全 文 ：剑麻是一种极具特色的热带纤维作物， 它不仅
是主要的热带纤维原料 [1]， 同时剑麻茎心也是酿造
龙舌兰酒的主要原料 [2]。 此外， 剑麻汁液含有较高
皂素， 可用来制药 [3]， 同时剑麻也可视为是一种重
要的生物质能源作物 [4-5]， 经济价值高。 剑麻是营
养体繁殖为主的植物， 组培快繁是其重要的繁殖手
段之一， 然而， 在剑麻植株再生过程中发现， 不定
芽玻璃化比较严重， 玻璃化的植株常呈透明或半透
明水渍状， 叶片卷曲、 膨大变厚且易碎， 最终因无
法正常生长而死亡 [6-7]（图 1-c)。 张燕梅等 [8]曾通过
改良培养基来克服剑麻再生植株玻璃化问题， 但对
于引起玻璃化的原因及机制还不是十分清楚。 针对
上述现象， 本研究从生理和细胞学水平对玻璃化的
剑麻进行了研究， 旨在为探讨剑麻玻璃化的发生机
热带作物学报 2016， 37（10）： 1908-1913
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2016-05-25 修回日期 2016-08-01
基金项目 国家自然科学基金（No. 31401427）； 海南省自然科学基金（No. 314112）； 国家麻类产业技术体系项目（No. CARS-19）； 湛江市热
带作物遗传改良重点实验室建设项目（No. 2015A06005）； 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所基本科研业务费专项资助
（No. 1630062016019）。
作者简介 张燕梅（1975年—）， 女， 博士， 副研究员; 研究方向： 作物育种。 *通讯作者(Corresponding author)： 周文钊(ZHOU Wenzhao)， Ｅ-mail：
zwenzhao@163.com。
%
剑麻不定芽玻璃化过程中的细胞学
和生理变化研究
张燕梅， 李俊峰， 陆军迎， 鹿志伟， 周文钊 *
中国热带农业科学院南亚热带作物研究所
海 南 省 热 带 作 物 营 养 重 点 实 验 室
湛江市热带作物遗传改良重点实验室
广东湛江 524091
摘 要 玻璃化问题是植物组织培养过程中的普遍现象， 已成为植物组织快速繁殖的瓶颈。 本研究以 H.11648
为材料 ， 分析 H.11648 不定芽玻璃化过程中气孔形态 、 DNA 含量 、 叶片含水量 、 可溶性蛋白含量 、 丙二醛
（MDA)含量以及过氧化氢酶（CAT）、 过氧化物酶（POD）、 抗坏血酸过氧化物酶（APX）和超氧化物歧化酶（SOD）等
防御酶活性变化情况， 结果表明： 玻璃化后的不定芽叶片保卫细胞膨大， 气孔变大。 体细胞 DNA 含量没有变
化， 但细胞数减少。 随着玻璃化程度的增加， 叶片含水量显著增加， 可溶性蛋白和丙二醛含量明显降低， POD
活性显著上升， SOD 活性先上升后又略有下降， 但均显著高于正常水平， APX 活性先明显上升后又恢复到正常
水平， CAT 活性略有下降但不显著。 本研究为揭示剑麻不定芽玻璃化的生理机制提供参考。
关键词 剑麻； 不定芽； 玻璃化
中图分类号 S563.8 文献标识码 A
Cytological and Physiological Changes During Hyperhydricity in
the Culture of Adventitious Shoots of H.11648
ZHANG Yanmei, LI Junfeng, LU Junying, LU Zhiwei, ZHOU Wenzhao*
South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Provincial
Key Laboratory for Tropical Crops Nutrition / Zhanjiang City Key Laboratory for Tropical Crops genetic improvement,
Zhanjiang, Guangdong 524091, China
Abstract Hyperhydricity is a serious problem during in vitro culture of plant, and it is considered as a bottleneck
to micropropagation of plants. Stomata form and DNA content, water content, concentrations of soluble protein and
malonyldialdehyde, the activities of antioxidative enzymes, e.g. peroxidase (POD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase
(APX) and superoxide dismutase (SOD), were examined in adventitious shoots of H.11648. The results showed that
guard cell expanded and the pore surrounded by the guard cues in hyperhydric leaves were more rounded in contrast
to the elliptical pore in normal leaves. The DNA content was not changed while cell number decreased after hyperhydriciting.
