全 文 ：第28卷 第2期 肇 庆 学 院 学 报 Vol.28,No.2
2007年3月 JOURNALOFZHAOQINGUNIVERSITY Mar.2007
收稿日期:2006-09-15
基金项目:肇庆学院自然科学基金资助项目(0651)
作者简介:王瑛华(1979-),女,陕西商洛人,肇庆学院生物学系助教,硕士.
蓝猪耳叶片高频率再生体系的建立
王瑛华,陈 刚,陈雄伟
(肇庆学院 生物学系,广东 肇庆 526061)
蓝猪耳(ToreniafournieriLinden),是热带与亚热带地区一年生观赏花卉植物.由于其盛花期较
长,所以适于作为花坛和地被植物进行栽培,该物种在热带和亚热带地区花卉栽培中起着重要的
作用;但是,与其他花卉种类相比,蓝猪耳的花色、花型种类偏少,需要加强新品种的选育和品种改
良,以适应市场的需求[1].随着分子生物学技术的完善,分子育种技术在改良植物花色、花期、花型、
株型等方面取得重要进展[2],这也为蓝猪耳的品种选育和改良提供了一条有效途径,但这项技术的
应用必须建立在良好且稳定的再生体系和转化系统基础上,其中再生体系是首要前提.
国内已有关于蓝猪耳植株再生的报道,主要以茎段[3]、叶片[4]、根[5]为材料,但存在着效率不高、
程序烦琐的问题.笔者在实验中直接由叶片诱导不定芽,再诱导不定根,提高了蓝猪耳的再生频率,
缩短了培养时间,为蓝猪耳稳定、高效地转化奠定了实验基础.
1 材料与方法
植物材料选用蓝猪耳(ToreniafournieriLinden)的叶片.
具体实验方法和步骤如下:
1)不定芽诱导.将蓝猪耳叶片用 75%乙醇浸泡 30s,迅速转入 0.1%HgCl2中灭菌 5min,用无菌
水冲洗 5～6次,切成小块,分别接种于以 MS[6]为基本培养基,添加不同植物生长物质组合的分化
培养基(表 1)上,在如下条件进行培养:温度(25±1)℃,湿度 70%,光强 2000lx,光照 18h[d.14d
后观察外植体生长情况.
2)不定根诱导.将诱导形成的小苗,带有 1～2个茎节,接种于添加不同浓度 IBA的生根培养基
(表 2)上,7d后观察外植体生长情况;将诱导形成的小苗,带有 1～2个茎节,接种于 MS不同离子
浓度的生根培养基(表 3)上,7d后观察外植体生长情况.
3)移栽.选取健壮且根系发达的再生植株,洗去根部的琼脂,移栽到蛭石上,在 28℃,12h[d光
照下培养 2d后,移出室外栽培.
2 结果与分析
2.1 不同浓度植物生长物质组合对不定芽的分化及其生长状况的影响
随着培养时间的延长,接种于芽分化培养基上的小块叶片逐渐长大,并且向叶的内表面卷曲.
摘 要:以蓝猪耳(ToreniafournieriLinden)叶片为外植体,研究多种因素对蓝猪耳不定芽诱导及不定
根形成的影响,并进行了条件优化,建立了蓝猪耳叶片高频率离体再生体系.结果表明:芽诱导与基本培养
基成分关系不大,而与植物生长物质的浓度和种类有关,其中以 MS+6-BA2mg[L+NAA0.2mg[L状态最
佳;不定根形成受到植物生长物质和培养基中离子浓度的共同影响,最佳生根条件为 1
2
MS+IBA0.2mg[L.
关键词:蓝猪耳;植株再生;6-BA;NAA;IBA
中图分类号:Q945 文献标志码:A 文章编号:1009-8445(2007)02-0058-04
第2期 王瑛华等:蓝猪耳叶片高频率再生体系的建立
在 S1,S2及 S3上,第 9天可观察到肉眼可辨的芽点,14d后芽分化率均达到 90%以上.生长 20d
时,芽高度在 0.5～1.0cm之间.由表 1可以看出,当单独使用 6-BA进行诱导时,S1,S2及 S3的分
化率有一些差别;低浓度的 6-BA分化率反而高,但是重复性不高(标准差为 3.67).当使用 6-BA和
NAA组合进行诱导时,效果比单一使用 6-BA好,表现为分化芽频率较高,叶片较厚,叶色深绿,生
长 20d时,植株高度在 3～6cm(图 1);但当 NAA浓度过高时,分化芽的频率反而下降,如 S5和 S7.
这可能是由于高浓度植物生长物质间相互抑制造成的,因此,芽分化的最适宜培养基为 MS+6-BA
2mg>L+NAA0.2mg>L,分化频率达到 98%以上,且不定芽生长状态最佳.
表 1 不同浓度植物生长物质组合对分化芽的影响(第 14天)
2.2 不同培养基生根效果比较
2.2.1 IBA对生根的影响
将再生出的小苗接种到含有不同浓度 IBA的 MS和 1
2
MS培养基上,6～7d便有肉眼可辨的不
定根形成.第 7天时,当以 1
2
MS为基本培养基时,R2生根率比 R1生根率高 20%,并且 R2根的个
数为 5～10个,根长为 0.6～1.3cm.第 7天时,当以 MS为基本培养基时,R4,R5及 R6生根率较
高,R3的生根率只有 36.5%.其中 R4上形成的根细长,根的个数为 3～7个;R6上形成的根较多,
根的个数为 3～5个,但根粗短,形成较多毛状根;R5介于两者之间.长势方面,R2与 R4长势较
好,叶片舒展,植株较高,生长较快;R2无论生根情况及根长均优于以上各种培养基(图 2),第 7天
时生根率可达到 90%以上.通过比较可知,添加 IBA后,诱导生根时间明显缩短,生根率提高,根的
个数也随之增加.以上结果说明:1
2
MS生根效果优于 MS,添加 0.2mg>LIBA能显著提高生根率;
但若过量(≥0.5mg>L),则生根率反而下降.
