全 文 ：基因组学与应用生物学，2009年，第 28卷，第 2期，第 289-292页
Genomics and Applied Biology, 2009, Vol.28, No.2, 289-292
研究报告
Research Report
滇黄芩器官发生与不同继代次数遗传稳定性的 RAPD分析
岑举人 步怀宇 * 王英娟 赵宇玮 贾敬芬
西北大学,西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室,西安, 710069
*通讯作者, buhy@nwu.edu.cn
摘 要 本研究以滇黄芩不带腋芽茎段为外植体，采用不同配比激素的 MS培养基建立了滇黄芩器官发
生，植株再生体系。结果表明，茎段在 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L培养基上培养时，愈伤组织诱导率
达到 100%；以相同培养基进行分化，并在 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基上扩繁丛生芽。在 1/2
MS+IBA 0.2 mg/L培养基诱导生根，扦插继代。利用 RAPD分析不同继代次数再生植株，所用的 39条随机
引物中只有 1条引物带型发生变化。说明经组织培养获得的再生植株遗传稳定，可多次继代培养，为滇黄
芩进一步遗传操作和扩大药材资源奠定基础。
关键词 滇黄芩,植物再生,继代次数,遗传稳定, RAPD
Organogenesis of Scutellaria amoena and Genetic Stability of Regenerated
Plantlet Analyzed by RAPD
Cen Juren Bu Huaiyu * Wang Yingjuan Zhao Yuwei Jia Jingfen
Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Northwest University, Xian, 710069
* Corresponding author, buhy@nwu.edu.cn
DOI：10.3969/gab.028.000289
Abstract Organogenesis and plant regeneration system was established of Scutellaria amoena C.H.Wright on MS
medium with different phytohormones. Non-axillary bud stems fregments were used as the explants. MS medium
added with 2 mg/L 6-BA and 0.5 mg/L NAA was optimal for callus induction. The frequency of callus induction
reached to 100%. Buds were differentiated on the same medium, and grew up on MS medium with 2 mg/L 6-BA,
0.2 mg/L NAA and 20 g/L sucrose. Regenerated shoots were rooted and subcultured on half strength of MS medium
supplemented with 0.2 mg/L IBA. The genetic stability of regenerated plants was analysed using RAPD markers.
The results of RAPD amplification showed that the genetic stability of the regenerated plantlets with repeatedly
subculturing was maintained, though slight variations were found. This suggested that in vitro organogenesis were
a good rapid propagation way to obtain genetic stable descends of Scutellaria amoena C.H.Wright.
Keywords Scutellaria amoena C.H.Wright, Plant regeneration, Repeatedly subculturing, Genetic stability, RAPD
