全 文 ：• 330 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2011年2月第26卷第2期 CJTCMP, February 2011, Vol . 26, No.2
牛皮消及炮制品HPLC指纹特征及含量测定研究
王静，梅之南，万定荣
（中南民族大学药学院，武汉 430074）
摘要：目的：比较牛皮消饮片生品及米炒炮制品的HPLC指纹特征，为二者提供鉴定依据；对炮制前后所含
成分A（对甲基苯酚）和成分B[17-O-acetyl-kidjoranin-3-O-β-D-digitoxopyrayl-（1→4）-β-D-digitoxopyrayl -
（1→4）-α-L-cymaropyranosyl-（1→4）-β-D-diginopyranosy（1→4）-α-L-cymaropyranoside]进行含量测定研
究，探讨炮制意义。方法：反相高效液相色谱法及中药指纹图谱研究方法。色谱条件：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ
色谱柱（4.6mm×250mm，5µm），乙腈-水溶液梯度洗脱，流速0.3-1.0mL/min，柱温25℃，检测波长210nm。结
果：炮制前后指纹图谱差异明显；炮制后具有刺激性的成分A的含量显著降低。结论：建立的指纹图谱及含量测
定方法为炮制前后饮片鉴别与质量控制提供了重要依据，并初步说明炮制对降低毒副作用有一定意义。
关键词：牛皮消；饮片及炮制品；HPLC指纹特征；含量测定
基金资助：科技部支撑计划项目（No.2007BAI48B08）
Determination and HPLC fi ngerprint characteristics of crude and processed ‘Niupixiao’
WANG Jing, MEI Zhi-nan, WAN Ding-rong
(College of Pharmacy, South-central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)
Abstract: Objective: To compare the HPLC fi ngerprint characteristics between the crude and processed ‘Niupixiao’in
order to provide a scientifi c basis for identifi cation, and to make a preliminary study about signifi cance of the processing through
determination of component A (p-cresol) and B [17-O-acetyl-kidjoranin-3-O-β-D-digitoxopyrayl-(1→4)-β-D-digitoxopyrayl -(1
→4)-α-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-diginopyranosyl(1→4)-α-L-cymaropyranoside] in the crude and processed ‘Niupixiao’.
Methods: Methods of HPLC and TCM fi ngerprint were both applied in this study. The separation was performed on COSMOSIL
5C18-MS-Ⅱ column (4.6mm×250mm, 5µm）, using water-acetonitrile gradient elution, with a fl ow rate of 0.3-1.0mL/min. The
detection wavelength was 210nm. Results: The fi ngerprint characteristics between them showed apparent differences. Component
A with side effects has significantly reduced by processing. Conclusion: The HPLC fingerprints established can be used for
distinguishing crude and processing ‘Niupixiao’, and illustrated that the processing can reduce toxicity.
Key words: Niupixiao; The crude and processed products; HPLC fi ngerprint characteristics; Content determination
