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红药提取物对小鼠免疫功能的调节作用
覃筱燕,黎荣昌,唐 丽,云妙英,严 莉
(中央民族大学生命与环境科学学院,北京 100081)
摘 要: 目的:研究红药提取物对小鼠免疫功能调节作用的影响。方法: 通过观察不同浓度的红药提取物 [ 2、10、
20g /( kg# d) ]对小鼠免疫功能的影响。结果: 与正常对照组相比, 10%、50%、100%浓度的红药提取物均能够明显增加
胸腺重量和脾脏重量 (P < 01 05~ 0101) ,具有对抗环磷酰胺 ( CP )所致白细胞数量减少作用 (P < 0105~ 0101), 能显著增
强小鼠的迟发型变态反应 (P < 01 01), 但 10% 红药提取物对巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素含量无显著影响,只有 50%、
100%的红药提取物才能增加巨噬细胞吞噬功能和促进溶血素的生成 (P < 0105 ~ 01 01)。结论:红药提取物对小鼠的非
特异性和特异性免疫功能均有明显的增强作用,但是对两者的增强作用存在着差异。
关键词: 红药提取物;免疫功能;碳粒廓清实验; 迟发型超敏反应;巨噬细胞
中图分类号: R28515 文献标识码: B 文章编号: 1000 - 1719( 2008) 06 - 0931 - 04
E ffec ts ofExtrac t ofChirita Longgangensis var. Hongyao on the Immunological Function inM ice
QIN X iao-yan, L IR ong-chang, TANG Li, YUN M iao - y ing, YAN L i
(Co llege o f L ife & Environmen ta l Science, Cen tra lUniversity for Na tionalities, B eijing 100081, Ch ina)
Abstrac t: Ob jective: S tudy the effect of ex trac t o fChirita longgangensis var. hongyao on m ice immune function. Methods: Ob-
serv ing the e ffect o f extract o fChir ita longgangensis var. hongyao o f differen t concen tra tions [ 2, 10, 20g /( kg# d) ] on immune
function. Results: Com pared w ith the contro l g roup, 10% , 50% , 100% of ex tract ofChir ita longgangensis var. hongyao we re a-
b le to increase the we igh t o f the sp leen and thym usw eight (P < 01 05~ 0101) significantly, confron ta tion w ith cyclopho spham ide
( CP) - induced decrease in the num be r of leukocy tes ro le (P < 0105~ 01 01), significan tly inc reased in m ice DTH (P < 0101),
Bu t 10% ex tract ofChir ita longgangensis var. hongyao had no significant effe ct on m acrophage phagocy to sis, and the con tent o f
serum hem o lysin, only 50% ~ 100% o f ex trac t o fCh irita longgangensis var. hongyao can increase m acrophage phagocytosis and
prom o te the fo rm ation of hem o lysin(P < 01 05 ~ 0101). Conclus ion: Extrac t ofCh irita longgangensis var. hongyao w as show n to
significan tly enhance the non - specific and spec ific imm une func tions. How eve r, for the enhancem en t o f bo th there a re still
diffe rences.
K eywords: e trac t o fChirita longgangensis va r. hongyao; imm uno log ica l function; carbon granules c lea rance tes;t delayed type
hypersensitiv ity( DTH ) ; m acrophage
收稿日期: 2008 - 02 - 09
基金项目:国家民委基金资助项目 ( 05ZY08 ) ;中央民族大学少数民族
医药中心 985资助项目 ( cun985 - 3 - 4) ;国家自然科学基金
资助项目 ( 30600849 )
作者简介:覃筱燕 ( 1968 - ), 女,广西南宁人, 副教授,硕士生导师,硕
士,从事基础医学教学和少数民族医药研究工作。
红药是苦苣苔科 Gesneriaceae唇柱苣苔属 Chirita
植物红药 ( Ch irita longgangensis W. T. Wang var.