www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.028.000289
基金项目：本研究由陕西省自然科学基金(2007C104)和陕西省教育厅基金(07JK379)资助
中药滇黄芩(Scutellaria amoena C.H. Wright）为
唇形科黄芩属 (Scutellaria)植物滇黄芩 (Scutellaria
amoena C.H.Wright）的根，属国家三级重点保护野生
药材，是西南地区药用黄芩的主流品种，药用历史悠
久(李娅琼等, 2005)。
近年来对中国药典收录的正品黄芩及其有效成
分药理学特性的研究日趋深入。但相关研究报道多是
正品黄芩，其他种类黄芩的研究报道很少(梁英和韩
鲁佳, 2003)。药典以黄芩中具有明显药理作用的黄芩
苷的含量作为检测黄芩的质量标准。滇黄芩中黄芩苷
含量经 HPLC测定为 17. 90%，高于黄芩的 13.16%
(刘美兰等, 2002)，因此，滇黄芩是高质量的黄芩替代
品，开发滇黄芩具有较大的药用价值及开发潜力。
目前滇黄芩以野生资源为主，因种子直播后出
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
苗不齐，未能形成规模化种植 (孔祥鹤和魏朔南 ,
2008)。植物组织培养技术在保护药用植物野生资
源、生产药物有效成分方面发挥了重要的作用(高
文远和肖培根 , 2008)。赵振玲等(2006)和李娅琼
等(2007)曾分别报道过滇黄芩体胚诱导再生植株
和组培快繁，但未见滇黄芩器官发生途径再生植
株的报道。本实验以滇黄芩不带腋芽茎段为材料，
建立离体再生体系，并通过 RAPD分析对组培过程
中再生植株的变异进行初步的分子检测，为滇黄芩
进一步遗传操作，扩大药用资源奠定基础。
1材料与方法
1.1植物材料
滇黄芩采自西北大学生物园，选取新发出的植
株不带腋芽茎段和叶片为外植体。
1.2滇黄芩愈伤组织的诱导和分化培养
将茎段和叶片外植体清水冲洗后，75%乙醇浸泡
30 s，然后 0.1% HgCl2浸泡 8 min灭菌，无菌水冲洗 5
次，置于无菌滤纸上吸干水分。将叶片切成 0.5 cm×
0.5 cm小块，茎段切成 0.5 cm长的切段，分别接种于
附加不同浓度 NAA和 6-BA，3%蔗糖的 MS培养基
(表 1)上进行愈伤组织诱导。外植体每种培养基接种
60块。培养温度 25±2℃，光照强度 30~40 Lax，16 h/
8 h光 /暗培养。20 d后观察外植体的愈伤组织状态，
统计愈伤组织诱导率。
将生长旺盛的愈伤组织转移到新鲜分化培养基
上诱导芽的分化。
1.3再生苗生根、扦插繁殖与移栽
将分化出芽点的滇黄芩愈伤组织分成大小均匀
的小块，继代培养，分化丛生芽。待生长状态良好的小
苗长至 2~3 cm，切下接种于 1/2 MS，MS及附加 IBA
的培养基上诱导生根。将所得到的完整再生植株进行
植株扩增繁殖及连续继代培养，以 40 d为继代周期。
选取苗高约 5 cm，根系发达再生苗炼苗后，移栽
于营养盆钵中培养(李娅琼等, 2007)。
1.4不同继代次数的再生植株 RAPD分析
分别称取不同继代次数的扦插再生苗叶片 0.5 g，
采用 CTAB 法(顾红雅和瞿礼嘉, 1998)提取基因组
DNA。选用随机引物(购自上海 Sangon公司)对所提取
的DNA样品进行 RAPD分析。PCR反应体积 20μL；
10×Buffer (含 Mg2+) 2 μL；dNTP (10 mmol/L) 2 μL；
Primer (10mmol/L) 2μL；DNA模板 20 ng；Taq酶 1 U。
反应程序为：94℃预变性 5 min，36℃退火 60 s，72℃
延伸 90 s，1个循环；94℃变性 50 s，36℃退火 50 s；
72℃延伸 60 s，40次循环；72℃延伸 8 min。扩增产
物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳，观测结果。
2结果
2.1滇黄芩愈伤组织的诱导
滇黄芩不带腋芽茎段接种于 9种不同激素组合
的培养基上(表 1)，培养 20 d后均能诱导产生愈伤组
织，但愈伤组织诱导启动的时间及生长状态有所不
同。在附加 6-BA 2.0 mg/L和 NAA 0.5 mg/L的 6号
培养基，滇黄芩茎段接种到培养基上 3 d后，两端开
始膨大启动脱分化(图 1A)，约 10 d后，整个外植体明
显膨大，可见浅黄色的愈伤组织，诱导率达 100%。愈
伤组织生长初期多为浅黄色，逐渐转化为黄绿色，增
殖速度快(图 1B)。在 4、5号培养基愈伤诱导率达到
