全 文 ：收稿日期:2014 － 12 － 19
基金项目:四川省科技支撑计划项目(编号:2014 ZC 2103) ;成都市科技
局项目(2014)。
作者简介:王跃华(1963 －) ，女，四川成都人;硕士学位，教授，硕士生导
师，主要从事药用植物生物技术研究;E-mail:1961689636@
qq． com。
华重楼超低温保存条件的优化研究
王跃华1， 刘银花1，2， 陈 燕3， 彭世明3， 唐 旭1，2， 何新友3， 任鹏飞3， 何诗红3
(1．成都大学生物产业学院， 四川 成都 610106; 2．四川师范大学生命科学学院， 成都 610101;
3．四川金土地中药材种植集团有限公司， 成都 611130)
摘要:目的:获得华重楼地下茎超低温保存的关键技术。方法:选取预培养基中二甲基亚砜的浓度、保存材料的预培养时
间、装载时间和脱水时间为正交设计的 4 因素，每个因素确立 4 个水平，并以细胞相对存活率为考察指标，对华重楼地下
茎的超低温保存条件进行优化研究。结果:华重楼地下茎的最佳保存条件是在含 5%二甲基亚砜的液体培养基中预培
养 5 d后，用 60 %玻璃化溶液装载 45 min，再用 100%玻璃化溶液在 4 ℃条件下脱水处理 60 min，其保存后细胞的相对存
活率可高达 92． 10%。结论:华重楼地下茎种质资源的玻璃化超低温保存操作简单、成活率高，可广泛地用于生产实践。
关键词: 华重楼;超低温保存;正交设计
中图分类号: S 567． 23 + 9 文献标志码: A 文章编号: 1001 － 4705(2015)04-0013-04
Optimization of Cryopreservation Condition for
Paris polyphylla var． chinensis
WANG Yue-hua1，LIU Yin-hua1，2，CHEN Yan3，PENG Shi-ming3，
TANG Xu1，2，HE Xin-you3，ＲEN Peng-fei3，HE Shi-hong3
(1． Department of Biological Engineering，Chengdu University，Chengdu Sichuan 610106，China;
2． College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China;
3． Sichuan Jintudi Cultivation of Chinese Herbal Medicines Group co．，Ltd，Chengdu 611130，China)
Abstract:Objective:To establish the critical techniques for cryopreservation of Paris polyphylla var． chinensis．
Method:The concentration of dimethyl sulfoxide，pre-cultivation time，loading time，and dehydration time were
optimized in an orthogonal design． Four different levels were tested for each of the factor． The results were
evaluated by the relative survival rate of the cells． Ｒesult:The optimal cryopreservation condition for Paris
polyphylla var． chinensis was pre-cultivation in 5% DMSO for 5 days，followed by 45 minutes loading with 60%
vitrified solution． The sample was then dehydrated with 100% vitrified solution for 1 hour． Under such condi-
tion，the relative survival rate was 92． 10% ． Conclusion:The method of vitrification to cryopreserve the germ-
plasm of P． polyphylla var． chinensisis simple in handling with high in survival and can be applied in practice．
Key words: Paris polyphylla Smith var． chinensis (Franch ．)Haras;cryopreservation;orthogonal design
中国药典规定的中药重楼为百合科植物云南重楼
Paris polyphylla Smith var． yunnanensis(Franch．)Hand． -
Mazz． 和华重楼(又称七叶一枝花)Paris polyphylla
