全 文 ：林业科技开发 2014 年第 28 卷第 4 期 79
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( 责任编辑 吴祝华
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
)
doi:10． 13360 / j． issn． 1000－8101． 2014． 04． 020
天目铁木丛生芽诱导和试管苗保存技术
顾地周，沈红梅，闫中雪，徐鹏佳，袁浩
(通化师范学院生命科学学院，吉林 通化 134002)
收稿日期:2013－12－11 修回日期:2014－03－20
基金项目:国家科技部“国家科技攻关计划引导项目(编号:
2005BA741C);吉林省科技厅资助项目(编号:200705C05)。
作者简介:顾地周(1973 －)，男，讲师，主要从事珍稀濒危植物和药用
植物研究。E-mail:gudizhou@ 163． com
摘 要:以天目铁木嫩茎为外植体，应用均匀设计法筛选其基部直接再生丛生芽苗和试管苗保存的最适合培养
基。结果表明，最适合的嫩茎尖基部再生芽苗培养基为: 1 /4 DＲ + TDZ 3． 80 mg /L + NAA 0． 03 mg /L + KT 1． 50
mg /L，诱导率达 99． 0%以上;试管苗保存培养基为: 1 /8 DＲ + TDZ 0． 45 mg /L + KT 1． 60 mg /L +根皮苷 2． 80 mg /L，
在试管内保存 18个月，平均生长率为 2． 26%。成功建立了天目铁木嫩茎基部直接再生丛生芽苗和试管苗保存体系。
关键词:天目铁木;丛生芽;试管苗;保存;均匀设计
A technique on shoots induction and profitability in vitro conservation with plantlets of Ostrya rehderiana
∥GU Dizhou，SHEN Hongmei，YAN Zhongxue，XU Pengjia，YUAN Hao
Abstract:In this study，the tender stem of Ostrya rehderiana was used as explant and the suitable medium compositions
were screened for multiple shoots at base of tender stem and in vitro conservation of plantlets by using uniform design
experiments． The results showed that the most suitable culture mediums were as following:1 /4 DＲ + TDZ 3． 80 mg /L +
NAA 0． 03 mg /L + KT 1． 50 mg /L for bud seedling regeneration at base of tender stem，the rate of induction was 99． 0%;
1 /8 DＲ + TDZ 0． 45 mg /L + KT 1． 60 mg /L + Phloridzin 2． 80 mg /L，the rate of average growth was 2． 26% with 18 month
in vitro conservation． Multiple shoots at base of tender stem and in vitro conservation of plantlets of O． rehderiana had been
successfully established．
Key words:Ostrya rehderiana;multiple shoots;in vitro plantlets;conservation;uniform design
Author’s address:College of Life Sciensce，Tonghua Normal University，Tonghua 134002，Jilin，China
天目铁木(Ostrya rehderiana)是桦木科铁木属植
物，国务院 1999 年 8 月 4 日批准为国家Ⅰ级重点保
护野生植物［1－2］。仅分布于浙江西天目山，为浙江天
欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗 技术开发
