全 文 ：第 21卷 第 2期
2015年4月
（自然科学版）
JOURNAL OF SHANGHAI UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE)
Vol. 21 No. 2
Apr. 2015
DOI: 10.3969/j.issn.1007-2861.2014.03.001
隔山消总黄酮的提取工艺优化及其抗氧化特性
杨申明1,2, 王应顺1,2, 王振吉1,2
(1. 楚雄师范学院化学与生命科学学院, 云南楚雄 675000;
2. 云南省高校应用生物学重点实验室, 云南楚雄 675000)
摘要: 采用乙醇回流法提取隔山消(Cynanchum wilfordii)的总黄酮, 通过正交实验优化了
总黄酮的提取工艺, 并就总黄酮对活性氧自由基的清除作用进行了初步研究. 结果表明: 总黄
酮的最佳提取工艺参数为乙醇体积分数 60%, 提取温度 75 ◦C, 提取时间 60 min, 料液比 1∶30
(g/mL); 在此条件下总黄酮的平均提取率为 10.79%, 平均加样回收率为 98.78%; 总黄酮对羟
基自由基(·OH)和超氧阴离子自由基 (O−2 ·)的清除率可分别达到 29.2%和 36.7%, 说明总黄酮
对 ·OH和O−2 ·有较好的清除能力.
关键词 : 隔山消; 总黄酮; 正交实验; 羟基自由基; 超氧阴离子自由基
中图分类号 : R 29; R 284.2 文献标志码 : A 文章编号 : 1007-2861(2015)02-0220-09
Optimizing extraction technology of total flavonoids in
Cynanchum wilfordii and its antioxidant effects
YANG Shen-ming1,2, WANG Ying-shun1,2, WANG Zhen-ji1,2
(1. Department of Chemistry and Life Science, Chuxiong Normal University,
Chuxiong 675000, Yunnan, China;
2. Yunnan Province Universities Key Laboratory of Applied Biology,
Chuxiong 675000, Yunnan, China)
Abstract: Total flavonoids in Cynanchum wilfordii were extracted using an ethanol
refluxing method, and the extraction procedure was optimized with orthogonal experi-
ments. The antioxidant effects of the obtained total flavonoids on active oxygen radicals
were studied. The results show the following optimum extraction parameters. The volume
fraction of ethanol as extractant is 60%, the extraction temperature is 75 ◦C, the extraction
time is 60 min, and the ratio of solid to liquid is 1∶30 (g/mL). Under these conditions,
the average extraction rate of total flavonoids reaches 10.79%, the average recovery rate of
the added sample is 98.78%, and the scavenging effects of total flavonoids on ·OH and O−2 ·
are 29.2% and 36.7%, respectively, implying that the material has good ability to scavenge
·OH and O−2 ·.
Key words: Cynanchum wilfordii; total flavonoid; orthogonal experiment; hydroxyl
radical; superoxide anion free radical
收稿日期: 2013-10-24
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(31300370); 云南省应用基础计划资助项目(2011FZ186); 云南省青年应用基
础计划资助项目(2012FD049); 云南省重点建设学科资助项目(05YJJSXK03); 云南省高校科技创新团队
支持计划资助项目(IRTSTYN); 楚雄师范学院重点建设学科基金资助项目(05YJJSXK03)
通信作者: 王振吉(1983—), 男, 副教授, 研究方向为生理生化. E-mail: wangzj@cxtc.edu.cn
第 2期 杨申明, 等: 隔山消总黄酮的提取工艺优化及其抗氧化特性 221
隔山消(Cynanchum wilfordii)始载于《本草纲目》, 又名飞来鹤、隔山撬、隔山锹, 为龙胆
目萝藦科牛皮消属植物耳叶牛皮消的块状根[1], 产于湖南、江苏、浙江、江西、贵州、四川、云
南等地, 广泛生长于山坡灌木丛或山地路旁草地中. 隔山消药源丰富, 为白族、彝族民间习用
草药, 在《大理中药资源志》《中药大辞典》《全国中草药汇编》等书籍中均有收录. 民间常用隔
山消治疗厌食、肠炎、红白痢疾、消化不良等病症[2].