hongyao S. Z. Huang)的全草, 为壮医常用药材。本种
系我国特有, 主产广西西南部。全草入药, 微甘, 涩,
平,具有温补养血、消肿止痛、活血补血的功效。临床
多用于月经不调,身体虚弱,贫血及跌打骨折 [1 - 4]。红
药作为我国特有植物,应用较为广泛,疗效确切。迄今
为止,红药化学成分的研究已有报道 [5], 但还未见任何
关于红药免疫药理作用的研究报道, 因此本课题选择
苦苣苔科唇柱苣苔属我国特有民族药材红药为研究对
象,拟对其在免疫药理作用方面进行初步的研究,以期
为进一步开发利用该药材奠定基础, 为红药的临床应
用,质量控制提供科学依据。
1 实验材料
11 1 实验药物及其制备
11 11 1 来源 鉴定 红药采自于广西南宁市武鸣县
甘圩乡石灰岩山上, 由广西中医院李飞主任医生鉴定
为苦苣苔科 G esne riaceae唇柱苣苔属 Chirita植物红药
( Ch ir ita longgangensisW. T. W ang var. hongyao S. Z.
Huang)的茎。
11 11 2 红药提取物的制备 取干燥的红药茎 5kg, 用
6倍量的 95%乙醇溶液加热回流 3h,再用 75%的乙醇
溶液加热回流提取 2次,每次 3h。合并提取物, 滤过,
滤液用旋转蒸发仪浓缩到 100% ( 1g提取物中含 1g生
药 ) ,冷藏保存备用。
11 2 实验动物
昆明种小鼠,雄性, 体重 ( 20 ? 2) g,由北京大学医
学部动物研究中心提供,普通鼠料常规喂养; 豚鼠、公
#931# 辽宁中医杂志 2008年第 35卷第 6期
DOI：10.13192/j.ljtcm.2008.06.134.qinxy.074
鸡,购自中国科学院动物所。
11 3 主要试剂及仪器
正常豚鼠血清 1B 10稀释液作补体来源:补体以
2~ 3只豚鼠血清混合, 用生理盐水配成 10% (即 1B
10) ; 环磷酰胺 ( CP)粉剂为上海第十二制药厂出产;
乙醇, 分析醇,由北京化学试剂公司出; 鸡红细胞悬液
按文献 [6 ]方法制备; 绵羊红细胞 ( SRBC, 20亿 /mL)
按文献 [9 ]方法制备; 都氏试剂: 碳酸氢钠 01 5g, 氰化
钾 01 025g,高铁氰化钾 01 1g,配制 500m l。 721分光光
度计为上海第三分析仪器厂出品。旋转蒸发仪, 上海
振捷实验设备有限公司; 数显恒温水浴锅 HH - 2, 国
华电器有限公司; SHZ -Ó 型循环水真空泵, 上海亚荣
生化仪器厂; EB -280M电子天平,日本岛津制作株式
会社制造;千分游标卡尺产于中国浙江。
2 实验方法
21 1 影响非特异性免疫功能的方法
21 11 1 胸腺指数和脾脏指数的测定 [6 - 8 ] 取 18~ 22g
健康小鼠 40只,随机分 4组,每组 10只。正常对照组
以生理盐水按 01 4mL /(只# d)量给小鼠灌胃, 每日 1
次,连续 15天; 药物组分 3组: 10%、50%、100%红药
提取物按 01 4mL /(只# d) 量给小鼠灌胃给药,每天 1
次 [相当于生药 2g /( kg# d)、10g /( kg# d)、20g /( kg#
d) ],连续 15天。于第 16天处死小鼠, 取出胸腺、脾
脏,称重, 结果分别以胸腺指数和脾脏指数表示 ( mg /
10g体重 )。另取两组健康小鼠, 其中一组每天灌胃
50%红药提取物, 连续 15天,在每 13天腹腔注射环磷
酰胺 60mg /kg 1次, 另一组不给予红药提取物灌胃, 只
在第 13天腹腔注射环磷酰胺 60mg /kg 1次, 于第 16
天处死小鼠,比较其胸腺指数和脾脏指数。
21 11 2 吞噬指数和吞噬活性的测定 [6, 8 - 9 ] 采用小鼠
碳粒廓清法测定吞噬指数和吞噬活性。小鼠分组、给药
同 21 11 1,于未次给药 1h后每只小鼠尾静脉注射生理盐
水稀释成 5倍的印度墨汁 01 1mL /10g(体重 ) ,注射 1m in
和 5m in后, 分别自眶后静脉丛取血 20LL, 放入存有
011%碳酸钠 2mL溶液的试管中,摇匀,以试剂空白管调
零点,在 680nm波长处测光密度 OD值。最后将小鼠颈