Hyperhydric shoots had higher water content， lower soluble protein and MDA concentration than normal shoots.
The activities of antioxidant enzymes, such as POD and SOD significantly increased in hyperhydric shoots than in
healthy shoots. CAT showed a slight decrease in activity in the hyperhydric leaves than in healthy leaves, APX
activity significantly increased at H1 stage and then recovered normal levels at H2 stage. The results would
provide a reference for revealing the physiological mechnism of hyperhydricity of adventitious shoots of H.11648.
Key words H.11648; Adventitious shoots; Hyperhydricity
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.010
第 10 期 张燕梅等： 剑麻不定芽玻璃化过程中的细胞学和生理变化研究
a为正常植株（H0）， b为部分玻璃化植株（H1）， c为完全玻璃化植株（H2）。
a Normal shoots, b Partly hyperhydric shoots (H1), c All hyperhydric shoots (H2).
图1 正常和玻璃化的剑麻不定芽
Fig. 1 Normal and hyperhydric adventitious shoots of H.11648
H0 H1 H2
a b c
理和控制玻璃化的发生提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
以主栽品种 H.11648为试材， 将其愈伤组织接
种于不定芽诱导培养基上， 不定芽诱导培养基参照
张燕梅等[9]的方法。 待不定芽长至 2~3 cm 时， 采取
叶片并按照玻璃化程度进行分级， 其中 0级为正常
不定芽（H0）， Ⅰ级为叶片玻璃化面积占总面积的
1/2 及以下（H1）， Ⅱ级为叶片玻璃化面积占总面积
的 1/2以上（H2）（图 1）。
1.2 方法
1.2.1 含水量测定 分别取 0 级、 Ⅰ级和Ⅱ级的
叶片 1 g（G0）， 装入牛皮纸袋中， 于 80 ℃烘箱中烘
干至恒重（G1）， 按下式计算叶片含水量：
叶片含水量/（g/g FW）=[（G0-G1）/G0]×100％
1.2.2 可溶性蛋白含量（μg/g）测定 分别取 0 级、
Ⅰ级和Ⅱ级剑麻叶片 0.5 g， 采用考马斯亮蓝 G-250
染色法进行测定， 具体参照高俊凤[10]的方法。
1.2.3 叶片下表皮气孔特征观察 取 0级、 Ⅰ级和
Ⅱ级剑麻叶片， 在显微镜（Nikon ECLIPSE 80i）下观
察叶片下表皮气孔特征。 具体参照张燕梅等[11]的方法。
1.2.4 流式细胞仪检测 取0级、 Ⅰ级和Ⅱ级剑麻
不定芽， 采用流式细胞仪（Beckman）测定正常不定
芽与玻璃化不定芽体细胞 DNA 的相对含量。 具体
参照 Palomino 等 [12]方法进行。 DNA 含量由中国热
带农业科学院热带作物品种资源研究所检测。
1.2.5 防御酶活性测定 分别取 0 级、 Ⅰ级和Ⅱ
级的剑麻不定芽 0.5 g， 加入 2 mL 提前预冷的酶
液提取液后于冰浴下研磨成浆 ， 再加提取液冲
洗 2~3次（总体积为 5 mL）， 转入离心管中， 于 4℃
10 000 r/min下离心 15 min， 取上清液分装后于 4℃
