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匙羹藤多糖的酶法提取工艺研究



全 文 :匙羹藤[Gymnema sylvestre(Retz.)Schult]为萝藦科匙羹藤属
植物,分布于广西、广东、福建、台湾及云南等省区的荒野之地。
匙羹藤又称武靴藤、金刚藤、羊角藤,主要含有萜类、皂甙、果胶、
多肽、黄酮、多糖、生物碱等化学成分。有研究表明,匙羹藤叶提
取物具有降血脂、降血糖、抗龋齿、抑制肥胖和抑制甜味等作用,
可用来防治肥胖症和糖尿病[2],说明匙羹藤属于一种药食兼用植
物。从匙羹藤中可以分离出多种活性物质,已成功开发出药品、
功能性食品和保健品等系列产品;在印度、日本有关匙羹藤的开
发利用较多,并已经有口腔清新剂、口香糖、片剂、糖锭、各种保
健品及药剂等面市[3,4]。而目前对匙羹藤三萜皂甙类物质研究较
多,对其多糖的研究鲜有报道[5-9]。多糖是一重要的活性成分,许
多植物多糖具有降血糖、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤等多种活性,
具有重要的研究和开发价值。本研究采用纤维素酶辅助提取匙
羹藤多糖,探讨匙羹藤多糖提取的新工艺,以期为匙羹藤多糖的
提取提供新的途径,也为匙羹藤资源的充分开发利用提供理论
参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料及药品
匙羹藤叶采摘于广西岑溪市水汶镇野外荒山,自然风干,利
用万能粉碎机将其粉碎,过40目筛后备用。
主要药品有:葡萄糖(AR,上海化学试剂采购供应站);石油
醚(AR,广东光华科技股份有限公司);纤维素酶(5万U/g,江苏
锐阳生物科技有限公司);浓硫酸(AR,西陇化工股份有限公
司);乙醇(AR,广东光华科技股份有限公司);苯酚(AR,国药集
团化学试剂有限公司)等。
1.2 主要试验仪器
FA1004电子天平(上海瞬宇恒平科学仪器有限公司);FW-
100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);40目/吋
分样筛(上海上虞哨唫五四纱筛厂);HH-S电热恒温水浴锅(上
海博迅实业有限公司);HS-S 恒温水浴锅(国胜实验仪器有限公
司);722E可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);PHS-2C精
密PH计(上海虹益仪器仪表有限公司)等。
1.3 试验方法
1.3.1 匙羹藤多糖提取工艺流程
匙羹藤叶片→风干→粉碎→过40目筛(备用)→叶粉末→脱
脂→干燥→称重→加80%乙醇→调节pH→加酶→水浴→灭酶活
→抽滤→粗提液。
1.3.2 试验操作过程
称量经石油醚脱脂干燥后的匙羹藤叶粉末1.00g,按一定料
液比加入 80%的乙醇,搅拌后调节 pH值,加入一定量的纤维素
酶,置于预设定温度的恒温水浴锅中水浴酶解。而后升温至
100 ℃灭酶 3min,冷却后进行抽滤,量取滤液,测定匙羹藤粗提
液中多糖含量,并计算得率。
先进行单因素试验,选取纤维素酶浓度(%)、酶解时间
(min)、酶解温度(℃)、酶解pH值、料液比(w/v)影响条件作为具
体考察对象,以多糖得率为考评指标。各因素水平为:纤维素酶
浓度 0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%,酶解时间 30 min、60 min、90
min、120min、150min,酶解温度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃,
酶解pH值3.5、4.0、4.5、5.0、5.5,料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、
1∶30。在单因素基础上进行四因素三水平的正交试验。设三次
重复单因素实验。
1.3.3 指标测定方法
1.3.3.1 样品多糖含量测定方法
(1)葡萄糖标准曲线的绘制
精确称取干燥的葡萄糖 62.5mg,加蒸馏水定容至 250mL容
量瓶中,制成葡萄糖标准液。分别精确吸取葡萄糖标准液
0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL 置于 10mL 比色管中,然后
依次精确加入0.9mL、0.8mL、0.7mL、0.6mL、0.5mL蒸馏水,再各
加1mL 5%苯酚试剂,混匀,加浓硫酸定容后放置5min。置60 ℃
水浴中加热15min,冷却,空白对照以蒸馏水代替葡萄糖溶液,在
490nm波长处测定吸光度,以葡萄糖浓度(C)为横坐标,吸光度
(A)为纵坐标,制作标准曲线,得到葡萄糖浓度(C)与吸光度(A)
的曲线如图1。
y = 0.0911x + 0.0351
R2 = 0.9923
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15
葡萄糖浓度(?g/mL)



