全 文 ：第１０卷第３期
２０１１年５月
杭州师范大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈａｎｇｚｈｏｕ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）
Ｖｏｌ．１０Ｎｏ．３
Ｍａｙ　２０１１
收稿日期：２０１１－０１－１３
基金项目：浙江省卫生厅科技计划项目（２００９Ｂ１２４）．
作者简介：李　霞（１９８１—），女，黑龙江肇东人，讲师，博士，主要从事天然产物的分离研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｘ７５４＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－２３２Ｘ．２０１１．０３．０１３
番薯过氧化物酶的分离纯化及其性质研究
李　霞，韩　凤，何　睿，焦艳华，梁媛媛，陈灿玉，谢　恬
（杭州师范大学生物医药与健康研究中心，浙江 杭州３１００１２）
摘　要：从番薯皮中分离和纯化番薯过氧化物酶，对其酶学性质进行表征，分析了温度、ｐＨ对酶促反应的
影响，考查了酶的热稳定性、酸碱稳定性．分离纯化过程包括匀浆、水提、双水相萃取、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ－６Ｂ凝胶层
析、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ疏水层析、Ｃｏｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ亲和层析．经纯化的番薯过氧化物酶比活力为
６　９３０Ｕ／ｍｇ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示一条带，分子量为３４　０００，ＲＺ值为２．酶反应的最适ｐＨ在５．５附近，最适温度为
７０℃；在中性偏碱性条件下酶的稳定性非常高，６０℃保温１ｈ，酶活力残余６０％．结果表明番薯过氧化物酶是一
种良好的耐酸碱、耐热过氧化物酶．
关键词：番薯；过氧化物酶；纯化与性质
中图分类号：Ｑ５５４＋．６　　　　　文献标志码：Ａ
文章编号：１６７４－２３２Ｘ（２０１１）０３－０２５３－０５
过氧化物酶是一类可催化由过氧化氢参与的氧化各种还原剂的氧化酶，广泛存在于动物、植物和微生
物体内，可应用于酶免疫测定、药物诊断、生物传感器、有机合成、水污染治理等［１］．辣根过氧化物酶
（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＨＲＰ）最早被作为标记酶，广泛应用于化学发光酶联免疫分析（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ
ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＬ－ＥＬＩＳＡ）中．但 ＨＲＰ在催化Ｌｕｍｉｎｏｌ－Ｈ２Ｏ２ 发光体系中，与发光底物反应不稳
定，信号衰减迅速，需添加增强剂加强发光强度才能满足检测要求，并且高温条件下不稳定．近年来相继发
现一些植物过氧化物酶，如 Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ　ｒａｍｏｎｕｓ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＡＲＰ）［２］、ｐａｌｍ　ｔｒｅｅ　ｌｅａｖｅｓ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
（ＰＴＰ）［３］和ｓｏｙａ　ｂｅａｎｓ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＳｂＰ）［４－５］，不需要增强剂即可催化鲁米诺发光底物发光，且发光灵敏度
高，发光时效长．其中ＳｂＰ是继 ＨＲＰ后研究最为深入的，国外已有公司将其用于医药诊断试剂盒的生产．
２００７年，Ａｌｐｅｅｖａ和Ｓａｋｈａｒｏｖ［６］发现番薯过氧化物酶（ｓｗｅｅｔ　ｐｏｔａｔｏ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＳＰＰ）催化鲁米诺发光具
有更高的灵敏度，且发光时间长，稳定性高．该文主要报道了从本地番薯皮中纯化过氧化物酶的方法及其
酶学性质的研究结果，为番薯过氧化物酶的进一步开发和应用提供参考．
１　材料与方法
１．１　材料
浙江杭州本地产番薯（Ｉｐｏｍｏｅａ　ｂａｔａｔａｓ　Ｌａｍ．）．
１．２　试　剂
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ－６Ｂ（ＧＥ），Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ（ＧＥ），Ｃｏｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ（ＧＥ），α－甲基－Ｄ－甘
