全 文 ：ＲP-HPLC法测定细叶鸢尾中二氢黄酮的含量
杨 阳1，刘少静1，杜 强1，赵长琦2
(1．西安医学院药学院，陕西 西安 710021;2．北京师范大学生命科学学院，北京 100875)
摘要:目的 建立 ＲP-HPLC法，测定细叶鸢尾中一种具有抗老年痴呆症活性的二氢黄酮:5，2＇，3＇-三羟基-6，7-亚甲二氧基二氢
黄酮。方法 采用 Agilent 1260HC － C18(4． 6 mm × 250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为甲醇—1%冰醋酸梯度洗脱，流速为 1 mL
·min －1，检测波长为 295 nm，柱温为 25℃。结果 该二氢黄酮在 37． 6 ～ 188 mg·L － 1浓度范围内线性关系良好，相关系
数为 0． 999 4;回收率为 101． 26 % (ＲSD = 1． 17 %)。测得该活性化合物在细叶鸢尾中的含量非常高，6 批药材中的含
量为 57． 70 ～ 59． 35 mg·g － 1。结论 该检测方法准确，适用于细叶鸢尾中 5，2＇，3＇-三羟基-6，7-亚甲二氧基二氢黄酮的测定。
关键词:细叶鸢尾;二氢黄酮;5，2＇，3＇-三羟基-6，7-亚甲二氧基二氢黄酮;老年痴呆症;ＲP-HPLC法
doi:10． 3969 / j． issn． 1009 － 6469． 2015． 05． 012
基金项目:十 二 五“重 大 新 药 创 制”科 技 重 大 专 项 (No
2013ZX09103001 － 019 － 001)
通信作者:赵长琦，男，教授，研究方向:天然产物化学，E-mail:no-
va009@ 126． com
Determination of a flavanone in Iris tenuifolia by ＲP-HPLC
YANG Yang，LIU Shao-jing，DU Qiang，et al
(School of Pharmaceutical Sciences，Xi’an Medical University，Xi’an，Shanxi 710021，China)
Abstract:Objective This paper established a ＲP-HPLC method for determination of a flavanone exhibiting potential anti Alzheimer＇s
disease activity in Iris tenuifolia．Methods The separation was carried out with an Agilent 1260HC-C18 column (4． 6 mm × 250 mm，
5 μm)by gradient elution using methanol － 1% acetic acid as mobile phase at a flow rate of 1 mL·min －1 ． The detection wavelength
was 295 nm and the column temperature was maintained at 25℃ ． Ｒesults Good linear relationship was observed in the range of 37． 6
～ 188 mg·L －1(Ｒ2 = 0． 999 4)． The recovery rate was 101． 26 % (ＲSD = 1． 17 %)． And the content of this active compound in Iris
tenuifolia was very high，which reached 57． 70 ～ 59． 35 mg·g －1 Conclusions The method had the advantages of acuteness and preci-
sion，which was suitable for determination of 5，2＇，3＇-trihydroxy-6，7-methylenedioxyflavanone in Iris tenuifolia．
Key words:Iris tenuifolia;flavanone;5，2＇，3＇-trihydroxy-6，7-methylenedioxyflavanone;Alazheimer’s disease;ＲP-HPLC
阿尔茨海默病(Alazheimer’s disease，AD)俗称
老年痴呆症是老年期以渐进性记忆力和智能减退
为特征的弥漫性中枢神经系统退行性疾病，其临床
表现为记忆障碍，认知障碍和精神异常，伴有人格
和情感控制等方面的异常以及日常生活能力的下
降。AD 显著的神经组织学病理特征为:大脑皮质
和海马神经细胞外出现 β 淀粉样蛋白(β-amyloid
protein，Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaques，SP)
和脑神经细胞内 tau 蛋白异常聚集形成神经元纤维
缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)［1 － 2］。Aβ 是 β －
淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein，APP)的
水解产物。APP是一种由定位于 21 号染色体长臂
上的基因编码含有 695 ～ 770 个氨基酸残基的跨膜
糖蛋白，在体内各种组织广泛存在，而在脑组织的
表达最高，但是 APP 在外周细胞很少被剪切，只有
在脑组织中被特异性加工产生 Aβ。在生理条件
下，APP主要由 α-分泌酶裂解成含 N 端和 C 端的 2
个 APP片段(α-APP)，其中，含 N 端的 α-APP 是水
溶性 Aβ1 － 16肽段，不发生 Aβ 沉淀，含 C 端的 Aβ 片
段经 γ-分泌酶继续降解为 P3 多肽。在某些病理条
件下，Aβ主要经 β-分泌酶和 γ-分泌酶共同剪切产
生过多的 Aβ，导致 AD 的发病。首先 A 即经 β-分
泌酶降解为含 N端的水溶性片段和 C 端肽段，含 C
端的 β-APP 片段经 γ-分泌酶继续降解为 Aβ
(Aβ1 － 40或 Aβ1 － 42)
［2］。大量研究显示:β 淀粉样蛋
白持续性地大脑细胞损害会导致患者进行性智力
衰退，其在脑中沉积进而形成老年斑是阿尔茨海默
病神经病理过程的关键事件［3］。此外，许多学者还
注意到，与学习记忆能力密切相关的海马结构神经
元丢失、体积变小是 AD非常普遍的病理改变，所以
越来越多的人把 AD看为一种神经缺损疾病［4］。而
经研究发现神经细胞凋亡是 AD神经元丢失的主要
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原因。因此，对于研究细胞凋亡的分子调控机制，
尤其是阐明己知凋亡相关信号分子的具体信号通
路和寻找新的基因调控途径近年来引起很多科学
家的高度关注，细胞凋亡信号转导的分子调控机制
也成为科学家研究的热点之一。Aβ 能作为神经元
凋亡的启动者，造成 DNA 损伤，膜发泡和细胞皱
缩，产生凋亡小体，DNA 1adders 和其他典型的凋亡
特征。研究表明 Aβ在许多体内外模型中均可以诱
导细胞凋亡。另外，Aβ 还可以通过引起脑内炎症
反应和神经纤维缠结(NFT)间接导致神经细胞凋
亡。神经元凋亡，突触大量丢失，从而体现出整体
上的神经功能障碍和行为学的改变［2］。
鸢尾属(Iris)属于鸢尾科，该属植物在世界上
许多国家被用做传统民间药材，治疗癌症、炎症、细
菌和病毒感染等多种疾病［7］。一直以来，都被认为
是丰富的次生代谢产物的来源。鸢尾属中最主要
的化学成分为黄酮类，具有多样并且良好的生物活
性，被认为是该属药材药效的重要物质基础之一，
可作为药材的质量评价指标。
细叶鸢尾(Iris tenuifolia Pall．)为鸢尾科鸢尾属
多年生草本植物，分布在我国东北，华北及西北等
多个省份［8］。其根和根茎是中药老牛拽的药材基
源，具有养血安胎，止血的作用［9］。本课题组研究了
细叶鸢尾根的化学成分及其生物活性［10］，综合之前
的文献报道［11 － 12］，其化学成分中二氢黄酮占大多数;
另外发现其中的 5，2＇，3＇-三羟基-6，7-亚甲二氧基二氢
黄酮(图 1)具有阻止 β淀粉样(Aβ)蛋白凝集以及促
进神经细胞增殖的活性，且两种活性均优于各自的阳
性对照(Crytotanshinone和促生长因子 B27)。以上活
性提示了它具有抗老年痴呆症的潜在药用价值［10］。
本研究建立了灵敏准确的 ＲP-HPLC 测定方法，对细
叶鸢尾中 5，2＇，3＇-三羟基-6，7-亚甲二氧基二氢黄酮的
含量进行了定量分析，对该药用植物的进一步开发利
用具有一定意义［13 － 18］。
1 仪器与材料
1． 1 仪器 Aglilent-1260 系列高效液相色谱系统
(包括四元梯度泵，50 μL 微量进样器，柱温箱和
DAD二极管阵列检测器);FA1004B 电子天平(上
海越平科学仪器有限公司)。
1． 2 试剂 对照品 5，2＇，3＇-三羟基-6，7-亚甲二氧基
二氢黄酮为自制，其结构经质谱(MS)、核磁(NMＲ)
确认，经 HPLC 测定，质量分数在 98%以上。实验
用水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。
甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯(天津市耀华化学
试剂有限责任公司)。
图 1 5，2＇，3＇-三羟基-6，7-亚甲二氧基二氢黄酮
1． 3 药材 植物材料采自内蒙古锡林郭勒旗，经
北京师范大学刘全儒教授鉴定为鸢尾科(Iridace-
ae)鸢尾属(Iris)细叶鸢尾(Iris tenuifolia Pall． )。
2 方法与结果
2． 1 对照品溶液的制备 精密称取该二氢黄酮标
准品 4． 70 mg，用甲醇溶解后定容至 25 mL 容量瓶
中，制得 5，2＇，3＇-三羟基-6，7-亚甲二氧基二氢黄酮浓
度为 188 mg·L －1的对照品母液。用微孔滤膜(0．
45 μm)滤过后放置，待用。精密吸取一定量母液，
加甲醇定容配制成系列浓度的对照品溶液，浓度分
别为:37． 6、47． 0、75． 2、94． 0、112． 8、141． 0、188． 0