/A
图1 葡萄糖标准曲线
2014年10月
第10期(总第191期)
轻工科技
LIGHT INDUSTRY SCIENCE AND TECHNOLOGY 食品与生物
【第一作者】谢冬娣(1968-),女,广西人,副教授,研究方向:食品原料开发与加工。
匙羹藤多糖的酶法提取工艺研究
谢 冬 娣 ,张 丽
(贺州学院化学与生物工程学院,广西 贺州 542800)
【摘 要】 以匙羹藤叶为原料,研究采用纤维素酶法辅助匙羹藤中多糖的提取工艺。通过单因素和正交试验,探讨酶解温度、
pH值、料液比、酶用量对匙羹藤中多糖得率的影响,确定最佳提取工艺。结果表明:最佳酶解工艺条件为料液比为1:10、酶解时间为
90min、酶解pH值为4.5、纤维素酶浓度为0.6%,在此优化条件下,提取匙羹藤中多糖的得率为5.83%,粗提液中多糖含量为27.34%。
【关键词】 匙羹藤;多糖;纤维素酶;提取工艺
【中图分类号】 R285 【文献识别码】A 【文章编号】2095-3518(2014)10-19-03
19
(2)匙羹藤粗提液中多糖含量测定
将抽滤后的粗提液进行干燥,得到粗样,精确称取适量粗
样,置于 150mL 容量瓶中,加蒸馏水定容到刻度线。精确吸取
1mL,然后按照标准曲线绘制中的操作,测定吸光度,根据标准
曲线计算多糖的浓度,再计算得到样品多糖的含量。
2.3.3.2 多糖得率的计算
多糖得率用(1)式计算。
ω( )% = ( )A - 0.0351 ×BV0.0911m × 106 × 100% (1)
式中,A:吸光度;B:测定时多糖液的稀释倍数;V:样品溶液
的体积,mL;m:样品质量,g。
2 结果与分析
2.1 匙羹藤多糖提取单因素试验结果
2.1.1 纤维素酶浓度对多糖得率的影响
准确称取1.00g匙羹藤叶粉末原料放入100mL锥形瓶中,按
料液比为1∶20(g/mL)加入80%乙醇,选择不同的纤维素酶浓度
分别为0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%,在pH值4.5条件下于60℃
恒温水浴锅中进行酶解,水浴时间1h。按照试验方法1.3.1的提
取工艺流程进行最适纤维素酶浓度的确定试验。结果见图2。
-0.1
0.9
1.9
2.9
3.9
4.9
5.9
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
纤维素酶浓度(%)





%

图2 纤维素酶浓度对多糖得率的影响
由图2可以看出,不同的纤维素酶浓度对匙羹藤多糖得率均
有不同程度的影响。随纤维素酶浓度的增加,多糖得率呈现出
先增后减的趋势。在纤维素酶浓度为0.6%时得到的多糖得率最
高,为5.41%。之后酶浓度升高,多糖得率却下降,这种现象可能
是由于匙羹藤多糖中某些糖苷键被过量的纤维素酶分解所致。
故选择纤维素酶的最适加酶量为0.6%。
2.1.2 酶解时间对多糖得率的影响
在确定最适纤维素酶浓度的条件下,进一步探讨酶解时间
的确定,选择酶解时间分别为 30 min、60 min、90 min、120min、
150min,按照试验方法1.3.1的提取工艺流程进行最适酶解时间
的确定试验。结果见图3。
4.8
5
5.2
5.4
5.6
0 30 60 90 120 150 180
酶解时间(min)





%

图3 酶解时间对多糖得率的影响
由图3可以看出,随酶解时间的变化,多糖得率呈现上升趋
势,但到达 90min以后得率稍有下降,酶解 90min时提取多糖得
率可达 5.34%,然而酶解时间增加到 120min时得率反而降低到
5.12%。原因可能是在酶浓度一定时,随着反应时间不断延长,
酶量逐渐消耗;而乙醇量也会随时间延长而散失,且时间延长可
能会导致部分多糖降解为单糖,多糖的溶出也就逐渐下降。综
合考虑成本和提取效率等因素,故选取 90min作为最适酶解时
间。
2.1.3 酶解温度对多糖得率的影响
在确定最适纤维素酶浓度和酶解时间的条件下,进一步探
讨影响因素酶解温度的确定,选择温度分别为 40 ℃ 、50 ℃ 、
60 ℃、70 ℃、80 ℃进行水浴酶解,按照试验方法 1.3.1的提取工
艺流程进行最佳酶解温度的确定试验。结果见图4。
由图4可以看出,多糖得率随酶解温度的变化呈现先增后减
的变化趋势。当酶解温度为 60 ℃时得到最高得率为 5.36%,而
当酶解温度超过60 ℃时,随温度升高多糖得率逐渐降低。这是
因为温度对酶促反应的影响通常呈现双重效应,温度升高,酶的
活性增强,而温度过高,会使得酶活性下降并失去,从而降低多
糖得率,所以选取60℃为最适酶解温度。
4.9
5
5.1
5.2
5.3
5.4
30 40 50 60 70 80 90
酶解温度(℃)