露糖苷（阿拉丁），ＰＥＧ　６０００（Ｊａｐａｎ分装，北京鼎国），愈创木酚（ＢＢＩ），３０％过氧化氢（杭州高晶精细化工
有限公司），考马斯亮蓝－Ｒ２５０（ＵＳＢ）．其它常规试剂均为国产分析纯．
１．３　仪　器
ＡＫＡＴ层析系统，北京六一ＤＹＹ－６Ｃ型电泳仪器，德国ＣＨＲＩＳＴ　ＡＬＰＨＲ　１－２ＬＤ　ＢＰＬＵＳ冻干机，
ＵＮＩＣＯ　２８００ＵＶ∕ＶＩＳ分光光度计，美国ＧＥ　ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ　３００凝胶成像分析系统，美国Ｂｅｃｋｍａｎ高速冷
冻离心机，Ａｌｅｇｒａ　Ｘ－２２Ｒ离心机．
１．４　纯化方法
１．４．１　双水相萃取
取新鲜番薯皮（１ｋｇ），组织捣碎，加入４倍体积的水浸提，过滤，残渣重复提取两次，合并滤液，５　０００ｒ／ｍｉｎ
离心３０ｍｉｎ．收集上清，搅拌条件下缓慢加入ＰＥＧ　６０００和（ＮＨ４）２ＳＯ４，使两者最终质量浓度分别达到６０ｍｇ／ｍＬ
和３００ｍｇ／ｍＬ，约１ｈ内加完，置入分液漏斗中静置分层．收集下相液体，透析除盐，冻干，保存．
１．４．２　凝胶层析Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ－６Ｂ（２．６ｃｍ×６０ｃｍ）
流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ，蒸馏水洗脱．测定酶活，收集有酶活的部分，冻干．
１．４．３　疏水层析Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ（１．６ｃｍ×３０ｃｍ）
流速１ｍＬ／ｍｉｎ，依次用１．０，０．５，０ｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４ 溶液洗脱．测定酶活，收集有酶活的部分，透析
除盐，冻干．
１．４．４　亲和层析Ｃｏｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ（１．６ｃｍ×２０ｃｍ）
流速１ｍＬ／ｍｉｎ，亲和柱首先用ｐＨ 为７．４的 Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液（含１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｎＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌ
ＣａＣｌ２、０．１５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）平衡．将预分离组分经上述结合缓冲液溶解后上样吸附．用ｐＨ 为７．４的
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液（含１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｎＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２）洗去未结合部分，最后用ｐＨ为７．４的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ
缓冲液（含０．２ｍｏｌ／Ｌα－甲基－Ｄ－甘露糖苷、０．１５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）洗脱．测定酶活，合并有酶活的部分，透析除
盐，冻干，保存．
１．５　分析方法
１．５．１　酶纯度和蛋白含量测定
以ＲＺ值表示酶的纯度．ＲＺ＝Ａ４０３∕Ａ２７５，４０３ｎｍ处是血红素辅基的吸收峰，２７５ｎｍ处是蛋白质的吸
收峰．以牛血清蛋白为标准品，考马斯亮蓝染色法［７］测定蛋白含量．
１．５．２　酶活测定
愈创木酚法检测，２．０ｍＬ的磷酸盐缓冲液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ 为６．０，含４５ｍｍｏｌ／Ｌ愈创木酚和
５ｍｍｏｌ／Ｌ过氧化氢），５０μＬ酶液，２５℃ 下检测４７０ｎｍ处的吸光度变化（ΔＡ４７０／ｍｉｎ）．以２５℃下每分钟
转化１μｍｏｌ底物定义为一个酶活单位．
１．５．３　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳
按文献［８］进行，采用１２％分离胶，５％的浓缩胶，考马斯亮蓝染色．
１．６　酶的理化性质测定
１．６．１　ｐＨ对酶促反应的影响
以不同ｐＨ的柠檬酸－磷酸盐缓冲液配制底物，于２５℃测定不同ｐＨ时反应初始的ΔＡ４７０／ｍｉｎ．实验
ｐＨ设定为２．２，３，４，５，６，７和８．
１．６．２　温度对酶促反应的影响