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目山特有的珍稀树种，目前野生植株仅存 5 株。天目
铁木不仅是中国特有种，而且是该属分布于中国东部
的唯一种，具重要研究价值。
由于旅游产业的开发及修建基础设施等人为干
扰，天目铁木的生境遭到极大破坏;且天目铁木的自
然更新能力差，采用种子和扦插等常规繁殖极其困
难，导致了该物种的人工种群非常少，处于极度濒危
现状。因此，本研究以天目铁木嫩茎为外植体，应用
植物组织培养方法，试验设计采用多因素交叉配比重
复，旨在筛选获得天目铁木嫩茎直接诱导丛生芽和试
管苗保存培养基。目前，天目铁木的相关研究已有报
道［3－5］，但是在天目铁木嫩茎直接诱导丛生芽以及试
管苗保存方面的系统研究迄今尚未见报道。
1 材料与方法
1． 1 外植体的获得
天目铁木枝条采自浙江省西天目山，将枝条在
1 /15MS(大量元素)和 200 mg /L的混合溶液中，置于
温度为(20 ± 2)℃的实验室内水培，22 d 后，待腋芽
萌发且嫩枝伸长并长至 2． 00 cm 以上时，用直剪剪
下，首先在超净工作台内用 70%乙醇(体积分数)冲
洗 8 s，其次用 3%(质量浓度)次氯酸钠溶液浸泡 6
min，再用无菌水涮洗 8 次，用无菌滤纸将嫩枝表面水
分吸干后作为外植体备用。
1． 2 天目铁木嫩茎直接诱导丛生芽培养基的筛选
以 1 /4 DＲ为基本培养基，由 TDZ单因子试验可
知，当 TDZ低于 3． 20 mg /L 时，分化率仅为 38． 9%;
3． 20 ～ 3． 70 mg /L 时分化率呈逐渐上升趋势且芽苗
长势较好;3． 80 mg /L时达到最高，但芽苗较弱;高于
3． 80 mg /L时尽管分化率较高，但芽苗叶片变形。因
此，将 TDZ 浓度暂定为 3． 20 ～ 3． 70 mg /L。由 NAA
单因子试验可知，NAA 低于0． 04 mg /L时，芽苗生长
较弱;高于 0． 08 mg /L 时基部出现愈伤组织，因此初
步确定为 0． 04 ～ 0． 08 mg /L。由 KT 单因子试验可
知，添加 1． 50 mg /L 的 KT 长势较好且苗干较粗壮。
因此，培养基为 1 /4 DＲ［6］，内含蔗糖和琼脂粉分别为
30 和 6． 8 g /L，添加质量浓度不同的噻苯隆 TDZ和生
长素 NAA，添加 1． 50 mg /L 激动素 KT，pH 调节为
5． 6，将外植体置于温度(27 ± 2)℃、光照强度 1000
lx、光照周期10 h /d条件下培养，为提高天目铁木芽
苗分化速度和分化率，采用均匀法［7－11］的 U10(10
2)
均匀表，每个处理为 10 个茎段，重复 3 次，探讨不同
质量浓度的 NAA 和 TDZ 交叉配比对芽苗分化率的
影响。培养嫩茎 45 d 统计其分化率，筛选出嫩茎直
接分化芽苗的最适分化培养基。
1． 3 天目铁木试管苗保存培养基的筛选
以 1 /8 DＲ 为培养基，由 TDZ 单因子试验可知，
TDZ低于 0． 70 mg /L时，芽苗完全不分化且茎尖出现
枯萎;高于 1． 20 mg /L时恢复分化，尽管分化率低，但
芽苗出现快速生长趋势，因此初步确定为 0． 70 ～
1． 20 mg /L。由 KT单因子试验可知，低于 0． 80 mg /L
的 KT 芽苗生长势降低，且出现营养不良而茎尖变
黄;高于 1． 50 mg /L时茎尖生长速度快，因此初步控
制在 0． 80 ～ 1． 50 mg /L。另由根皮苷单因子试验可
知，当根皮苷低于 2． 00 mg /L 时芽苗生长明显;高于
2． 80 mg /L时芽苗变黄且开始出现落叶现象，因此初
步确定为 2． 00 ～ 2． 80 mg /L。据此，采用“低营养延
缓生长”的方法［12］，培养基为1 /8 DＲ，添加 6． 8 g /L
琼脂、30 g /L蔗糖和不同质量浓度的 TDZ、KT和生长
延缓剂根皮苷，调节 pH为 5． 6，将试管内的丛生芽在
常温、12 h /d的光照周期、800 lx 的光照强度条件下
培养。应用均匀表 U12(12
3)，每个处理接种芽团数
为 10，重复 3 次，探讨 TDZ、KT 和根皮苷不同质量浓
度交叉配比对生长率的影响。小芽团培养 3 个月
(期间更换 1 次新培养基)统计生长率，并筛选天目
铁木试管苗保存的最适培养基。
1． 4 数据处理与分析
初步规律摸索采用均匀设计法设计并试验，应用
均匀设计软件(Uniform Design 3． 0V)对数据进行分
析处理。
2 结果与分析
2． 1 影响诱导天目铁木嫩茎直接分化芽苗的 TDZ
和 NAA质量浓度筛选
丛生芽诱导的实验结果(表 1)经分析处理后可
知，回归方程为 Y = － 41． 1 + 39． 5X1 － 195X2，复相关