%

图4 酶解温度对多糖得率的影响
2.1.4 酶解pH值对多糖得率的影响
在确定最适纤维素酶浓度、酶解时间和酶解温度的条件下,
进一步探讨影响因素酶解 pH值的确定,选择 pH值分别为 3.5、
4.0、4.5、5.0、5.5进行水浴酶解,按照试验方法 1.3.1的提取工艺
流程进行最适酶解pH值的确定试验。结果见图5。
4.8
5
5.2
5.4
5.6
5.8
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
酶解pH值





%

图5 酶解pH值对多糖得率的影响
由图5可知,提取刚开始时随着pH值的增大,匙羹藤多糖得
率逐渐升高,在pH值为4.0到4.5范围内得率上升较明显,当pH
值为 4.5时,多糖得率达到最大,为 5.39%,但随着 pH值的提高,
得率逐渐下降。这是因为多糖在碱性或弱碱性条件下容易析
出;又由于多糖类物质本来为酸性或弱酸性,当溶液碱性过大
时,酸碱中和,多糖溶出也就减少,导致多糖得率降低。因此,最
适提取的pH值为4.5。
2.1.5 料液比对多糖得率的影响
在确定最适纤维素酶浓度,酶解时间、酶解温度和酶解
pH 值的条件下,进一步探讨影响因素料液比的确定,选择料
液比分别为 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 进行水浴酶解,按
照试验方法 1.3.1 的提取工艺流程进行最适料液比的确定试
验。结果见图 6。
由图6可知,料液比对匙羹藤多糖提取的影响基本呈先升后
降的趋势。随着提取液的体积的增大,多糖得率呈上升趋势,当
料液比为1∶15时,多糖得率达到最高值5.50%,这是因为随着溶
剂增大多糖的溶出增加。随后料液比为1∶20之后,得率则有所
下降,这是因为酶促反应速率与底物浓度呈正比关系,随提取液
20
的体积加大,底物浓度降低,酶促反应速率下降,则多糖的溶出
减少。因此,确定最适料液比为1∶15。
图6 料液比对多糖得率的影响
2.2 正交试验结果
根据匙羹藤多糖提取单因素试验结果,选取影响得率较明
显的几个主要因素进行正交试验,即选择纤维素酶浓度、酶解
pH值、酶解时间、料液比四个因素,每个因素取三个水平,采用
L9(34)表做四因素三水平正交实验,正交试验因素水平表见表1,
正交试验结果及极差分析见表2。
从表2极差分析可得,影响匙羹藤多糖得率的各因素主次关
系为B>D>C>A,即料液比>酶解时间>酶解pH值>纤维素
酶浓度。最优组合水平为B1D2C2A2,即匙羹藤多糖的提取最佳
工艺组合条件为:料液比为1∶10,酶解时间为90min,酶解pH值
为4.5,纤维素酶浓度为0.6%。
表1 L9(34)正交试验因素水平表
水平
1
2
3
A纤维素酶浓度/(%)
0.4
0.6
0.8
B料液比/(w/v)
1:10
1:15
1:20
C酶解pH值
4.0
4.5
5.0
D酶解时间/(min)
60
90
120
表2 L9(34)正交试验结果与分析
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
k1
k2
k3
极差R
因素主次
优方案
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
16.30
16.58
16.34
5.43
5.53
5.45
0.10
B>D>C>A
B1D2C2A2
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
17.15
16.81
15.26
5.72
5.60
5.09
0.63
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
16.47
16.55
16.20
5.49
5.52
5.40
0.12
D
1
2
3
3
1
2
2
3
1
16.43
16.60
16.19
5.48
5.53
5.40
0.15
多糖得率/%
5.71
5.68
4.91
5.75
5.60
5.23
5.69
5.53
5.12
2.3 验证试验
正交试验所得的最佳工艺组合(料液比为1∶10,酶解时间为
90min,酶解 pH 值为 4.5,纤维素酶浓度为 0.6%),在正交表的 9
个试验组中未出现,所以对该组合进行验证试验,得到匙羹藤多
糖的得率为5.83%,高于正交试验任何一组的得率,这充分验证
了B1D2C2A2为纤维素酶法提取匙羹藤多糖的最优工艺组合。
3 结语
研究采用纤维素酶法对匙羹藤多糖的提取工艺进行了探
讨。试验对影响其多糖得率的相关因素进行了考察。通过单因
素试验和正交试验得出了影响匙羹藤多糖得率因素的主次顺序
为料液比>酶解时间>酶解pH值>纤维素酶浓度,确定了提取
匙羹藤中多糖的最佳工艺条件为:料液比为 1∶10,酶解时间为
90min,酶解pH值为4.5,纤维素酶浓度为0.6%,在该工艺条件下
匙羹藤多糖得率为5.83%,粗提液中多糖含量为27.34%。
多糖的提取常采用传统的热水浸提方法,不仅耗时耗量且
得率较低。本研究利用纤维素酶提取法,以匙羹藤叶子为原料
进行多糖的提取,避免了传统方法的不利因素,在提高多糖得率
条件下节约了成本,为匙羹藤多糖的提取提供了新的思路。
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