Fund assistance: National Science & Technology Pillar Program (No.2007BAI48B08)
通讯作者：万定荣，武汉市武昌民族大道708号中南民族大学药学院，邮编：430074，电话：027-67841196，E-mail：wandr666@163.com
牛皮消是鄂、湘、苏等多省习用药材及我国土家族常用民
族药，土家族多称其为“隔山消”，为萝藦科植物耳叶牛皮消
Cynanchum auriculatum Royle ex Wight的干燥块根。具有补肝
肾、强筋骨、益精血、健胃导滞、解毒利湿等功效[1]。化学成分
及药理研究表明，本品主要药效成分有C21甾苷以及磷脂类、
多种氨基酸等，其总苷有良好的护肝、抗肿瘤、降血脂等作用，
水浸膏及C21甾体酯苷对实验动物有明显的免疫增强作用，醇
提物具有保护胃黏膜作用[2-6]。土家医认为本品有小毒[1]，常用
米炒炮制以达增效及降低毒副作用的目的。为控制饮片生品及
炮制品的质量，考察炮制意义，笔者对其进行了高效液相色谱
（HPLC）指纹特征的比较研究，测定了其炮制前后所含2种有
关成分的含量，为生品及炮制品的鉴别与质量控制提供了可靠
的方法，并初步探讨了炮制意义。
材料与方法
1. 材料
1.1 饮片生品和炮制品（米炒牛皮消） 10批牛皮消样品
均于2008年7月采于湘西土家族苗族自治州不同地点，经万定
荣教授鉴定为萝藦科植物耳叶牛皮消Cynanchum auriculatum
Royle ex Wight的块根。洗净，去除外部粗栓皮，切厚片，晒干，
即得净牛皮消。
米炒牛皮消：将锅烧热，加入大米，用中火炒至冒烟时，投
入饮片生品，拌炒至米呈焦黄或焦褐色，饮片表面呈黄白至浅
·研究报告·
• 331 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2011年 2月第26 卷第 2 期 CJTCMP , February 2011, Vol . 26, No.2
条件，分别在0、2、4、8、12h进样，测定并计算，得其主要共有
峰的相对保留时间的RSD均小于0.49%，相对峰面积的RSD均
小于2.49%。表明供试液的测定结果在12h内稳定。
结果
1. 指纹图谱的建立
1.1 共有色谱峰的确定 对采于湘西州不同地点的10批样
品（饮片生品），按上述方法条件分别制备供试液并测定，对所
得指纹图谱进行分析。结果大部分色谱峰的相对保留时间都能
很好的匹配，再根据各峰的稳定性及峰面积，确定17个色谱峰
为共有峰。并以峰面积较大且较稳定的15号峰（经确认该成分
为化合物B）为参照峰（S）（见图1），将该参照峰的保留时间和
峰面积设为1，计算其它共有峰的相对保留时间与相对峰面积
（表2-表3）。所确定的共有峰可作为牛皮消饮片生品的HPLC
指纹特征峰，用作为牛皮消药材及饮片生品真伪鉴别和质量控
制的依据。
图1 牛皮消生品HPLC指纹图谱共有峰的确定
1
2
3 4
5
6
7 8 9 1011
12
13 14
15(s)
16
17
共有峰
1.759
0.405
1.373
0.314
2.382
1.374
0.347
0.151
0.159
0.257
0.143
0.539
0.131
0.448
1.000
0.173
0.439
1.717
0.553
2.042
0.477
4.586
1.816
0.525
0.355
0.283
0.233
0.187
0.865
0.283
0.317
1.000
0.226
0.524
1.303
0.313
1.210
0.325
1.752
1.108
0.272
0.193
0.202
0.143
0.230
0.690
0.196
0.204
1.000
0.115
0.315
2.107
0.751
1.796
0.831
8.601
2.957
0.95
0.613
0.440
0.510
0.299
1.080
0.454
0.553
1.000
0.464
1.18
3.179
1.796
2.079
1.796
2.691
1.314
0.284
0.266
0.315
1.796
0.181
0.963
0.227
0.278
1.000
0.147
0.44
1.719
0.432
1.257
0.293
2.152
1.397
0.377
0.231
0.135
0.275
0.168
0.538
0.129
0.474
1.000
0.151
0.418
1.725
0.701
1.872
0.946
8.035
2.895
0.957
0.579
0.445
0.522
0.292
1.032
0.459
0.617
1.000
0.468
1.18
1.789
0.375
1.626
0.325
2.317
1.470
0.448
0.269
0.212
0.178
0.227
0.684
0.218
0.294
1.000