分别把９０ｍｍｏｌ／Ｌ愈创木酚溶液和１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｈ２Ｏ２ 溶液于测试温度进行保温，测试时各取２ｍＬ等体
积混合，立刻加待测酶液５０μＬ，测定反应初始的ΔＡ４７０／ｍｉｎ．实验温度设定为１５，３０，４５，６０，７５和９０℃．
１．６．３　热稳定性
酶液分别在４０，６０，７０和８０℃水浴１ｈ后立即冷却至２５℃检测酶活，以４℃保存１ｈ后的酶活为
１００％对照求相对酶活．
４５２ 杭州师范大学学报（自然科学版） ２０１１年　
１．６．４　酸碱稳定性
酶液分别保存在ｐＨ为２．２，４，６，７．４和８的柠檬酸－磷酸盐缓冲液和ｐＨ为１０的甘氨酸－氢氧化钠缓冲
液中，４℃保存２４ｈ后检测酶活．以４℃保存在ｐＨ为７．４的磷酸盐缓冲液中的酶液为对照计算相对酶活．
２　结果与讨论
２．１　番薯过氧化物酶的纯化和纯度鉴定
番薯皮经匀浆、水提后采用ＰＥＧ　６０００—（ＮＨ４）２ＳＯ４ 双水相体系进行萃取，溶液分为上下两相：上相
为深褐色油状液体，主要为ＰＥＧ　６０００和色素等物质；下相为浅色液体，主要成分为（ＮＨ４）２ＳＯ４ 和蛋白．
经过双水相萃取后色素等杂质大部分除去．双水相萃取后，进行Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ－６Ｂ凝胶层析（图１），出现两
个洗脱峰，活性蛋白集中在第二个峰中．收集该酶活组分，进行Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ疏水层析（图
２），活性部分集中在第二个峰，为０．５ｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４ 溶液洗脱峰．收集该酶活组分，进行Ｃｏｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂ亲和层析（图３），活性部分为第三个峰，经纯化后酶的比活提高１６５倍，活力回收为１７％，ＲＺ值为２（表
１）．纯化的过氧化物酶经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，考马斯亮蓝染色，显示一条蛋白带，分子量为３４ｋＤａ（图４）．
表１　番薯过氧化物酶的纯化
Ｔａｂ．１　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｗｅｅｔ　ｐｏｔａｔｏ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
步骤 总蛋白／ｍｇ 总酶活／Ｕ 比活力／（Ｕ·ｍｇ－１） 纯化倍数 回收率／％ ＲＺ值
粗酶液 ５　８００　 ２４３　６００　 ４２　 １　 １００　 ０．００２
双水相萃取 ６７０　 １２４　６２０　 １８６　 ４　 ５１　 ０．０５
凝胶层析 １５６　 ９８　５９２　 ６３２　 １５　 ４０　 ０．２
疏水层析 ３０　 ８８　９８０　 ２　９６６　 ７０　 ３６　 １
亲和层析 ６　 ４１　５８０　 ６　９３０　 １６５　 １７　 ２
５５２　第３期 李　霞，等：番薯过氧化物酶的分离纯化及其性质研究
２．２　酶的理化性质
２．２．１　ｐＨ对酶促反应的影响
图５结果表明，番薯过氧化物酶的ｐＨ作用范围很宽，以愈创木酚为底物最适ｐＨ在５．５附近．
２．２．２　温度对酶促反应的影响
如图６所示，温度在３０～６０℃之间番薯过氧化物酶的活性几乎呈直线上升，在７０℃左右达到最高，
然后迅速下降．实验表明，番薯过氧化物酶在高温下有很好的活性，反应最适温度在７０℃附近．
２．２．３　热稳定性和酸碱稳定性
如图７所示，番薯过氧化物酶的热稳定性相当高，６０℃保存１ｈ后仍有６０％的酶活剩余．图８所示番
薯过氧化物酶的酸碱稳定性比较好，在ｐＨ 为２处保存２４ｈ酶仍有活性，在中性偏碱的条件下稳定性
更高．
２．３　讨　论
该文介绍了从番薯皮中分离纯化过氧化物酶的方法，得到一种性质优良的番薯过氧化物酶．以愈创木
酚作为底物进行测定，结果表明番薯过氧化物酶有很宽的ｐＨ作用范围和很广的温度适用范围，在７０℃
下仍有很好的活性．过氧化物酶已经广泛应用于食品、医药、环保和化工等行业中，酶的理化性质，如最适
ｐＨ、最适温度以及热稳定性和酸碱稳定性，在其应用中很重要．不同来源的过氧化物酶理化性质不一
样［９］，目前商品化的 ＨＲＰ酸碱耐受性较差，且热稳定性也不高［５］．与 ＨＲＰ相比，番薯过氧化物酶是一种
良好的耐酸碱、耐热的过氧化物酶，可以弥补 ＨＲＰ的不足，能够替代 ＨＲＰ应用在更广的领域内．
纯化过程中采用的双水相萃取技术是近年来发展并应用于生物大分子制备的新技术，其代替经典盐
析法纯化过氧化物酶具有实验条件温和、操作简单、收率高、易于大量纯化蛋白等优点［１０］．植物中富含色
素，在双水相萃取后色素集中在上相的有机相中，过氧化物酶主要集中浓缩在下相的盐溶液中，由此可以