保存备用。
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定参考孙云
等[13]的方法， 以每分钟氧化 1 μmol 抗坏血酸（AsA）
的酶量为一个酶活单位 （U) 。 超氧化物歧化酶
（SOD）活性测定参照南京建成公司的 SOD 试剂盒
说明书进行， 以每克鲜样中 SOD 抑制率达 50％时
所对应的 SOD量为一个酶活单位（U）。 过氧化氢酶
（CAT）活性测定采用比色法， 具体参照刘琳等 [14]
的方法， 以每分钟内 A240 变化 0.01 为 1 个酶活性
单位（U）。 过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木
酚法， 具体参照邹琦[15]的方法进行， 以每分钟内 A470
变化 0.01为 1个酶活性单位（U）。 丙二醛（MDA）的
含量测定参照 Wang等[16]的方法进行。
1.3 数据处理
上述所有数据均采用 SAS 分析软件统计并进
行差异显著性分析(p≤0.05)。
2 结果与分析
2.1 玻璃化过程中含水量变化情况
正常不定芽（H0）含水量为 93.215％， 部分玻
璃化后的不定芽（H1）含水量为 95.457％， 玻璃化
后的不定芽（H2）含水量为 97.09％， 玻璃化后的不
定芽含水量显著高于正常不定芽含水量。 在整个玻璃
化过程中， 不定芽含水量呈现明显递增趋势（图 2）。
2.2 玻璃化过程中可溶性蛋白变化情况
正常不定芽（H0）可溶性蛋白含量为 258.007μg/g，
部分玻璃化的不定芽 （H1）可溶性蛋白含量为
205.773 μg/g， 玻璃化后的不定芽（H2）可溶性蛋白
含量为 178.282 μg/g， 玻璃化后的不定芽可溶性蛋
白显著低于正常不定芽可溶性蛋白。 在整个玻璃化过
程中， 不定芽可溶性蛋白呈现明显递减趋势（图 3）。 说
明在玻璃化过程中， 蛋白质合成减少， 分解速率增加。
1909- -
第 37 卷热 带 作 物 学 报
图2 正常和玻璃化的剑麻不定芽含水量变化情况
Fig. 2 Changes of water content in the normal and
hyperhydric adventitious shoots of H.11648
玻璃化情况
98
97
96
95
94
93
92
91
含
水
量
/％
H0 H1 H2
2.3 玻璃化过程中MDA含量变化情况
正常不定芽（H0）MDA含量为 0.001 3μmol/g， 部
分玻璃化（H1）时MDA含量明显下降， 为 0.000 9 μmol/g，
但不定芽完全玻璃化（H2）时， MDA 又略有上升，
为 0.001 2 μmol/g， 在整个玻璃化过程中表现为先
下降然后又恢复到正常水平（图 4）。
2.4 叶片下表皮气孔特征观察
显微镜观察显示： 正常叶片下表皮细胞呈长条
形， 排列整齐致密， 2 个肾形保卫细胞位于 2 个表
皮细胞的交联处， 气孔长条形， 气孔和 2个保卫细
胞组成一个纺锤体形， 放大后可看到大量的叶绿体
整齐地排列在保卫细胞内（图 5-a， 5-d)。 完全玻
璃化（H2）后的叶片下表皮细胞明显比正常叶片下
表皮细胞短、 粗， 保卫细胞膨胀并向内弯曲， 气孔
变大， 气孔和 2个保卫细胞组成一个球形。 保卫细
胞内的叶绿体数也明显减少（图 5-c， 5-f）。 部分
玻璃化的叶片下表皮细胞则处于两者之间， 细胞有
长条形， 也有粗壮形， 叶绿体减少不明显（图 5-b，
5-e）。 另外， 在单个视野内， 气孔密度H0>H1>H2
（图 5-a， 5-b， 5-c)。
2.5 体细胞 DNA相对含量测定
如图 6 所示： 正常不定芽（H0）在荧光强度为
55处出现了一个单峰（图 6-a）， 玻璃化的不定芽
（H2）在55处出现了一个单峰（图 6-b）， 即在不定芽
玻璃化过程中， 体细胞 DNA 相对含量没有发生变
化。 在相同条件下， 正常不定芽细胞数约 500， 玻