0.135
0.379
1.897
0.433
1.613
0.435
3.407
1.633
0.469
0.299
0.252
0.253
0.212
0.760
0.239
0.366
1.000
0.198
0.521
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
表2 牛皮消饮片生品指纹图谱共有峰的相对峰面积
1.796
0.336
1.562
0.336
2.526
1.485
0.458
0.272
0.219
0.155
0.222
0.680
0.222
0.320
1.000
0.139
0.384
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
黄褐色时，及时取出，筛去大米，放凉。每100kg牛皮消饮片，用
大米30kg。
1.2 仪器与试药 Agilent 1200高效液相色谱仪（美国）；
电子分析天平（SARTORIUS AG BP211D）；KQ-500E超声清
洗器（昆山市超声仪器有限公司）。乙腈为色谱纯（美国Tedia
公司，LOT910902）；甲醇为分析纯，水为重蒸水。对照品A、
B分别为对甲基苯酚、17-O-acetyl-kidjoranin-3-O-β-D-
digitoxopyrayl-（1→4）-β-D-digitoxopyrayl -（1→4）-α-L-
cymaropyranosyl-（1→4）-β-D-diginopyranosyl（1→4）-α-L-
cymaropyranoside，均由本课题组分离所得，HPLC归一化法检
测其纯度分别为97.7%和98.0％，可供鉴别与含量测定用。
2. 方法
2.1 对照品溶液的制备 精密称取对照品A 15.0mg至10mL
容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.5mg/mL的对
照品A溶液。精密称取对照品B 6.50mg，精密加入甲醇5mL，摇
匀，再精密吸出1.25mL至25mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，
摇匀，即制成浓度为0.065mg/mL的对照品B溶液。
2.2 供试品溶液的制备 取饮片生品粉末1.0g，精密称定，
置锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，超声提取35min（水温
40℃），滤过，滤液蒸干，用甲醇适量使溶解，移至10mL容量瓶
中，定容，即得。
2.3 色谱条件 色谱柱：C18色谱柱（4.6mm×250mm，5µm，
COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ）；流动相：乙腈与水梯度洗脱，梯度洗
脱程序见表1；柱温：25℃；检测波长：210nm；进样量：10μL；
供试品溶液中的色谱峰在90min内全部出完，故分析时间定为
110min。对照品A、B色谱峰理论塔板数均大于20 000，符合2.4
方法学考察。
时间(min)
乙腈含量(%)
流速(mL/min)
0
3
0.3
5
4
0.5
6
20
1
15
25
1
30
40
1
65
55
1
70
75
1
80
85
1
90
100
1
表1 流动相梯度洗脱程序
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验：取对照品B溶液，按上述色谱条件，连续
进样5次，测定并计算，得该对照品色谱峰保留时间和峰面积的
RSD分别为0.04%、0.82%，表明测定精密度良好。
2.4.2重复性试验：取第1批饮片生品供试液，按上述色谱
条件，连续进样5次，测定，计算，得其主要共有峰相对保留时
间的RSD均小于0.05%，相对峰面积的RSD均小于2.49%。表明
此方法的重复性好。
2.4.3 重现性试验：取第1批饮片生品5份，按供试品溶液制
备方法制得5份供试液，按上述色谱条件，分别进样10μL，测
定并计算，得各供试液主要共有峰的相对保留时间和相对峰面
积的RSD分别均小于0.38%和2.96%。表明此方法重现性好。
2.4.4 稳定性试验：取上述牛皮消生品供试液，按上述色谱
1.2 部分色谱峰的确认 除化合物A、B外，本课题组还分离
并鉴定了另3个单体化合物C-E：化合物C的结构为20-乙酰基开
德苷元3-氧-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→4）-β-D-吡喃葡萄糖
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基-（1→4）-α-L-吡喃加拿大麻糖基-（1→4）-β-D-吡喃加拿
大麻糖基-（1→4）-α-L-吡喃迪吉糖基-（1→4）-β-D-吡喃加
拿大麻糖苷），化合物D的结构为开德苷元3-氧-β-D-吡喃葡