椎脱臼处死,分别称取肝、脾重量。按下式计算吞噬 (廓
清 )指数K或吞噬活性 (校正廓清指数 )A。
K =
logOD 1 - logOD 2
t1 - t2
A =
3
K @体重 /(肝重 +脾重 )
21 11 3 外周血白细胞总数的测定 小鼠 50只, 随机
分 5组, 每组 10只。正常对照组以生理盐水按
01 4mL /(只# d)量给小鼠灌胃,每日 1次, 连续 8天;
环磷酰胺 ( CP)组,按 30mg /( kg# d)剂量于第 2、3、5
天皮下注射;药物组分 3组:分别以 10%、50%、100%
红药提取物按 01 4mL /(只# d)剂量对小鼠灌胃给药,
每日 1次 [相当于生药 2、10、20g /( kg# d) ]连续 8天,
同时 3组药物组均于第 2、3、5天皮下注射 CP 30mg /
( kg# d)。于第 9天, 小鼠眼眶采血, 进行白细胞计
数。
21 2 影响细胞免疫功能的实验方法) ) ) 迟发型超敏
反应 (足趾增厚法 ) ( DTH ) [10 ]
小鼠分组, 给药同 2111 1。每只小鼠经腹腔注射
2% ( v /v, 用生理盐水配制 )压积绵羊红细胞 SRBC
( 2000r /m in, 10m in) 01 2mL,致敏后 4天,测量左右后足
趾部厚度,同一部位测量 3次, 取平均值。然后在测量
部位皮下注射 20% ( v /v,用生理盐水配制 )压积 SRBC
20LL,于注射后 24h测量左后足趾部厚度, 以注射前后
足趾厚度的差值 (足趾肿胀度 )来表示 DTH的程度。
21 3 影响体液免疫功能的实验方法 ) 血清溶血素的
测定
采用鸡红细胞作免疫原的溶血素测定法 [6, 11]。小
鼠分组,给药同 2111 1, 每鼠腹腔注射鸡红细胞悬液
01 2mL进行免疫,免疫后 7天,摘眼球取血,离心,取血
清用生理盐水稀释 100倍, 取稀释血清 1mL,与鸡红细
胞悬液 01 5mL、10%补体 015mL混合, 37e 恒温箱保
温 30m in后, 置 0e 冰箱中中止反应。离心, 取上清液
于 721分光光度计 540nm处比色,测录光密度 ( OD ),
另设不加血清的空白对照, 取其上清液作为比色时调
/ 00的基准。以光密度 ( OD )读数作为判定血清溶血
素的指标,比较各组的差异。
21 4 统计学处理
实验数据用 SPSS软件 S tuden t -Newman -Keu ls
进行方差分析。
3 实验结果
31 1 红药提取物对小鼠免疫器官重量的影响
见表 1。
表 1 胸腺指数和脾脏指数的测定 ( m g /10g体重 )
组别 n 胸腺指数 脾脏指数
生理盐水 10 35162 ? 6126 56174 ? 7151
10%红药提取物 10 43129 ? 7185* 63124 ? 10153*
50%红药提取物 10 53139 ? 9156* * 72146 ? 9163* *
100%红药提取物 10 55147 ? 9175* * 78119 ? 13152* *
环磷酰胺 ( CP) 10 20132 ? 3166* * 31182 ? 5139* *
50%红药提取物 + CP 10 33186 ? 8179v v 43193 ? 10175v v
注:与生理盐水组比较, * P < 0105* * P < 0101;与环磷酰胺 ( CP)
组比较, v v P < 0101。
由表 1可知, 红药提取物各浓度组均使小鼠胸腺
和脾脏的重量得到显著增加 ( P < 01 05, P < 0101), 并
且随着红药提取物浓度的增加, 小鼠胸腺重量和脾脏
重量的增加效应越强;环磷酰胺 ( CP)对小鼠胸腺重量
和脾脏重量有显著的减少作用, 但 50%红药提取物能
使环磷酰胺 ( CP)所致的小鼠胸腺重量和脾脏重量减
少的作用得到明显的改善。
31 2 红药提取物对小鼠巨噬细胞碳粒廓清率的影响
印度墨汁静脉注入小鼠后, 迅速被单核吞噬细胞
所清除,主要被定居在肝和脾的巨噬细胞所吞噬。若
将印度墨汁的量恒定,则从血流中消除的速率可反映
单核吞噬细胞的吞噬功能。
由表 2可知, 50%、100%的红药提取物能显著提