系数 0． 976 2，F = 70． 96 ＞ F0． 05(2，7)= 4． 737，回归方
程显著。对 TDZ和 NAA 进行显著性检验可知，TDZ
和 NAA对分化率均影响显著。计算 TDZ 和 NAA 的
回归贡献值及贡献率可知:U1 = 377，U1 /U = 71． 4%;
U2 = 73． 9，U2 /U = 14． 0%，即 TDZ对嫩茎基部芽苗直
接再生的分化率 Y 的贡献远远大于 NAA，因 TDZ 和
NAA分别与分化率呈正和负相关。推测 TDZ 和
NAA质量浓度分别在 3． 70 mg /L 以上和 0． 04 mg /L
以下时，可能分化率较高。为了验证此种推测，又以
TDZ和 NAA 质量浓度分别为 3． 70 ～ 4． 00 mg /L 和
0． 01 ～ 0． 04 mg /L 做了 7 个水平的补充试验，重复 3
次取平均值。即 1． 1 中处理好的嫩枝条以 1 或 2 叶 1
技术开发 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗
林业科技开发 2014 年第 28 卷第 4 期 81
段(嫩茎尖)切割后，并接种至含有不同质量浓度
TDZ、NAA和 KT的 1 /4 DＲ培养基中开展验证试验，
培养 15 d 时，基部切口处有大量颗粒状凸起产生;30
d时，颗粒状凸起转为锥状，并逐渐伸长形成芽苗(图
1a);通过 45 d 的培养，锥形凸起不断伸长形成丛生
芽团，55 d后，分化的芽苗壮而整齐，高度可达 3． 50
cm以上(图 1b)。结果证明，TDZ 和 NAA 质量浓度
分别为 3． 80 mg /L和 0． 03 mg /L时，嫩茎直接分化芽
苗率最高，达 99． 0%，分化率比表 1 所列 10 个处理
均高。可见，最佳的天目铁木嫩茎直接分化芽苗培养
基为:1 /4 DＲ + NAA 0． 03 mg /L + TDZ 3． 80 mg /L +
KT 1． 50 mg /L。
表 1 丛生芽诱导主要因素及水平筛选的
均匀设计试验结果
水平
主要因素 /(mg·L －1)
TDZ(X1) NAA(X2)
分化率(Y)/
%
1 3． 20 0． 07 72． 0
2 3． 30 0． 06 75． 3
3 3． 40 0． 04 89． 0
4 3． 50 0． 08 82． 6
5 3． 60 0． 05 90． 1
6 3． 70 0． 05 95． 8
7 3． 40 0． 08 78． 0
8 3． 50 0． 04 88． 4
9 3． 60 0． 06 87． 8
10 3． 70 0． 07 92． 6
a． 嫩茎基部芽苗直接再生初期;b． 嫩茎基部芽苗直接再生后期;c．种苗试管保存;d．解除保存后生长情况
图 1 天目铁木丛生芽诱导与试管苗保存阶段培养物的形态
2． 2 1 /8 DＲ培养基中不同质量浓度激素配比对天
目铁木试管苗保存的影响
从试管苗保存结果(表 2)分析处理后可知，回归
方程为 Y = 5． 61 + 0． 561X1 － 0． 450X2 － 1． 08X3，复相
关系数 0． 991 6，F = 157． 40 ＞ F0． 05(3，8)= 4． 066，说
明方程显著。对 TDZ、KT 和根皮苷进行显著性检验
可知，TDZ、KT和根皮苷对生长率均具有显著影响。
通过表 2 试验结果计算 TDZ、KT 和根皮苷的回归贡
献值和贡献率可知，U1 = 0． 102，U1 /U = 9． 03%;U2 =
0． 106，U2 /U = 9． 41%;U3 = 0． 935，U3 /U = 82． 7%，说
明根皮苷对天目铁木芽苗生长的贡献率远远比 TDZ
和 KT大，根据研究的目的(反向优化)，以免根皮苷
在 2． 80 mg /L和 KT在 1． 50 mg /L以上，TDZ在 0． 70
mg /L以下有较低的生长率，又以根皮苷为 2． 80 ～
3． 00 mg /L，KT 为 1． 50 ～ 2． 00 mg /L，以及 TDZ 为
0． 00 ～ 0． 70 mg /L做了 15 个水平的补充实验。结果
表明:根皮苷为 2． 80 mg /L、KT为 1． 60 mg /L和 2． 80
mg /L、TDZ为 0． 45 mg /L 时生长速度慢且生长率最
低。因此，将 2． 1 中诱导的天目铁木丛生芽团切割成
小芽团，接种到含根皮苷、1． 60 mg /L KT 和 0． 45
mg /L TDZ 的 1 /8 DＲ 培养基中进行验证补充试验，
经过 3 个月的保存，平均芽苗生长率为 2． 58%，18 个
月后，生长率的平均值为 2． 26%以下(图 1c)，芽苗的