璃化后的不定芽细胞数为 280， 即玻璃化后的细胞
数目减少， 细胞分裂减慢。
2.6 玻璃化过程中抗氧化酶 APX、 POD、 CAT 和
SOD变化情况
剑麻不定芽玻璃化过程中 4 种抗氧化酶 APX、
POD、 CAT 和 SOD 变化情况如表 1 所示。 正常不
定芽 APX 活性为 4 944.762 μmol/（g·min）， 在 H1
时显著上升， 达到最高值6 665.357 μmol/（g·min）， 在
H2时又略有下降， 为 4 420.952 μmol/（g·min）， 但与
H0相比， 降低不显著， 在整个玻璃化过程中， APX
活性呈现先上升后下降。 CAT 活性在整个玻璃化
过程中呈现逐渐下降趋势， 正常不定芽 CAT活性为
3 322.000 U/（g·min）， H1时为 2 837.778 U/（g·min），
H2时为 2 712.444 U/（g·min）， 随着玻璃化程度的增
加， 其活性下降但不显著。 POD酶活性在玻璃化过
程中呈递增趋势， 在H0时为 904.271U/（g·min）， H1时
为 1 340.486 U/（g·min）， H2时最高， 为 2 102.343 U/
（g·min）， 完全玻璃化后的不定芽 POD 显著高于正
常不定芽。 SOD 酶活性在玻璃化过程中则先升高后
下降， H0时为 17.577U/g， H1时最高， 为 29.713U/g，
H2 又略有减低， 为 24.613 U/g， 玻璃化后的不定
芽（H1和H2）SOD酶活性均显著高于正常不定芽。
玻璃化情况
图3 正常和玻璃化的剑麻不定芽可溶性蛋白含量变化情况
Fig. 3 Changes of soluble protein concentration in the normal
and hyperhydric adventitious shoots of H.11648
H0 H1 H2
350
300
250
200
150
100
50
0
可
溶
性
蛋
白
含
量
/（
μg
/g
）
玻璃化情况
H0 H1 H2
0.0016
0.0014
0.0012
0.0010
0.0008
0.0006
0.0004
0.0002
0
M
DA
含
量
/（
μm
ol
/g
）
图4 正常和玻璃化的剑麻不定芽MDA含量变化情况
Fig. 4 Changes of MDA concentration in the normal and
hyperhydric adventitious shoots of H.11648
1910- -
第 10 期
a， d为正常（H0）剑麻不定芽叶片气孔； b， e为部分玻璃化（H1）剑麻不定芽叶片气孔； c， f为完全玻璃化（H2）剑麻不定芽叶片气孔， 箭
头所指为肾形保卫细胞（a， b， c为10×， bar=50 μm； d， e， f为100×， bar=10 μm）。
a and d are stomata of nomal adventitious leaves (H0); b and e are stomata of hyperhydric adventitious leaves (H1); c and f are stomata of partly
hyperhydric adventitious leaves(H2); The arrows indicate the kidney-shaped guard cells(a, b and c, bar=50 μm, 10×; d, e and f, 100×， bar=10 μm).
图5 正常和玻璃化剑麻不定芽叶片气孔
Fig. 5 Stomata of normal and hyperhydric adventitious leaves of H.11648 shoots
a b c
d e f
a为正常不定芽（H0）， b为玻璃化的不定芽（H2）。
a Normal shoots, b Hyperhydric adventitious shoots (H2).