目前, 隔山消的药用功能正逐步引起人们的重视. 蓝海等[3]从隔山消中分离得到了没食
子酸、原儿茶酸、揉花酸. 陈艳等[4]从隔山消的石油醚部分分离得到了6个芳香类化合物, 分
别鉴定为 2, 4-二羟基苯乙酮、奎乙酰苯、对羟基苯乙酮、4-羟基 -3-甲氧基苯乙酮、2, 4-二羟
基 -5-甲氧基苯乙酮、3-羟基 -4-甲氧基苯甲酸. 本实验采用乙醇回流法对隔山消中的总黄酮进
行提取, 通过显色反应进行鉴定, 并利用Al(NO3)3-NaNO2比色法测定其含量; 采用L9(34)正
交实验优化了提取工艺, 研究了所提取的总黄酮对于羟基自由基 (·OH)及超氧阴离子自由
基 (O−2 ·)的清除作用. 这为更好地开发和利用隔山消中黄酮类物质提供了科学的依据和参考.
1 材料与方法
1.1 实验材料与试剂
隔山消块状根采自云南楚雄, 经鉴定为萝藦科植物耳叶牛皮消. 样品依次用自来水、蒸馏
水洗净后放入远红外快速恒温干燥箱中烘干 (80 ◦C), 用粉碎机粉碎后过 60目筛, 得干粉, 之
后密封保存, 备用. 芦丁对照品(HPLC>98%)由成都思科华生物技术有限公司生产. 其他化学
试剂均为分析纯, 由天津市风船化学试剂厂生产.
1.2 实验方法
1.2.1 样品溶液的制备
准确称取隔山消干粉 0.50 g, 加入 15 mL 60%乙醇溶液, 在 75 ◦C水浴下回流提取 60 min.
提取完毕后过滤, 将滤液转移至 50 mL容量瓶中定容, 用 60%乙醇定容至刻度, 摇匀, 得样品
溶液, 备用. 平行制备样品溶液 3份.
1.2.2 总黄酮成分的鉴定
取 5份 1 mL样品溶液, 分别加入 4% NaOH溶液、1% AlCl3-CH3CH2OH溶液、盐酸-镁
粉、浓H2SO4、5% FeCl3进行反应, 观察实验现象, 检识总黄酮化合物的有无[5-6].
1.2.3 总黄酮含量的测定
以芦丁为标准品, 利用Al(NO3)3-NaNO2比色法测定总黄酮的含量[7].
1.2.3.1 标准溶液的制备
准确称取在 115 ◦C条件下恒重的芦丁 13.3 mg, 用 60%乙醇溶解并定容至 50 mL, 摇匀, 得
到质量浓度为 0.266 mg/mL的芦丁标准溶液.
1.2.3.2 标准曲线的绘制
准确吸取芦丁标准溶液 0, 1, 2, 3, 4, 5 mL于 25 mL比色管中, 分别加入 5% NaNO2溶
液 0.50 mL, 摇匀, 放置 6 min; 加入 10% Al(NO)3溶液 0.50 mL, 摇匀, 放置 6 min; 再加入 4%
NaOH溶液 4 mL, 摇匀, 放置 6 min; 加入 60%乙醇定容至 10 mL刻度线, 摇匀, 放置 10 min.
在 500 nm波长处测定吸光度(以试剂作参比空白), 并以芦丁质量浓度C为横坐标, 吸光
度A为纵坐标, 绘制标准曲线, 建立回归方程.
1.2.3.3 提取率的计算
隔山消总黄酮提取率的计算公式如下:
222 （自然科学版） 第 21卷
提取率(%) =
C ×N × V
M
× 100%,
式中, C为根据回归方程计算出的黄酮类化合物质量浓度 (mg/mL), N为稀释倍数, V 为提取
液的体积 (mL), M为样品质量 (g).