Smith var． chinensis(Franch．)Hara 的干燥根茎［1］，前
者主产于云南，后者主产于四川。在《神农本草经》最
早记载的“蚤休”即华重楼。重楼根茎中含有重楼皂
苷等成分，该成分具有抗肿瘤、止血镇痛、抗菌消炎、抑
制血管形成、抗氧化、免疫调节、保护肝脏与肾脏等作
用，被广泛应用来治疗各类疾病［2 ～ 5］。
近年来，制药工业对重楼的需求逐年增加，导致产
区的采挖量迅速增加，远远超过资源自然的再生能力，
致使资源的蕴藏量和药材收购量逐年下降，部分药材
收购点近几年中每年仅能收购到几十公斤药材［6］。
因此，积极开展对重楼植物实施有效的保护已迫在
眉睫。
目前，我国对名贵中药资源的保护提出了一系列
·31·
研究报告 王跃华 等:华重楼超低温保存条件的优化研究
的有效措施，为了更好地保护重楼野生种质资源，开展
了针对华重楼无性繁殖器官地下茎的超低温保存关键
技术研究。
由于影响华重楼地下茎进行超低温保存的因素较
多，本实验采用了 L16(4
4)的正交试验方法进行研究，
在大大缩短工作量的同时，也科学合理地筛选出最佳
试验方案，并且通过对正交试验结果进行科学的极差
分析和方差分析，从而获得华重楼超低温保存的最优
条件。
1 材料与方法
1． 1 材 料
重楼植物采自四川省都江堰，经四川大学张浩教
授鉴定为百合科植物的华重楼 Paris polyphylla Smith
var． chinensis(Franch．)Hara。本研究选取华重楼植物
的无性繁殖器官根茎，置于 4 ℃条件下低温处理 20 d
后作为实验材料。
1． 2 溶液的配制
预培养基配制:分别取 50 mL、100 mL、150 mL、200
mL的二甲基亚砜(DMSO)溶于 600 mL 的蒸馏水中，
然后再加入 MS培养液分别配制成 4 种含有不同浓度
二甲基亚砜的 MS 液体预培养基，即(1)MS + 5%
DMSO、(2)MS + 10% DMSO、(3)MS + 15% DMSO 和
(4)MS +20% DMSO。
100%玻璃化溶液(PVS2)配制:取 300 g 甘油、150
g乙二醇、150 g二甲基亚砜和 136． 91 g蔗糖，溶于 600
mL水中，并定容到 1 000 mL，即得 100% PVS2 玻璃化
溶液。
60%玻璃化溶液(PVS2)配制:取 171． 14 g 蔗糖溶
于水中，定容到 1 000 mL，得到浓度为 0． 5 mol /L 的蔗
糖溶液。再将 0． 5 mol /L 蔗糖溶液和 100%玻璃化溶
液按 40 ∶ 60 的体积比配制成混合溶液，即得到 60%的
玻璃化溶液。
本实验使用的装载溶液为 60% PVS2，脱水溶液
为 100% PVS2。
1． 3 方 法
1． 3． 1 正交试验设计
本实验以预培养基中添加的二甲基亚砜浓度(A)
和保存材料的预培养时间(B)、装载时间(C)和脱水
时间(D)为正交设计的 4 因素，每个因素确立 4 个水
平(见表 1)。
1． 3． 2 冻材与解冻
将上述 4 ℃条件下低温处理 20 d 的各备用材料
迅速投入液氮中保存 7 d后取出，放在 40 ℃恒温水浴
中进行快速解冻，然后用附加 1． 2 mol /L蔗糖的 MS溶
液进行洗涤，此操作重复 3 次，每次停留 10 min。
表 1 L16(4
4)因子水平表
水平 A(%) B(d) C(min) D(min)
1 5 1 20 20
2 10 3 35 40
3 15 5 45 60
4 20 7 60 80
注:A表示二甲基亚砜浓度;B表示预培养时间;C表示装载时间;
D表示脱水时间。
1． 3． 3 细胞存活率的检测
本实验对超低温保存的华重楼材料存活率检测是
采用 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)还原法，简称
TTC法［7］。材料解冻洗涤后，将华重楼根茎加入 pH
为 7． 0 的 0． 4 % TTC溶液中，放置于暗处在 25 ℃条件
下进行染色 18 h［8］，然后倒去 TTC 溶液，加入无水乙
醇于 40 ℃恒温水浴锅中进行 TTF 的提取直至材料无
色，取上清液用 UV-1100 型紫外-可见分光光度计在
485 nm处测定吸光值［9］，每组重复测定 3 次，取平均
值，从而计算出保存后材料细胞的相对存活率。
细胞相对存活率(%)=处理后材料的吸光值 /未
处理材料的吸光值 × 100%。
1． 3． 4 数据分析
以保存后细胞的相对存活率为评价指标，用正交
助手Ⅱ统计分析软件对实验数据进行极差分析和方差
分析。
2 结 果
2． 1 结果与分析
本实验采用了 L16(4
4)正交设计，以细胞相对存活
率为统计指标，对数据进行直观分析，试验结果见表 2
和表 3。
由表 2 可看出，预培养基中二甲基亚砜的浓度、保
存材料的预培养时间、装载时间和脱水时间对华重楼
地下茎的超低温保存后的细胞存活率有显著影响，其
中超低温保存后细胞相对存活率最高的是 3 号组合
A1B3C3D3，高达 92． 10%;表明华重楼地下茎进行超低
温保存的最佳条件是在含 5%二甲基亚砜的 MS 液体
培养基中预培养 5 d 后，在室温下装载 45 min，再在
4 ℃条件下脱水处理 60 min，可使华重楼地下茎细胞
的保存效果最佳。