萄糖基-（1→4）-α-L-吡喃加拿大麻糖基-（1→4）-β-D-吡喃
加拿大麻糖基-（1→4）-α-L-吡喃迪吉糖基-（1→4）-β-D-吡
喃加拿大麻糖苷，化合物E的结构为20-甲基丁酰基开德苷元3-
氧-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→4）-α-L-吡喃加拿大麻糖基-（1
→4）-β-D-吡喃加拿大麻糖基-（1→4）-α-L-吡喃迪吉糖基-
（1→4）-β-D-吡喃加拿大麻糖苷。通过以保留时间为依据，确
认3号峰为成分A，15号峰为成分B，10号峰为成分D；化合物C、E
为在个别批次样品中不存在的非共有峰。已确认部分成分的色
谱图，见图2。
1.3 各样品指纹图谱的相似度 分别取来自于湘西州不同
地点的10批样品（饮片生品），按前述色谱条件与方法进行测
定，并将测试数据导入国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹
图谱相似度评价系统》2004年A版相似度软件中，对各样品指
纹图谱（见图3）进行相似度分析。选定上述17个共有峰进行谱
峰匹配，通过中位数矢量建立了牛皮消饮片生品样品的指纹图
谱共有模式，然后将各样品谱图与共有模式进行整体相似度的
评价。结果（见表4）表明有9批样品的相似度都大于0.900，但
第9批样品因略有霉变，相似度小于0.900，说明利用建立的指
纹图谱及相似度指标可作为牛皮消饮片质量控制的重要依据。
2. 生品与炮制品指纹图谱的比较分析
2.1 饮片炮制前后的指纹图谱差异 通过炮制前后指纹图
谱部分峰面积（峰高）的比较可看出，炮制后的10批样品的谱
图中，保留时间较小的色谱峰（成分的极性偏强）的峰面积都
明显降低（尤其是5号峰），说明牛皮消饮片生品经米炒后，使
这一部分成分的含量不同程度地明显降低。但炮制对保留时间
30min后的色谱峰（成分的极性偏弱）影响较小，15号峰（即化
合物B）的峰面积比炮制前略有增高。
2.2 炮制时间对样品指纹图谱的影响 取同批药材饮片3
份，按米炒炮制方法从加入饮片生品至锅内时开始计时，分别
炒5、10、15min，然后按前述条件方法制备供试品溶液，测定不
同的炮制时间对炮制品指纹图谱的影响，结果见图4。可看出炮
制时间越长，保留时间较小（即成分的极性偏强）的成分的色
谱峰的峰高度越低，表明这部分成分的含量随着炮制时间的延
长而逐步降低。
图2 已确认部分成分的饮片生品HPLC谱图
1
3
2
4
5
6
7 8 9
10
11
12
13
14
15
(A)
16
17
(D)
(B)
E
C
共有峰
0.076
0.085
0.210
0.254
0.266
0.281
0.370
0.402
0.633
0.705
0.712
0.768
0.872
0.958
1.000
1.131
1.196
0.079
0.085
0.210
0.253
0.263
0.280
0.365
0.399
0.633
0.704
0.712
0.767
0.871
0.958
1.000
1.130
1.196
0.079
0.085
0.210
0.253
0.264
0.280
0.366
0.400
0.633
0.705
0.712
0.768
0.872
0.958
1.000
1.132
1.197
0.079
0.085
0.211
0.254
0.268
0.282
0.377
0.407
0.633
0.704
0.712
0.767
0.869
0.958
1.000
1.137
1.199
0.079
0.085
0.210
0.253
0.267
0.282
0.378
0.407
0.632
0.703
0.711
0.766
0.870
0.957
1.000
1.137
1.200
0.080
0.085
0.211
0.254
0.268
0.283
0.379
0.408
0.631
0.703
0.710
0.766
0.869
0.957
1.000
1.138
1.200
0.079
0.085
0.210
0.253
0.269
0.283
0.380
0.410
0.636
0.707
0.715
0.770
0.873
0.959
1.000
1.136
1.198
0.080
0.085
0.211
0.254
0.269
0.283
0.380
0.409
0.706
0.713
0.634
0.769
0.872
0.959
1.000
1.137
1.199
0.079
0.085
0.211
0.254
0.268
0.283
0.378
0.407
0.635
0.707
0.714
0.770
0.874
0.959
1.000
1.136
1.199
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
表3 牛皮消饮片生品指纹图谱共有峰的相对峰面积
0.079
0.085
0.211
0.254