表 2 IBA对生根的影响(第 7天)
2.2.2 MS培养基中离子浓度对生根的影响
在降低 MS培养基中离子浓度和降低蔗糖浓度的 R7～R11培养基上生根时间与 R1～R6相
同,均为 6～7d;但 R7～R11培养基上生根数量及根的长度都高于 R1～R6,而且诱导出的不定根长
度均超过 R1～R6(表 2).R10与 R11根系多具分支,R7与 R8根系多为单支.长势方面,R7～R10
逐渐下降,R7和 R8长势较好,R9较差并出现多种元素缺乏症状,R10上的试管苗几乎不生长,
并有逐渐枯萎的迹象.
1
2
1
2
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肇庆学院学报 第28卷
表 3 MS培养基中离子浓度对生根的影响(第 7天)
以上结果表明,MS培养基中离子浓度降至 1&3时,试管苗长势仍然较好;当降至 1&4时,虽然
能够生长,但长势较差;当 MS培养基中离子浓度降到 1&5及其以下时,试管苗便难以长期生长;而
当培养基中无 MS成分时,再生小苗虽然能够生根,但不能正常生长.据报道,在 1
4
MS培养基中培
养的外植体生根成苗后 3周左右便枯萎死亡[5],但在本实验中,1
4
MS培养基基本能够满足外植体
生长需求,不存在枯萎死亡现象.
将表 2和表 3比较后可以看出,培养基中低离子浓度能促进外植体根系的形成,但过低离子浓
度会造成植株整体生长不良,甚至枯萎、死亡.较低浓度的 IBA有利于根的形成,因此,培养基中较
低浓度 IBA对蓝猪耳生长有利.综上所述,不定根形成是受植物生长物质和培养基中离子浓度共同
决定的,最佳生根培养基为 1
2
MS+IBA0.2mg&L(图 2).
在生根培养基上生长 3周后,部分蓝猪耳再生植株有花芽的形成,1个月后开花 (图 3).
2.3 植株移栽
当小苗长至 6～8cm时,打开培养瓶的瓶盖,置于 25～30℃温室中炼苗 2d后,选取根系发达的
再生植株,洗掉琼脂,移栽到蛭石或营养土上,在 28℃,12h&d光照下培养,其成活率可达 90%以
上(图 4).
培养基为 MS+6-BA2mg&L+NAA0.2mg&L 培养基为 1
2
MS+IBA0.2mg&L
图 1 叶片不定芽的分化 图 2 根的分化
图 3 再生植株试管开花 图 4 移栽成活的再生植株
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3 讨 论
以上研究表明:不定芽诱导与基本培养基成分关系不密切,而与植物生长物质种类和培养基
中的离子浓度关系密切.不定芽诱导时,蓝猪耳叶片只能在切口部位形成不定芽,且多分布于叶片
正面,主要集中于叶脉附近.在花生幼叶不定芽诱导时也有相似结果[7].这一点在其他学者研究蓝
猪耳叶片诱导不定芽时未见详细描述[1,4].从表 1可以看出,单一植物生长物质 6-BA仅具有诱导不
定芽的作用,不能促进不定芽长高;而 6-BA和 NAA组合不仅能够诱导不定芽,而且可以促进不定
芽长高.不定芽诱导率最高可达 98.55%,明显高于其他学者的研究结果[1,4].
不定根诱导时添加外源植物生长物质(IBA),能够显著提高生根率、不定根及试管苗的生长速
度.由此可见,添加植物生长物质导致生根时间延迟的说法[1]不具有普遍性(如表 2),但过量的 IBA
(≥0.5mg6L)会抑制试管苗生长,造成不定根粗短,植株矮小,叶片卷曲.培养基中离子浓度对生
根诱导具有显著性影响 [8],表现为在 MS培养基上,较低的离子浓度能较好地促进不定根发生
(1
2
MS,1
3
MS),离子浓度过低(1
4
MS)虽然也能够诱导不定根发生,但不能为不定根的生长提供
充分营养.综合以上因素可知:蓝猪耳不定根再生是受到植物生长物质及培养基中离子浓度共同决
定的,最适宜培养基为 1
2
MS+IBA0.2mg6L.
在前人研究的基础上,笔者进一步优化了蓝猪耳的再生条件,建立了高频离体再生体系.这为
更好地进行蓝猪耳的遗传转化研究及利用分子生物学技术研究蓝猪耳受精过程提供了条件.
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EstablishmentofaHighFrequencyEficientRegeneration
System from LeafinToreniafournieriLinden
WANG Yinghua,CHEN Gang,CHEN Xiongwei
(DepartmentofBiology,ZhaoqingUniversity,GuangdongZhaoqing 525061,China)
Abstract:Inordertoestablishahighfrequencyregenerationsystem from leafinToreniafournieri
Linden,someconditionsaboutshootingandrootinghadbeencompared.Thehighestshootsdiferentiation
wasobtainedontheMSmedium supplementedwith6-BA2mg6LandNAA0.2mg6L.Theresultsshowed
thatregenerationofadventitiousrootswascontroledbyhormonesandsaltconcentration,and1
2
MS+IBA
0.2mg6Lwastheoptimumrootingmedium.
Keywords:ToreniafournieriLinden;6-BA;NAA;IBA;plantregeneration
(责任编辑:李 湘)
第2期 王瑛华等:蓝猪耳叶片高频率再生体系的建立 61