高小鼠巨噬细胞吞噬指数和吞噬活性 ( P < 01 05, P <
01 01) , 而 10%的红药提取物对小鼠巨噬细胞吞噬指
数和吞噬活性无显著影响 (P > 0105), 不具有统计学
的意义。
#932# 辽宁中医杂志 2008年第 35卷第 6期
表 2 吞噬指数和吞噬活性的测定
组别 n 吞噬指数 K 吞噬活性 a
生理盐水 10 010096 ? 010023 214622 ? 019563
10%红药提取物 10 010109 ? 010057 215674 ? 110263
50%红药提取物 10 010183 ? 010086* 310514 ? 115018*
100%红药提取物 10 010205 ? 010091* * 311691 ? 112027* *
注:与生理盐水组比较, * P < 0105* * P < 0101。
31 3 红药提取物对 CP降白细胞数量的作用
见表 3。
表 3 外周血白细胞计数 ( @ 103 /mm3 )
组别 n 白细胞数
生理盐水 10 6183 ? 1187
CP 10 3155 ? 0192
CP+ 10%红药提取物 10 3198 ? 0191v
CP+ 50%红药提取物 10 4176 ? 0195v v
CP+ 100%红药提取物 10 7187 ? 1143v v *
注:与 CP组比较, v P < 0105, v v P < 0101;与生理盐水组比较, *
P < 0105。
由表 3可知, 各浓度的红药提取物对 CP引起的
小鼠白细胞数量降低均起明显拮抗作用, 浓度越高,拮
抗效果越好。各药物组的小鼠白细胞数与 CP组相比
有显著差异 (P < 01 05, P < 01 01 ), 并且 100% 的红药
提取物组的小鼠白细胞数量升高且超过正常水平, 与
生理盐水组相比差异显著 (P < 01 05)。
31 4 红药提取物对小鼠迟发型超敏反应 ( DTH )的影响
见表 4。
表 4 红药对小鼠迟发型超敏反应 ( DTH )的影响
组别 n 足趾肿胀度
生理盐水 10 0133 ? 0108
10%红药提取物 10 0146 ? 0110* *
50%红药提取物 10 0153 ? 0109* * v
100%红药提取物 10 0161 ? 0112* * w
注:与生理盐水组比较, * * P < 0101; 与 10%的红药提取物组比
较, v P < 0105;与 50%的红药提取物组比较, w P < 0105。
由表 4可见, 经口给予小鼠不同剂量的红药提取
物 15天,经统计学处理,其足趾肿胀度在各剂量组与
对照组间比较均有显著性差异 (P < 0101 ), 即红药提
取物能增强小鼠的迟发型超敏反应, 并且各药物组之
间的迟发型超敏反应的增强效应差异显著 ( P <
01 05) ,随着红药提取物浓度的增加, 小鼠的迟发型超
敏反应的增强效应越好。
31 5 红药提取物对血清溶血素生成的影响
见表 5。
表 5 血清溶血素含量测定
组别 n OD
生理盐水 10 010558 ? 010897
10%红药提取物 10 011021 ? 011025
50%红药提取物 10 011686 ? 011020*
100%红药提取物 10 011738 ? 011131*
注:与生理盐水组比较, * P < 0105。
正常小鼠受鸡红细胞致免后, 即可产生抗鸡红细
胞抗体 (溶血素 ), 这种抗体, 在体外与鸡红细胞、补体
一起温育,即可使鸡红细胞溶解,释出血红蛋白, 使溶
液呈红色。颜色的深浅,反映了红细胞溶血量的多少,
而红细胞溶血与血清中抗体含量有关。因此, 测定其
上清液的光密度,则可间接判断血清中抗体形成的数
量,光密度越大, 则说明抗体产生量越多, 反之亦然。
由表 5可知, 50%、100%的红药提取物组小鼠血
清溶血素生成量显著高于生理盐水组 (P < 01 05) , 而
10%的红药提取物对小鼠血清溶血素生成无明显影响
(P > 01 05)。
4 讨论与结论
机体的免疫功能状态直接影响着疾病的发生、发
展及转归。机体免疫由特异性免疫和非特异性免疫所
组成。T淋巴细胞是机体特异性细胞免疫功能最重要
的一大细胞群,在正常机体内各 T淋巴细胞亚群相互