表 3 极差 Ｒ值大小分析结果表明，影响华重楼超
低温保存后的细胞存活率高低因素依次为 A ＞ B ＞
D ＞ C，即预培养基中二甲基亚砜浓度对华重楼超低温
保存后的细胞存活率影响最大，影响最小的是装载
时间。
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第 34 卷 第 4 期 2015 年 4 月 种 子 (Seed) Vol． 34 No． 4 Apr． 2015
表 2 L16(4
4)试验结果
编号 A B C D E(误差)
细胞相对
存活率(%)
1 1 1 1 1 1 50． 22
2 1 2 2 2 2 15． 02
3 1 3 3 3 3 92． 10
4 1 4 4 4 4 30． 00
5 2 1 2 3 4 40． 02
6 2 2 1 4 3 2． 08
7 2 3 4 1 2 70． 25
8 2 4 3 2 1 30． 21
9 3 1 3 4 2 3． 50
10 3 2 4 3 1 10． 51
11 3 3 1 2 4 7． 32
12 3 4 2 1 3 8． 01
13 4 1 4 3 3 2． 21
14 4 2 3 1 4 2． 15
15 4 3 2 4 1 3． 02
16 4 4 1 2 2 5． 07
表 3 极差分析
A B C D E(误差)
T1 187． 34 97． 952 63． 688 131． 6 91． 48
T2 141． 532 26． 28 67． 072 59． 76 90． 812
T3 24． 86 172． 648 124． 96 145． 22 109． 4
T4 17． 448 74． 288 115． 46 34． 6 79． 492
t1 46． 835 24． 488 15． 922 32． 9 22． 87
t2 35． 383 6． 57 16． 768 14． 94 22． 703
t3 6． 215 43． 165 31． 24 36． 305 27． 35
t4 4． 362 18． 572 28． 865 8． 65 19． 873
Ｒ 42． 473 36． 595 15． 318 27． 655 7． 477
2． 2 方差分析
以细胞相对存活率为测定指标，对数据进行方差
分析。
表 4 方差分析
方差
来源
平方和 自由度 F值 F0． 05 F0． 01 F0． 005 显著性
A 5 473． 531 3 69． 72 9． 28 29． 457 47． 468 ＊＊＊
B 2 685． 543 3 34． 208 9． 28 29． 457 47． 468 ＊＊
C 786． 614 3 10． 02 9． 28 29． 457 47． 468 *
D 2 206． 87 3 28． 11 9． 28 29． 457 47． 468 *
E(误差) 78． 51 3
注:“* ”表示显著;“＊＊”表示非常显著;“＊＊＊”表示极显著。
从表 4 的数据分析结果可见，本实验设定的 4 个
因素均对实验结果有显著性影响(p ＜ 0． 05) ;其中因
素 A检验值 F = 69． 720，临界值 F0． 005 = 47． 468，F ＞
F0． 005，因而因素 A 有极显著影响(p ＜ 0． 005) ，因素 B
检验值 F = 34． 208，临界值 F0． 01 = 29． 457，F ＞ F0． 01，说
明因素 B有非常显著影响 (p ＜ 0． 01) ，同理可知因素
C和因素 D都有显著影响，所以影响华重楼超低温保
存的最主要因素为二甲基亚砜的浓度，其次为预培养
时间、脱水时间以及装载时间，此结果与极差分析的结
果相吻合。
3 讨 论
从本实验的极差分析和方差分析可知，在预培养
过程中选用的预培养基和预培养时间是影响材料保存
后细胞存活率高低的主要因素，这与陈辉等［10］研究切
花百合离体茎尖玻璃化法超低温保存的实验结果相吻
合;分析其原因主要是由于预培养过程是改善保存材
料生理状态的最有效方法，通过在预培养基中添加一
些可渗透进入细胞内的小分子渗透性保护剂如二甲基
亚砜，可实现对将要保存的细胞材料进行保护性脱水，
从而使得材料在投入液氮之前处于最适宜超低温保存
的生理状态，以至于材料在投入液氮后，其保存细胞内
能很快地形成玻璃化状态，从而有效地避免了细胞内
形成冰晶所造成的伤害。
但值得注意的是，尽管预培养过程是影响冷冻保
存材料细胞存活率的主要因素，但也并非是预培养时
间越长越好。因为二甲基亚砜作为细胞外来物质，预
培养时间过长会对细胞内的理化性质加以破坏，而造
成对细胞的伤害甚至死亡［11］。因此，本实验结果显
示，选择适宜的预培养时间才是改善保存材料处于超
低温保存最佳生理状态的关键因素。
超低温保存技术是一项可长期保存药用植物种质
资源的有效方法，具有长期性和稳定性的特点;采用此
技术在有效保持药用植物种质遗传稳定性的同时又不
会丧失其具有的形态和生理发生潜能［12］，同时可极大
地克服药用植物种质资源在田间保存所需花费的大量
人力、物力和财力的缺点。因此，开展此技术的研究可
有效地保护当前大量野生濒危的药用植物种质资源，
确保药物资源的长期和可持续利用。
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收稿日期:2014 － 11 － 05