图6 正常和玻璃化剑麻DNA含量分布图
Fig. 6 Estimation of absolute nuclear DNA content in the normal and hyperhydric shoots of H.11648
荧光强度
800
640
480
320
160
0
0 100
PK1
细
胞
数
a
400
320
240
160
80
0
细
胞
数
PK1
b
0 100
荧光强度
张燕梅等： 剑麻不定芽玻璃化过程中的细胞学和生理变化研究 1911- -
第 37 卷热 带 作 物 学 报
3 讨论与结论
玻璃化是植物组织培养过程中的普遍现象， 在
玛珈 [16]、 甜樱桃 [17]、 康乃馨 [18]、 拟南芥 [19]、 苹果 [20]、
大蒜[21]等植物中均有报道。 本研究发现 H.11648 不
定芽玻璃化过程中含水量增加， 气孔变大且无法正
常关闭。 关于含水量与玻璃化的关系较为复杂 ，
van den Dries 等[19]认为玻璃化的叶片质外体腔中的
水积累过多， 气体体积严重变小， 气体交换速率减
慢， 这样反过来会使质外体中乙烯， 茉莉酸甲酯等
浓度升高， 从而导致植物玻璃化。 气孔的大小和关
闭是由保卫细胞细胞壁调控， 玻璃化后的叶片保卫
细胞木质素、 纤维素等含量降低[22]， 次生壁和细胞
板形成受阻， 细胞无法正常分裂， 细胞壁也随之受
损， 因此无法正确调控气孔的关闭[23]， 这与苹果[24]、
康乃馨[25]、 香草[26]等研究结果一致。
流式检测表明， 在剑麻玻璃化过程中， 体细胞
数目减少， DNA 相对含量不变。 这与 Franck 等 [17]
的研究结果一致。 Franck 等[17]认为细胞数目减少是
由于玻璃化过程中细胞分裂频率降低了， 这样可以
防止活性氧引起的子细胞 DNA的损伤。 Ochatt 等[27]
则认为， 玻璃化能引起 DNA 含量的改变， 但两者
之间的因果关系仍需进一步的实验验证。 此外， 也
有学者认为玻璃化不仅能引起 DNA 含量变化， 还
可引起染色体断裂、 重排以及 DNA甲基化等[28-30]。
本研究中的剑麻不定芽玻璃化过程中 MDA 含
量下降， POD、 SOD、 APX 和 CAT 抗氧化酶活性
发生明显改变 。 SOD、 CAT、 POD 和 APX 是 4
个重要抗氧化酶， 其中 SOD 能催化体内的歧化反
应， 使超氧阴离子自由基（O2·-）转化为 H2O2 和 O2，
其在玻璃化过程中活性的显著升高可以减少剑麻
不定芽玻璃化过程中由于活性氧爆发产生的超氧
阴离子自由基对细胞膜的损害， 这与 Franck 等 [17]
和Chakrabarty等 [20]的研究结果一致。 而 POD、 APX
和 CAT 的高活性， 则可进一步将 H2O2分解成没有
毒害的 H2O 和 O2， 维持 H2O2 的动态平衡， 抑制
MDA 的积累， 从而降低膜脂过氧化程度， 减缓玻
璃化的发生[19]。
玻璃化是一个非常复杂的生理生化过程， 本研
究仅对剑麻不定芽玻璃化进行了初步的探讨， 有关
不定芽玻璃化过程中是否存在活性氧的爆发、 活性
氧与玻璃化的关系以及引起剑麻不定芽玻璃化的生
理机制则需更深入的研究。
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表1 正常和玻璃化的剑麻不定芽防御酶活性变化情况
Table 1 Changes of antioxidative enzymes activities in the normal and hyperhydric adventitious shoots of H.11648
玻璃化情况
抗氧化酶
APX活性/[μmol/（g·min）] POD活性/[U/（g·min）] CAT活性/[U/（g·min）] SOD活性/(U/g)
H0 （4 944.762±820.717）b （904.271±95.720）b （3 322.000±144.961）a （17.577±3.705）b
H1 （6 665.357±368.847）a （1 340.486±84.704）b （2 837.778±310.533）a （29.713±3.879）a
H2 （4 420.952±31.472）b （2 102.343±238.305）a （2 712.444±212.905）a （24.613±0.993）a
1912- -
第 10 期 张燕梅等： 剑麻不定芽玻璃化过程中的细胞学和生理变化研究
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责任编辑： 黄 艳
1913- -