形态、质量等均无显著变化。在估计区间内，且比表
2 中 12 个处理的生长率均低。因此，天目铁木试管
苗保存的最佳培养基为:1 /8 DＲ + TDZ 0． 45 mg /L +
KT 1． 60 mg /L +根皮苷 2． 80 mg /L。
表 2 试管苗保存主要因素及水平筛选的
均匀设计试验结果
水平
主要因素 /(mg·L －1)
TDZ(X1) KT(X2) 根皮苷(X3)
生长率(Y)/
%
1 0． 70 1． 30 2． 60 2． 63
2 0． 80 1． 50 2． 60 2． 54
3 0． 90 1． 20 2． 30 3． 10
4 1． 00 1． 40 2． 00 3． 40
5 1． 10 1． 10 2． 70 2． 87
6 1． 20 1． 30 2． 70 2． 70
7 1． 20 1． 00 2． 40 3． 27
8 1． 10 1． 20 2． 10 3． 44
9 1． 00 0． 90 2． 80 2． 77
10 0． 90 1． 50 2． 80 2． 49
11 0． 80 0． 80 2． 50 2． 97
12 0． 70 1． 40 2． 20 3． 00
欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗 技术开发
82 林业科技开发 2014 年第 28 卷第 4 期
天目铁木小芽团保存 18 个月后，再转接到培养
基 1 /4 DＲ + TDZ 3． 80 mg /L + NAA 0． 03 mg /L + KT
1． 50 mg /L上继续培养，培养 35 d 后，小芽团基部产
生大量的颗粒状突起;继续培养至 50 d，小芽团基部
又有大量粗壮芽苗分化出来，并形成丛生芽团，分化
率平均值达 100． 0%，芽苗生长旺盛，发育和苗的质
量与 2． 1 中分化的芽苗相同(图 1d)。
3 结论与讨论
研究结果表明，培养基 1 /4 DＲ + NAA 0． 03
mg /L + TDZ 3． 80 mg /L + KT 1． 50 mg /L 对天目铁木
嫩茎直接芽苗分化培养效果最好。质量浓度高于
3． 80 mg /L的 TDZ可使嫩茎基部产生大量愈伤组织，
愈伤组织不分化芽苗，当低于 3． 20 mg /L 时，嫩茎基
部芽苗分化率均在 63． 0%以下。说明天目铁木嫩茎
基部直接再生芽苗需要适宜浓度的 TDZ，而 TDZ 高
于 3． 80 mg /L时，分化的芽苗较少，起抑制作用。当
NAA低于 0． 03 mg /L 质量浓度时，分化的芽苗细弱
且生长较缓慢，这可能是细胞分裂素 TDZ 和生长素
NAA配比失调，导致细胞分裂素 TDZ 占主导地位而
趋于分化且芽苗生长缓慢的原因。当 NAA超过0． 08
mg /L时嫩茎基部产生大量愈伤组织，芽苗分化率降
低，嫩茎基部细胞趋于愈伤组织形成，可能是过高的
生长素 NAA占主导地位的原因。在培养基中附加适
宜浓度的 KT可提高嫩茎直接分化芽苗的速度，芽苗
形态好、长势强且健壮，这是由于不同植物对不同植
物生长调节剂具有选择性，且由植物自身的基因型控
制，而基因型又决定器官重建。天目铁木快繁的方式
采取嫩茎基部直接分化具有芽苗整齐、分化速度快和
分化率高等优点。
目前，国内外已有很多关于植物种质保存方面的
报道，大多采用植物的细胞团、组织块和芽苗等材料，
利用玻璃化、包埋、低温处理和低温结合弱光照等方
法［13－15］对植物进行种质保存。本研究对天目铁木种
质保存采用嫩茎基部直接再生芽苗诱导形成的丛生
芽团，在添加适宜的 TDZ、KT 和根皮苷的1 /8 DＲ培
养基中，应用“低营养延缓生长”的方法，常温条件下
进行试管苗保存的方式。该法可在试管内保存天目
铁木丛生芽团达 18 个月以上，成本低，可操作性强。
小芽团保存 18 个月后的继续培养表明，小芽团基部
又有大量粗壮芽苗分化出来，并形成丛生芽团，分化
率平均值达 100． 0%，芽苗生长旺盛，发育和苗的质
量均与 2． 1 中分化的芽苗相同。这可能是芽苗在保
存过程中，天目铁木细胞休眠充足，或有利于分化和
促进生长的物质产生等原因。
本研究结果成功建立了天目铁木嫩茎直接诱导
丛生芽和试管苗保存体系。天目铁木是我国国家级
保护的珍贵野生植物资源，至今人工繁育技术和种苗
试管保存一直未得到显著性突破，本结果可为天目铁
木的工厂化育苗、扩大人工种群和种质资源保存奠定
了基础。
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( 责任编辑 吴祝华)
技术开发 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