80%，相对出愈时间晚，5~7 d时开始在两端切口处形
成浅黄色的愈伤组织，但继代培养 2周后进入增殖高
峰；其他培养基愈伤组织呈黄白色，生长缓慢。
叶片外植体在上述培养基中接种后陆续褐化死
亡，未诱导出愈伤组织。
表 1不同激素配比对愈伤组织诱导和芽分化的影响
Table 1 Effect of different phytohormone combinations on callus
induction and buds differentiation of Scutellaria amoena
注: A:激素配比(mg/L); B:愈伤组织诱导率(%); C:芽分化率
(%); D: 玻璃化现象 ; MS 基本培养基 : MS+0.7%琼脂 ; pH
5.8~6.2; +:玻璃化现象微有; ++:玻璃化现象较轻; +++:玻璃
化现象严重; ++++:玻璃化现象极重
Notes: A: Exogenous hormone combinations (mg/L); B: Induc-
tion frequency of callus (%); C: Differentiation frequency of buds
(%); D: Vitrification; MS medium: MS+0.7% agar, pH 5.8~6.2;
+ : Vitrification was little; ++ : Light; +++ : Serious; ++++ : Very
serious
培养基编号
Serial No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
6-BA
0.5
0.5
1.0
1.0
2.0
2.0
2.0
3.0
3.0
NAA
0.1
0.5
0.2
0.5
0.2
0.5
1.0
0.5
1.0
B
30.0
23.3
53.3
80.0
83.3
100.0
66.7
53.3
46.7
C
41.2
55.3
60.6
66.7
94.2
100.0
100.0
100.0
89.1
D
+
+
+ +
+ +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + + +
A
www.genoapplbiol.org
DOI：10.3969/gab.028.000289
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2.2滇黄芩不定芽的分化培养
滇黄芩茎段愈伤组织继代培养在上述 1~9号培
养基上，愈伤组织由生长初期的黄色，逐渐转化为黄
绿色，表面长出绿色的芽点(图 1C)。在含 2.0 mg/ L
6-BA的 5~7号培养基上，芽点生长迅速且其表面分
化出大量的丛生芽。培养 20 d左右时，芽不断增多，
整块愈伤组织遍布丛生芽和小苗(图 1D-a)。而其它
几种培养基随 6-BA浓度的降低和升高，不定芽形
成时间延长，数量减少。说明适合浓度的 6-BA对芽
的萌发和增殖作用明显。在 5~9号培养基培养过程
中发现，芽丛和小苗可以迅速增殖，但都有一定程度
的玻璃化现象，其中随着 6-BA浓度的增加，玻璃化
现象渐趋严重。试验中将培养基中 3%的蔗糖浓度降
低为 2%，NAA调整为 0.2 mg/L时对克服玻璃化有一
定作用。综合实验结果，确定在 6-BA 2.0 mg/ L和
NAA 0.5 mg/L，附加 3%蔗糖的 6号培养基中快速分
化芽丛，选用 6-BA 2.0 mg/L+0.2 mg/L NAA附加 2%
蔗糖的 5号培养基对已分化的丛生苗进行伸长生长。
在诱导芽的过程中，发现极少数茎段经培养后，
其形态学上端切口处膨大，但愈伤组织生长不明显，
20 d左右时，这些膨大突起就分化出芽(图 1E)。随后
产生幼叶，并进一步长成苗(图 1D-b)，该途径未经愈
伤组织阶段直接从茎段分化出苗，为典型的直接器
官发生途径。
2.3滇黄芩试管苗的生根培养
将增殖后生长状态良好、长约 2~3 cm的丛生苗
进行生根培养，发现滇黄芩试管苗可以在不附加任
何激素的 1/2 MS及 MS培养基上诱导生根，两者没
有明显差别，生根率可达 70%以上，但根的量少质
弱，不利于试管苗的移栽。而附加 0.2 mg/L IBA的培
养基有利于苗的生根，生根率均为 100%，数目较多。
同时发现 3%蔗糖比 2%蔗糖更有利于生根，此时根
系相对粗壮。因此生根最适培养基为 1/2 MS附加
0.2 mg/L IBA (图 1F)。
2.4滇黄芩试管苗扦插和移栽
组培再生苗剪成 2~3 cm 含有 1~2 个叶片的小
段，扦插到生根培养基上，进行植株扩增。40 d继代
培养一次。将生长健壮、根系发达再生植株进行移