有效地去除粗酶中的色素杂质．
６５２ 杭州师范大学学报（自然科学版） ２０１１年　
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ｃｏｕｐｌｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｅｌ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｎｓｔｒｙ，１９９９，３５（１／２）：４３－４８．
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｗｅｅｔ　Ｐｏｔａｔｏ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
ＬＩ　Ｘｉａ，ＨＡＮ　Ｆｅｎｇ，ＨＥ　Ｒｕｉ，ＪＩＡＯ　Ｙａｎ－ｈｕａ，ＬＩＡＮＧ　Ｙｕａｎ－ｙｕａｎ，ＣＨＥＮ　Ｃａｎ－ｙｕ，ＸＩＥ　Ｔｉａｎ
（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００１２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｔｈｅ　ｓｗｅｅｔ　ｐｏｔａｔｏ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｓｗｅｅｔ　ｐｏｔａｔｏ　ｐｅｅｌ　ｏｆ　Ｉｐｏｍｏｅａ
ｂａｔａｔａｓ．Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ，ｗａｔｅｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ａｑｕｅｏｕｓ　ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ－６Ｂｇｅｌ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ　ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　Ｃｏｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂａｆｆｉｎｉｔｙ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｗａｓ　６　９３０ Ｕ／ｍｇ．Ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈ　ｏｆ　ｓｗｅｅｔ　ｐｏｔａｔｏ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｗａｓ　ｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　３４　０００ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｓ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｂａｎｄ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ＲＺ　ｖａｌｕｅ　ｗａｓ　ａｂｏｕｔ　２．０．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ
ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｆｏｒ　ｅｎｚｙｍｅ　ｒｅａｃｔｒｏｎ　ｗａｓ　ａｔ　ｐＨ　５．５ａｎｄ　７０℃ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｗａｓ　ｓｔａｂｌｅ　ｉｎ　ｐＨ
２．２～１０．Ａｔ　６０℃，ｉｔ　ｔｏｏｋ　１ｈｔｏ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｅ　６０％ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ　ｓｗｅｅｔ　ｐｏｔａｔｏ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｉｓ　ｖｅｒｙ
ｓｔａｂｌｅ　ａｔ　ｈｉｇｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｅｘｔｒｅｍｅ　ｐＨ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｉｐｏｍｏｅａ　ｂａｔａｔａｓ；ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
７５２　第３期 李　霞，等：番薯过氧化物酶的分离纯化及其性质研究