1.2.4 提取工艺的单因素实验[8-9]
1.2.4.1 最佳乙醇体积分数的考察
准确称取 0.50 g样品 5份, 分别用 15 mL体积分数为 40%, 50%, 60%, 70%, 80%的乙醇
在 75 ◦C水浴中回流提取 60 min. 提取完毕后过滤, 将滤液转移至 50 mL容量瓶中, 分别用于
提取剂浓度相同的乙醇定容至刻度, 摇匀. 分别取出5份 1 mL待测溶液于 25 mL的比色管中,
按 1.2.3.2的操作方法测定吸光度, 并计算提取率.
1.2.4.2 最佳提取温度的考察
准确称取 0.50 g样品 5份, 分别加入 60%乙醇溶液 15 mL, 在 65, 70, 75, 80, 85 ◦C水浴中
回流提取 60 min. 其他操作同 1.2.4.1节, 并计算提取率.
1.2.4.3 最佳提取时间的考察
准确称取 0.50 g样品 5份, 分别加入 60%乙醇溶液 15 mL, 在 75 ◦C水浴中分别回流提
取 15, 30, 60, 90, 120 min. 其他操作同 1.2.4.1节, 并计算提取率.
1.2.4.4 最佳料液比的考察
准确称取 0.50 g样品 5份, 分别加入 60%乙醇溶液 5, 10, 15, 20, 25 mL, 在 75 ◦C水浴中
回流提取 60 min. 其他操作同 1.2.4.1节, 并计算提取率.
1.2.5 最佳提取工艺参数优化
在单因素实验基础上, 结合药材性质以及实际生产要求, 以乙醇体积分数、提取温度、提
取时间、料液比为实验考察因素, 以隔山消中总黄酮的提取率为评价指标, 设计L9(34)正交实
验, 探索最佳优化条件. 正交实验因素和水平如表 1所示.
表 1 正交实验因素和水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal design
实验因素
水平 A B C D
乙醇体积分数/% 提取温度/◦C 提取时间/min 料液比/(g·mL−1)
1 50 70 30 1∶20
2 60 75 60 1∶30
3 70 80 90 1∶40
1.2.6 样品中总黄酮含量的测定
分别取 3份 1 mL待测溶液于 25 mL比色管中, 按 1.2.3.2节的操作方法, 平行测定吸光
度 3次, 计算总黄酮的提取率.
1.2.7 回收率的测定
取 1 mL已测得黄酮类化合物提取率的样品溶液, 分别加入质量浓度为 0.026 6 mg/mL的
芦丁对照液 1, 2, 3, 4, 5 mL, 按标准曲线绘制方法[7]测定, 计算回收率.
1.2.8 精密度实验
分别取 5份 1 mL待测溶液于 25 mL比色管中, 按标准曲线绘制方法[7]测定吸光度, 计算相
对标准偏差 (relative standard deviation, RSD).
第 2期 杨申明, 等: 隔山消总黄酮的提取工艺优化及其抗氧化特性 223
1.2.9 隔山消总黄酮抗氧化活性的测定
1.2.9.1 隔山消总黄酮对 ·OH的清除作用
参照Fenton反应的方法[10-11]建立 ·OH自由基产生体系模型. 在 10 mL比色管中依次加入
9 mmol/L FeSO4溶液 2 mL, 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液 2 mL, 8.8 mmol/L H2O2溶液 2 mL,
用蒸馏水定容至刻度, 作为空白对照液. 在 10支 10 mL比色管中分别加入 9 mmol/L FeSO4溶
液 2 mL, 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液 2 mL, 并以两支为一组分别加入质量浓度为 0.008 5,
0.017 1, 0.025 6, 0.034 2, 0.042 7 mg/mL的黄酮提取液 1 mL. 最后分别加入 8.8 mmol/L H2O2
溶液 2 mL, 用蒸馏水定容至刻度. 将上述 11支比色管于 37 ◦C恒温反应 30 min, 以蒸馏水和空
白对照液为参比, 测量在 510 nm处的吸光度. 清除率计算公式为
·OH清除率(%) = A0 − (Ax −Ax0)
A0
× 100%,
式中, A0为空白对照液的吸光度, Ax为样品液吸光度, Ax0为不加H2O2样品的黄铜提取液的
吸光度.