基金项目:辽宁省自然科学基金(编号:2013020065) ;国家大豆产业技
术体系(编号:CAＲS-04) ;辽宁省科技厅科技攻关项目(编
号:201401677-2)。
作者简介:张瑞朋(1979 －) ，男，黑龙江依兰人;副研究员，博士，主要从
事大豆遗传育种与栽培技术研究，E-mail:tlsnky@ 163． com。
通讯作者:付连舜(1960 －) ，男，辽宁铁岭人;研究员，主要从事大豆遗
传育种研究，E-mail:fulianshun@ sina． com。
氮素对 12 个大豆品种叶片光合生理参数的影响
张瑞朋1， 付连舜1， 佟 斌2， 吴晓秋2， 朱海荣1， 孙国伟1
(1．铁岭市农业科学院， 辽宁 铁岭 112616; 2．辽宁职业学院， 辽宁 铁岭 112099)
摘要:在大田条件下，以不同来源 12 个亚有限结荚习性大豆品种为材料，采用不同氮素用量，利用 LI-6400 光合作用测定
系统在大豆开花期、结荚期、鼓粒期测定了大豆叶片净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和细胞间隙二氧化碳浓度，以确定
大豆的氮素合理施用量。结果表明:当尿素施用量为 100 kg /hm2 时，与不施肥相比，俄亥俄当代品种和辽宁当代品种开
花期与结荚期叶片净光合速率增加;随着施氮量的增加，辽宁老品种开花期叶片净光合速率逐渐增加。与不施肥相比，
氮肥处理增加了俄亥俄当代品种和辽宁当代品种鼓粒期叶片净光合速率。
关键词: 大豆;氮素;光合参数
中图分类号: S 565． 1 文献标志码: A 文章编号: 1001 － 4705(2015)04-0016-04
Effect of Nitrogen on Photosynthetic Traits of 12 Soybeans Varieties
ZHANG Ｒui-peng1，FU Lian-shun1，TONG Bin2，WU Xiao-qiu2，ZHU Hai-rong1，SUN Guo-wei1
(1． Tieling Academy of Agricultural Sciences，Tieling Liaoning 112616，China;
2． Liaoning Vocational College，Tieling Liaoning 112099，China)
Abstract:This experiment was carried out by using twelve soybean cultivars from different regions in field
conditions． We measured photosynthetic traits using LI-6400 photosynthesis system at blooming，podding and
grain filling stage in the treatment of nitrogen fertilizer． The results were as follows:the leaf net photosynthesis
rate was improved in the treatment of 100 kg /hm2 urea for current Ohio cultivar and current Liaoning cultivar
at blooming and podding stages． The leaf net photosynthesis rate of old Liaoning cultivarincreased with the level
of nitrogen fertilizer ascending at blooming stage． The leaf net photosynthesis rate was improved in the
treatment of nitrogen fertilizer for current Ohio cultivar and current Liaoning cultivar at grain filling stage．
Key words: soybean;nitrogen;photosynthetic traits
施用氮素是调控作物生长和光合生产率的重要手
段之一。适量施氮能提高玉米叶片的可溶性蛋白含量
和 PEPCase 的活性［1］，增加气孔导度，提高 ＲuBPCase
活性以及增大 PSⅡ最大光化学量子产量和效率［2，3］。
缺氮条件下，不同玉米自交系穗三叶叶绿素含量和光
合速率明显下降［4］。增施氮肥，能提高小麦叶片叶绿
素含量，增强 PSI 和 PSⅡ的电子传递能力，延长叶片
的叶绿素含量缓降期和光合速率高值持续期，改善光
合性能［5 ～ 7］;增强棉花生育后期叶片的叶绿素含量、PS
Ⅱ潜在活性、PSⅡ最大光化学效率和叶片生理活性，
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第 34 卷 第 4 期 2015 年 4 月 种 子 (Seed) Vol． 34 No． 4 Apr． 2015