作用,维持着机体正常的细胞免疫功能。单核巨噬细
胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之
一。当细菌和异物等抗原性物质经适当途径进入机体
后,可迅速被机体单核巨噬细胞吞噬和清除,因而巨噬
细胞吞噬百分率的高低可以反应其吞噬功能的强弱。
针对细胞内寄生的病原微生物, 则主要由细胞免疫发
挥作用, T淋巴细胞的转化能力实验可以反应机体的
细胞免疫功能状态。
本实验通过测定红药提取物在整体条件下对小鼠
多项免疫指标的影响,得出了以下的结论:
41 1 红药提取物能全面增强小鼠非特异性免疫和特
异性免疫机能
本试验结果表明,一定浓度红药提取物能增加免
疫器官重量, 并能增强巨噬细胞吞噬功能, 具有对抗
CP所致小鼠白细胞数量减少作用, 因此小鼠非特异性
免疫机能得到增强; 各浓度红药提取物均能增强小鼠
的迟发型超敏反应 ( DTH ) , 提高小鼠细胞免疫功能。
同时,高浓度 ( 50%、100% )红药提取物能明显增加小
鼠血清中溶血素的含量, 表明红药提取物具刺激 B细
胞分化增殖转变为浆细胞的功能, 提高抗体水平从而
增强小鼠体液免疫功能。
41 2 红药提取物对小鼠非特异性免疫和特异性免疫
机能的增强作用有差异
尽管一定浓度红药提取物对小鼠各方面免疫机能
均有增强作用,但低浓度红药提取物 [10% ,相当于 2g
生药 /( kg# d) ]对小鼠非特异性免疫机能、细胞免疫
机能及体液免疫机能表现出不同影响。 10%红药提
取物能增加胸腺指数和脾脏指数, 能明显对抗 CP所
致白细胞数下降, 能增强小鼠的迟发型超敏反应
( DTH ) (见表 1、3、4) ,但对巨噬细胞吞噬功能、血清溶
血素含量无显著影响 (见表 2、5)。上述表明红药提取
物有较强的胸腺增殖和脾脏增殖、升白细胞作用,故对
细胞免疫有较强的增进作用, 而巨噬细胞吞噬功能和
体液免疫需更高浓度才具明显增强作用,其机制有待
今后进一步探讨。
41 3 红药提取物与小鼠免疫机能增强之间存在剂量
-效应关系
实验中发现, 红药提取物浓度影响小鼠免疫机能
#933# 辽宁中医杂志 2008年第 35卷第 6期
收稿日期: 2008 - 02 - 08
基金项目:广西壮族自治区科技攻关课题资助项目 (桂科攻 0472002 -
23 )
作者简介:范郁山 ( 1967 - ) ,男,广西合浦人,教授,博士, 主要从事中风
后遗症及浅刺针法的临床和实验研究。
的增强。低浓度红药提取物对小鼠某些免疫指标无明
显影响,不具有统计学意义,表明红药提取物的免疫增
强作用存在着最低剂量,并且在本实验浓度 (剂量 )范
围内红药提取物浓度 (剂量 )与小鼠免疫机能增强作
用之间存在着明显相关关系。例如, 随着红药提取物
浓度的增加 [10% ~ 100%,相当于生药 2~ 20g /( kg#
d) ],小鼠的迟发型超敏反应的增强效应愈明显,各浓
度药物组之间差异显著 ( P < 0105), 即随着红药提取
物浓度的增加, 提高小鼠细胞免疫功能的作用越强。
据推测,在一定范围内进一步减小或加大浓度 (剂量 )
可能会出现同样结果,这有待于今后进一步研究证实。
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浅刺调督综合疗法对脑梗塞大鼠
海马基因 BDNF表达影响的实验研究
范郁山,王 琼,谭小华,黄 婕
(广西中医学院针推学院,广西 南宁 530001)
摘 要: 目的:研究浅刺调督综合疗法对脑梗塞大鼠海马基因 BDNF表达的影响。方法: 将 SD大鼠 60只, 随机分为
浅刺针法加中药组 ( Ñ 组 )、常规针刺加中药组 ( Ò 组 )、模型组 ( Ó 组 )、正常组 ( Ô 组 )。前 3组采用血栓栓塞法建立脑
梗塞大鼠模型。经 2、7、14天 3个时间点采取相应处理后, 应用免疫组化的方法检测大鼠海马区 BDNF表达变化。结
果: 3个时间点模型组的 BDNF表达均低于正常组 (P < 0101); 3个时间点浅刺针法加中药组与常规针刺加中药组 BDNF
表达均高于模型组 (P < 01 01); 14天的时间点上浅刺针法加中药组 BDNF表达高于常规针刺加中药组 (P < 01 05)。结