0.268
0.283
0.378
0.407
0.635
0.707
0.714
0.770
0.874
0.959
1.000
1.136
1.199
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
10
0.982
批号
相似度
1
0.942
2
0.950
3
0.931
4
0.945
5
0.942
6
0.904
7
0.955
8
0.987
9
0.882
表4 10批牛皮消饮片的相似度
图3 10批样品（饮片生品）的HPLC指纹图谱
注：S1-10代表1-10批样品；R代表指纹图谱共有模式。
图4 不同炮制时间样品的指纹图谱比较
注：S1-S3：米炒时间各为5、10、15 min；S4：生品。
3. 含量测定
3.1 线性关系考察 取对照品A溶液，照前述色谱条件，分
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笔者还实验考察了210、230、254nm 3个检测波长下所得的
HPLC色谱图，发现在230、254nm波长下，峰数目较少且吸收较
弱；在210nm波长下峰的数目最多，峰吸收强度大，未出现基线
漂移。为了体现牛皮消成分的整体特征，故选择210nm作为检
测波长。
本项研究首次确立了牛皮消米炒炮制品的HPLC指纹特
征，建立了所含2种具体成分的含量测定方法，为牛皮消饮片生
品及炮制品的鉴别与质量控制提供了可靠的方法。由于化合物
A（对甲基苯酚）为指纹峰中能确定的刺激性成分，且随着炒制
时间延长，含量显著降低，故以该成分作为控制炮制是否到合适
程度的重要指标之一，确有较大意义。同时，多篇文献报道[4-5]牛
皮消的主要活性成分为甾体皂苷类化合物，具有抗肿瘤作用。
而化合物B为甾体皂苷类成分，因此选作为指纹图谱的参照峰，
并作为含量测定的指标之一，对于本品及炮制品的质量控制有
一定意义。
参 考 文 献
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（收稿日期：2010年7月12日）
别进样2.5、5、10、20、40μL（分别相当于进样量3.75、7.5、
15、30、60μg），测定，记录色谱峰面积。以对照品A进样量X对
峰面积Y进行线性回归，得回归方程为Y= 1759.9X+564.41，相关
系数r=1.0000，说明成分A（对甲基苯酚）在3.75-60.00μg范围
内与峰面积的线性关系很好。
取对照品B溶液，照前述色谱条件，分别进样2.5、10、
20、40、60μL（分别相当于进样量0.16、0.65、1.30、2.60、
3.90μg），测定，记录色谱峰面积。以对照品B进样量X对峰面
积Y进行线性回归，得回归方程为Y=851.26X-6.5399，相关系数
r=1.0000，说明成分B在0.16-3.90μg范围内与峰面积的线性关
系很好。
3.2 加样回收试验 取已知含量的第1批牛皮消饮片生品
粉末1.0g共5份，精密称定，分别精密加入对照品A、B各1.1mg和
1.9mg，参照前述供试品溶液制备的方法，制备供回收率测定的
供试品A、B溶液，按样品测定法测定，计算，结果其平均回收率
分别为98.7%和98.2%，RSD分别为1.28%和1.54%，表明测定方
法的准确度好。
3.3 生品和炮制品有关成分含量测定与分析 按上述供试
品溶液的制备方法分别制得生品和炮制品各10批供试液，进
样，测定，记录各样品中成分A和B色谱峰的峰面积，根据回归
方程计算出各样品中2种成分的含量。
结果（见表5）表明，炮制后各批样品中成分A（对甲基苯
酚）的含量显著降低，一般仅占炮制前的2/3-1/2。该成分是一
种对身体有刺激作用的毒性成分，中毒表现可有烧灼感、咳喘、
喉炎、气短、头痛、恶心呕吐等。米炒后其含量显著降低，初步
说明饮片经炒制确有减毒作用。根据对10批样品的分析，炮
制后每克饮片中所含对甲基苯酚的量（按干燥品计）不应超过
1.20mg。此外，大多批次样品经炮制后，成分B（属C21甾体酯苷
类成分）的测得量明显提高，这是否初步说明炮制对增加药效
成分的溶出有一定意义，尚需进一步研究。
批号
A的含量(mg/g)
B的含量(mg/g)
炮制前
炮制后
炮制前
炮制后
1
1.19
0.82
2.05
2.48
2
1.05
0.96
2.13
2.10
3
1.54
1.12
1.93
2.21
4
1.36
1.12
2.94
2.74
5
0.89
0.45
1.46
2.03
6
2.32
1.03
2.67
2.84
7
1.09
0.64
2.38
2.48
8
1.19
0.71
1.71
1.79
9
1.23
0.92
2.03
2.24
10
1.30
0.88
2.14
2.40
表5 10批饮片炮制前后成分A和B的含量比较
讨论
关于样品提取，本实验曾采用加热回流、超声提取2种方
法进行比较，结果2种提取方法所得样品分析测定结果相当。
故采用操作简便的超声提取法。