :19 － 20．
［8］ 谢寅峰，张志敏，尚旭岚，等． 青钱柳茎段腋芽萌发和丛生芽增殖［J］． 林业科学，2011，47(1) :50 － 56．
45 西南大学学报(自然科学版) http:/ / xbbjb. swu. cn 第 35 卷
［9］ SINGH M，JAISWAL U，JAISWAL V S． Thidiazuron-Induced in Vitro Flowering in Dendrocalamus Strictus Nees［J］． Curr
Sci，2000，79(11) :1529 – 1530．
［10］ KIM L S，LEE C H，LEE G P． 6-Benzyladenine and Thidiazuron Induced Specific Genes in Organogenesis of‘Whangkeum-
bae’Pear (Pyruspyrifolia) ［J］． Acta Hort，2004，653:210 – 229．
［11］ SOMIKA B，ANTITA K，PAＲAMJIT K． TDZ-Mediated Differentiation in Commercially Valuable Indian Mulberry［J］． Morus
indica Cultivars K2 and DD，Plant Biotechnology，2001，18(1) :61 － 65．
［12］黄艳红，牟志美，樊金会，等． 噻二唑苯基脲对桑树愈伤组织诱导的影响［J］． 蚕业科学，2006，32(1) :103 － 105．
［13］林寿康，计东风，秦 俊． 桑树花药培养获得单培体植株［J］． 中国科学:B辑，1987(3)∶ 280 － 287．
Callus Induction and Multiple Shoot Differentiation
of Haploid Morus notablis Schneid
WANG Xi-ling， YU Ya-sheng， HE Ning-jia，
ZHAO Ai-chun， ZENG Qi-wei， YU Mao-de
State Key Laboratory of Silksorm Genome Biology，School of Biotechnology，Southwest University，Chongqing 400716，Chuna
Abstract:Morus notabilis Schneid，a rare and endangered Morus species，is distributed in mountainous regions in
Yunnan and Sichuan． Being a haploid species，it is an important material for basic study of the genus Morus． The
present study was intended to establish an efficient tissue culture system for plantlet regeneration from M. notabilis
so as to maintain this valuable germplasm resource and do further study． The contents of the study included explant
selection，medium composition optimization and investigation of the effects of different plant growth regulators on
shoot regeneration． Of the explants studied，stem segments were prone to pollution，and leaves could produce calli
only． With winter axillary buds as explants，pollution rate was greatly reduced and calli and multiple shoots were
readily induced． Of the plant growth regulators studied，TDZ and 6-BA promoted callus induction，but multiple
shoots were not induced in media containing 6-BA only． The optimum medium was the modified MS supplemented
with 6-BA 2. 0 mg /L，IAA 0. 02 mg /L，TDZ 0. 1 mg /L，AgNO3 5 mg /L，sugar 30 g /L and agar 6. 8 g /L，the cal-
lus induction rate and the multiple bud induction rate on it being 90% and 86%，respectively．
Key words:Morus notabilis Schneid;explant;callus;multiple shoot;plant growth regulator
责任编辑 汤振金
55第 10 期 王茜龄，等:单倍体川桑(M. notablis Schneid)愈伤组织诱导及丛生芽分化培养