1.2.9.2 隔山消总黄酮对O−2 ·清除作用
用邻苯三酚自氧化法[12]就隔山消总黄酮对O−2 ·的清除作用进行测定. 在 10 mL比色管
中分别加入 50 mmol/L Tris-HCI溶液 (pH=8.2)4.5 mL, 超纯水 4.2 mL, 混匀, 在 25 ◦C水浴中
恒温 20 min. 取出后立即加入于 25 ◦C水浴中预热好的 3 mmol/L邻苯三酚 0.3 mL(以0.3 mL
10 mmol/L的 HCI代替邻苯三酚作为空白对照), 迅速混匀后在325 nm下每隔30 s测定一次吸
光度, 直到 5 min时停止. 计算对照液的吸光度随时间的变化率F0.
依照上述方法, 在加入邻苯三酚前先加入 1 mL质量浓度为 0.008 5, 0.017 1, 0.025 6,
0.034 2, 0.042 7 mg/mL的黄酮提取液, 再依次加入 50 mmol/L Tris-HCI溶液 (pH=8.2)
4.5 mL, 超纯水 3.2 mL, 混匀, 在 25 ◦C水浴中恒温 20 min. 取出后立即加入于 25 ◦C水浴中预
热的 3 mmol/L邻苯三酚 0.3 mL, 迅速混匀后在 325 nm下每隔 30 s测定一次吸光度, 直到
5 min时停止, 计算对照液的吸光度随时间的变化率Fx. 清除率计算公式为
O−2 ·清除率(%) =
F0 − Fx
F0
× 100%,
式中, F0为空白溶液的吸光度, Fx为对照液的吸光度.
2 结果与分析
2.1 隔山消黄酮类化合物颜色反应的检识
隔山消中黄酮类化合物显色反应的结果如表 1所示, 表明隔山消的提取液中含有黄酮类
化合物.
表 2 隔山消中黄酮的检识
Table 2 Identification for flavonoids in extract from Cynanchum wilfordii
试剂 黄酮提取液
4%NaOH 黄色
1%AlCl3-CH3CH2OH 黄绿色
盐酸-镁粉 橙红色
浓H2SO4 橙黄色
5%FeCl3 墨绿色
224 （自然科学版） 第 21卷
2.2 芦丁标准曲线
图 1为本实验所绘制的芦丁质量浓度标准曲线. 可见, 该曲线的线性关系良好, 回归方程
为A = −0.002 1 + 10.936 1C, 相关系数R=0.999 62, 线性范围为 0.026 6∼0.133 0 mg/mL.
图 1 芦丁标准曲线
Fig. 1 Standard curve for rutin
2.3 单因素实验结果
图2为乙醇体积分数、提取温度、提取时间及料液比对总黄酮提取效果的影响.
如图 2(a)所示, 随着乙醇体积分数的增大, 总黄酮的提取率逐渐增加, 当乙醇体积分数增
加到 60%时, 提取率最高. 之后随着乙醇体积分数的进一步增大, 总黄酮提取率呈下降趋势.
因此, 本实验选择乙醇体积分数为 50%∼70%用于进一步的优化实验.
图 2 乙醇体积分数、提取温度、提取时间、料液比对总黄酮提取效果的影响
Fig. 2 Effects of the volume fraction of ethanol, extraction temperature, extraction time,
and material/solvent ratio on the extraction yield of total flavonoids
如图 2(b)所示, 随着提取温度的升高, 总黄酮的提取率逐渐增加, 当提取温度升高到
75 ◦C时, 提取率最高, 之后随提取温度的进一步升高. 总黄酮提取率呈下降趋势. 因此, 本实
第 2期 杨申明, 等: 隔山消总黄酮的提取工艺优化及其抗氧化特性 225
验选择提取温度为 70∼80 ◦C用于进一步的优化实验.
如图 2(c)所示, 随着提取时间的延长, 总黄酮的提取率逐渐增加, 当提取时间增加到
60 min时, 提取率最高. 之后随着提取时间的进一步延长, 总黄酮提取率呈下降趋势. 因此, 本
实验选择提取时间为 30∼90 min用于进一步的优化实验.