栽，3、4周后小苗伸长并有新叶长出，说明小苗已成
活，但移栽成活率相对较低，只达 40%左右，生长未
见形态异常。
2.5不同继代次数滇黄芩再生植株的 RAPD 分析
分别提取连续 5次继代试管苗(继代周期 40 d)
的基因组 DNA，利用上海生工公司生产的 40 条
RAPD 随机引物(编号 S21~S40, S101~S120)对不同
继代次数的滇黄芩组培再生植株进行 RAPD分析。
结果显示，39条随机引物可扩增出清晰的扩增产物，
条带数在 1~12条之间，总条带为 205条，平均 5.27
条。 S34 引物未能扩增出条带。39 条引物中只有
S105扩增产物在不同继代次数的滇黄芩再生苗中表
现明显的条带数目差异，其中在第一代和第二代扩
增出 4条产物带，在继代培养 3次后，第 2条扩增条
带消失，只扩增三条带。其余 38条引物扩增条带数
目完全相同，特征带型表现一致(图 2)。从 RAPD分
析结果可以看出，滇黄芩茎段经离体再生和多次继
代培养后，DNA水平上存在一定程度变异，但变异
图 1滇黄芩器官发生过程
注: A:茎段膨大; B:愈伤组织; C:分化丛生芽; D: a :愈伤组织
诱导分化丛生芽, b:直接器官发生芽; E:茎段直接器官发生形
态; F:再生植株
Figure 1 Organogenesis and plantlet regeneration of Scutellaria
amoena
Note: A: Stem fregment explants; B: Calli; C: Cluster buds differ-
entiated from calli; D: a: Indirect-orgenogenesis of calli, b: Di
rect-orgenogenesis of stem fregment; E: Direct-orgenogenesis of
stem fregment; F: Regenerated plants obtained in indirect-orgeno-
genesis way
图 2不同继代次数的再生植株 RAPD扩增结果
注: 1~5:滇黄芩试管苗继代次数
Figure 2 RAPD amplification results of regenerated plantlets with
different subculturing times of Scutellaria amoena
Note: 1~5: Times of subculturing
滇黄芩器官发生与不同继代次数遗传稳定性的 RAPD分析
Organogenesis of Scutellaria amoena and Genetic Stability of Regenerated Plantlet Analyzed by RAPD
291
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
程度相当小。可见滇黄芩离体培养时间没有引起植
物体细胞无性系的明显变异，它的继代培养是一种
遗传相对稳定的快繁方式。
3讨论
滇黄芩种子成熟一粒掉一粒，不便收集，并且种
子直播后出苗不齐，已有报道通过体胚发生和快速
繁殖等生物技术手段繁殖试管苗解决这一难题(李
娅琼等, 2005;赵振玲等, 2006)。本研究通过诱导不
带腋芽茎段产生愈伤组织，获得高效稳定的间接器
官再生体系。
滇黄芩茎段诱导愈伤组织和芽分化过程中，发
现 6-BA和 NAA的浓度及其配比起着关键性作用。
在含 6-BA 2.0 mg/L，NAA 0.5 mg/L的MS培养基上
20 d左右获得愈伤组织，在相同培养基中继代培养可
获得大量丛生苗。丛生苗在分化时，曾出现玻璃化现
象，可以通过增加琼脂用量来调整培养基硬度克服玻
璃化(赵振玲等, 2006)，在试验中我们通过降低蔗糖浓
度，调整 NAA浓度也可以减少试管苗玻璃化。
植物离体培养时间是影响植物体细胞无性系变
异的因素之一，DNA分子水平检测生物遗传稳定性
在很多植物的研究中取得成功。刘石泉等(2007)利用
RAPD技术对铁皮石斛单蒴果种子内不同无性繁殖
代数遗传稳定性研究表明，组织培养过程中变异甚
微。我们对继代 5次的滇黄芩组培苗的 RAPD分子检
测结果也显示出，多次的继代培养后滇黄芩组培苗保
持高的遗传稳定性；而组培过程中在第 3代出现的变
异，仍在第 4代和第 5代中保持，在一定程度上说明
组培过程中出现的变异是在前一代的基础上累积起
来的，这与利用分子标记检测霍山石斛不同继代次数
试管的遗传稳定性的结果相符(邱婧等, 2008)。
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