论: 浅刺调督综合疗法能使脑梗塞大鼠海马区 BDNF基因表达水平增高,有效改善脑梗塞大鼠的神经缺损体征。
关键词: 浅刺调督综合疗法; 脑梗塞; BDNF
中图分类号: R24611; R - 332; R7431 33 文献标识码: B 文章编号: 1000 - 1719( 2008) 06 -0934 - 03
E ffec t ofComprehensive Therapy of Super fic ial Needling and Regulating Governor Vesse l
on Expression of Brain Derived Neurotrophic Fac tor in Cerebral Infarction Rats
FAN Yu-shan, WANG Q iong, TAN X iao-hua, HUANG J ie
(Co llege o f A cupuncture and Massage, Guangxi Traditiona lCh inese M edical University, Nanning 530001, Guangxi, China)
Abstrac t: Objective: To study e ffec t o f comprehensive therapy o f superficial needling and regu la ting governo r vesse l to the ex-
pression of brain de rived neuro troph ic factor in ce rebra l infarc tion ra ts.M ethods: 60 SD ratsw ere random ly div ided into supe rficia l
need ling w ith Chine se traditiona l drugs g roup ( G roup I), rou tine needling w ith Ch inese traditiona l drugs g roup ( G roup II),
m ode l contro l g roup ( G roup III), no rm a l con tro l g roup ( G roup IV ). The first three g roups w as se t up to ce rebra l infarction rats
by the thrombosis m ethod. E ach group w as div ided aga in at postoperative 2 day s, 7days, 14 days th ree tim e po in ts. Observe the
brain de rived neuro troph ic factor expre ssion changes in rat b ra in by immunohistochem istrym e thod after 2, 7, 14 days in the trea-
ted G roup I, II and the un trea ted group III, IV in the co rresponding time. R esults: On the three time points, BDNF expression in
ra t bra in of the m ode l contro l g roup we re significantly lowe r than tha t of the no rm al contro l g roup(P < 0. 01); On the three time
points, supe rficia l need ling w ith Ch inese traditiona l drug s g roup and routine needling w ith Chine se traditiona l drugs g roup w ere
#934# 辽宁中医杂志 2008年第 35卷第 6期