如图 2(d)所示,随着料液比的增大,总黄酮的提取率逐渐增加,当料液比为 1∶30 (g/mL)时,
提取率最高. 之后随料液比的进一步增大, 总黄酮提取率呈下降趋势. 因此, 本实验选择料液
比为 1∶20∼1∶40(g/mL)用于进一步的优化实验.
2.4 正交实验结果
正交实验的结果如表 3所示. 分析表 3可知, 不同的因素对隔山消总黄酮提取率的影响程
度不同, 其影响的主次顺序为A>D>B >C, 即乙醇体积分数>料液比>提取温度>提取时
间. 由实验数据可以得出, 乙醇体积分数为显著影响因素, 极差分析最优组合为 A2B2C2D2,
最佳提取工艺条件如下: 乙醇体积分数60%, 料液比 1∶30 (g/mL), 提取温度 75 ◦C, 提取时间
60 min.
表 3 正交实验结果
Table 3 Results of the orthogonal experiment
实验号 A B C D 总黄酮提取率/%
1 1 1 1 1 9.20
2 1 2 2 2 10.47
3 1 3 3 3 9.15
4 2 1 2 3 10.28
5 2 2 3 1 10.55
6 2 3 1 2 10.43
7 3 1 3 2 9.68
8 3 2 1 3 10.06
9 3 3 2 1 9.63
K1 28.20 29.16 29.69 29.38
K2 31.26 31.08 30.38 30.58
K3 29.37 29.21 29.38 29.49
R 3.06 1.92 1.00 1.20
2.5 总黄酮平均提取率及回收率的测定结果
根据正交实验结果所确定的最佳提取工艺条件对隔山消中的总黄酮进行提取, 并对其
平均提取率及回收率进行了测定, 结果如表 4和 5所示. 由表 4可见, 总黄酮的平均提取率
为 10.79%. 由表5可见, 加样平均回收率为 98.78%, RSD值为 0.28%, 表明本实验方法对隔山
消总黄酮提取率测量的准确度较高.
2.6 精密度实验
本实验的精密度测定结果如表 6所示. 可见, RSD平均值为 0.38%, 偏差较小, 说明本实验
的精密度良好, 实验数据可靠.
226 （自然科学版） 第 21卷
表 4 隔山消中总黄酮提取率
Table 4 Extraction efficiency for flavonoids from Cynanchum wilfordii
序号 吸光度 质量浓度/(mg·mL−1) 提取率/% 平均提取率/%
1 0.465 0.042 7 10.70
2 0.471 0.043 3 10.80 10.79
3 0.473 0.043 4 10.86
表 5 回收率实验结果
Table 5 Results of recovery test
样品量/mg 加入量/mg 测得量/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/%
1.082 0.026 6 1.092 98.5
1.082 0.053 2 1.119 98.6
1.082 0.079 8 1.147 98.7 98.78 0.28
1.082 0.106 4 1.179 99.2
1.082 0.133 0 1.202 98.9
表 6 精密度实验结果
Table 6 Results of precision experiment
样品 吸光度 平均吸光度 RSD/%
1 0.483
2 0.487
3 0.485 0.485 0.38
4 0.480
5 0.490
2.7 隔山消总黄酮对·OH和O−2 ·的清除作用
隔山消总黄酮对 ·OH和O−2 ·的清除作用如表 7所示. 可见,隔山消总黄酮对由H2O2/Fe2+
体系通过Fenton 反应产生的 ·OH具有清除作用, 且其清除能力随着总黄酮加入量的增加而上
升, 即清除率与总黄酮的用量间存在一定的量效关系. 隔山消总黄酮对由邻苯三酚自氧化体系
所产生的O−2 ·也有一定的清除作用, 且其清除能力也随着总黄酮加入量的增大而提高, 表明清
除率与总黄酮的用量之间也存在一定的量效关系.
表 7 隔山消总黄酮对·OH和O−2 ·清除作用
Table 7 Scavenging effects of flavonoids from Cynanchum wilfordii on ·OH and O−2 ·
总黄酮的质量浓度/(mg·mL−1) ·OH的清除率/% O−2 ·的清除率/%
0.008 5 13.5 16.7
0.017 1 14.6 23.3
0.025 6 20.0 28.3
0.034 2 24.2 33.3
0.042 7 29.2 36.7
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3 讨 论
一般情况下, 游离黄酮类化合物难溶于水或不溶于水, 易溶于甲醇、乙醇、丙酮等亲水性
有机溶剂中. 乙醇的溶解性能较好, 对植物细胞的穿透能力较强, 与一般有机溶剂相比, 具有
毒性小、价格便宜、来源方便、便于回收利用等特点, 故本实验选择乙醇作为提取溶剂. 提取
工艺单因素及正交实验结果表明, 不同的提取因素对隔山消总黄酮提取率的影响很大, 影响程
度由大到小依次为乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间. 本实验优化的最佳提取工艺
为乙醇体积分数 60%, 提取温度 75 ◦C, 提取时间 60 min, 料液比 1∶30 (g/mL). 在此工艺条件
下, 隔山消总黄酮的平均提取率为 10.79%, 平均回收率为 98.78%, RSD值为 0.28%. 这说明本
实验方法准确度高、操作简单、重复性好, 可用于隔山消中总黄酮的提取和含量测定.
现代医学认为, 自由基在人体内可直接引起许多疾病, 并诱发衰老. 人们也普遍认为植物
天然抗氧化物可以抑制自由基反应, 最终减小癌症、心血管疾病的发生机率[13]. O−2 ·的形成
是氧毒素的主要因素之一. O−2 ·一旦在机体内形成, 短时间内就会引发连锁反应, 生成羟基自
由基等多种自由基, 促进脂质体氧化, 生成有害物质, 对细胞造成损伤[14]. ·OH是一种化学
性质非常活泼的活性氧, 也是目前已知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基.
·OH几乎能与所有的生物大分子发生各种不同类型的反应, 并且具有非常高的速度常数[15].
黄酮类化合物因其特殊的结构使其能选择性地抑制体内酶的活性, 也可与金属离子发生
相互作用, 还可通过酚羟基与自由基反应生成较稳定的半醌式自由基, 终止自由基链式反应.
这些特性使黄酮类化合物具备了抗氧化活性[16-17]的特质. 本实验利用H2O2与Fe2+混合后
会产生存活时间短、具有很高反应活性的 ·OH这一性质, 在反应体系中加入水杨酸, 有效地
捕捉到了 ·OH并产生有色物质. 该产物在 510 nm处具有强吸收. 当加入具有清除 ·OH功能
的黄酮类化合物时, 黄酮类化合物便会与水杨酸竞争 ·OH, 从而使有色产物量减少. 采用固
定反应时间法, 在 510 nm处测量反应液的吸光度, 并与空白液比较, 便能测定黄酮类化合物
对 ·OH的清除作用. 本实验用邻苯三酚自氧化法测定了隔山消总黄酮对O−2 ·的清除作用. 邻
苯三酚在碱性条件下能迅速发生氧化反应释放出O−2 ·并不断积累, 在反应开始的 5 min之内,
反应液在 325 nm波长处的吸光度会随着反应时间的延长而线性增大. 因此, 在 325 nm处测
量反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较, 就可得出黄酮类化合物对O−2 ·的清除
率. 抗氧化性实验结果表明, 隔山消中黄酮类化合物对 ·OH和O−2 ·具有较强的清除作用, 在 0∼
0.042 7 mg/mL范围内, 随着总黄酮质量浓度的增高, 对·OH和O−2 ·的清除率也相应增大.
本研究结果表明, 隔山消中富含具有很强的抗氧化活性的黄酮类化合物, 是一种极具开发
价值的药物. 相关研究结果对隔山消的进一步开发和利用具有重要意义. 然而, 隔山消的提取
物组成、各成分的分子结构以及各成分在发生抗氧化作用时的作用机理等尚不清楚, 有待进一
步的研究.
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