mg·L －1，4℃冷藏备用。
2． 2 供试品溶液的制备 精密称取细叶鸢尾根茎
干燥细粉(60 目)80． 0 mg，加甲醇 30 mL，索氏提取
1 h，滤过洗涤，合并滤液及洗涤液至 50 mL 量瓶中，
甲醇定容，作为供试品溶液，用微孔滤膜(0． 45 μm)
滤过后放置，4℃冷藏备用。
2． 3 色谱条件 色谱柱为 Agilent 1260HC － C18
(250 mm × 4． 6 mm，5 μm);柱温为室温;体积流量
为 1 mL·min －1;检测波长为 295 nm;进样量为 20
μL;流动相为:甲醇(A)—1%冰醋酸(B);梯度洗脱
顺序见表 1。在上述色谱条件下得到的对照品及样
品的色谱图见图 2。
2． 4 方法学考察
2． 4． 1 线性关系观察 精密吸取系列对照品溶液
各 20 μL，记录峰面积，以峰面积积分值(Y)对质量
浓度(X)进行线性回归，得线性方程为 Y = 30． 193X
－ 8． 904 9 (Ｒ2 = 0． 999 4)，且质量浓度在 37． 6 ～
188 mg·L －1内线性关系良好。
2． 4． 2 精密度实验 精密吸取对照品溶液 20 μL，
按照“2． 3”项下色谱条件重复进样 6 次，记录峰面
积，计算出峰面积积分值的 ＲSD为 1． 7%。结果表
明，该方法精密度良好。
2． 4． 3 重复性实验 精密称取细叶鸢尾根茎粉
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末(60 目)80 ． 0 mg，共 6 份，按“2 ． 2”项方法制
备，按“2 ． 3”项下色谱条件各进样 20 μL，记录峰
面积，按照标准曲线，以外标法计算 5，2 ＇，3 ＇-三羟
基-6，7-亚甲二氧基二氢黄酮的质量分数，其质量
分数的 ＲSD 为 0 ． 33%。结果表明，该方法重复
性良好。
表 1 流动相梯度系统
时间 /min A(甲醇) B(1%冰醋酸水)
0 ～ 10 40 60
10 ～ 20 45 55
20 ～ 30 50 50
30 ～ 40 55 45
40 ～ 45 60 40
图 2 5，2＇，3＇-三羟基-6，7-亚甲二氧基二氢黄酮对照品(A)
和细叶鸢尾药材(B)色谱图
注:1． 5，2＇，3＇-三羟基-6，7-亚甲二氧基二氢黄酮。
2． 4． 4 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液 20
μL，分别于 0、2、4、8、12、24 h进样测定，考察其稳定
性，结果峰面积的 ＲSD 为 0． 76%，表明供试品溶液
在 24 h内稳定。
2． 4． 5 加样回收率实验 精密称取已测定的细叶
鸢尾根茎粉末(60 目)80． 0 mg，共 6 份，每两份加入
相同质量的对照品(分别为样品含量一半的 25%，
50%，75%)，按“2． 2”项制备供试品溶液，依法测
定。计算加样回收率为 101． 26 % ，ＲSD 为 1． 17
%，具体见表 2。
表 2 加样回收试验结果(n = 6)
样品量
/ g
样品含量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均回收率
/%
ＲSD
/ %
0． 080 4． 631 0． 588 5． 269 100． 96 101． 26 1． 17
0． 079 4． 573 0． 588 5． 253 101． 78
0． 081 4． 689 1． 152 5． 838 99． 95
0． 079 4． 573 1． 152 5． 838 101． 97
0． 078 4． 515 1． 739 6． 437 102． 93
0． 081 4． 689 1． 739 6． 427 99． 98
2． 5 样品含量测定 分别精密称取 6 个批次细叶
鸢尾根茎粉末(60 目)80． 0 mg，按“2． 2”项方法制
备，分别进样 20 μL，记录峰面积，按照标准曲线，以
外标法计算，5，2＇，3＇-三羟基-6，7-亚甲二氧基二氢黄
酮的含量见表 3。
表 3 样品含量测定结果(n = 3)
批号
5，2＇，3＇-三羟基-6，7-
亚甲二氧基二氢黄酮 /mg·g － 1
ＲSD /%
080709 57． 78 1． 03
080711 58． 04 0． 92
090628 57． 70 0． 86
090630 59． 35 1． 20
100729 58． 14 0． 79
100802 57． 89 0． 89
3 讨论
我国是一个人口大国，人口老龄化的速度会更
快，现在我国 60 岁以上人口已经超过 10%，因而患
痴呆的人数将有显著增加，特别是在较高龄人口中
该病的患病率会成倍增长，已经成为严重威胁老年
人生命健康和生活质量的主要疾病之一［2］。AD 的
发病机制假说众多，包括基因学说、传染学说、炎症
学说、胆碱能学说、铝中毒学说、自由基学说、钙超
载学说、Tau 蛋白学说、代谢紊乱学说、β －淀粉样蛋
白(β － Amyloid，Aβ)级联假说等。其中 Aβ 级联假
说是现在最为公认的 AD 发病机制之一。该假说认
为，Aβ 异常聚集是 Aβ 级联通路的关键环节，而
Aβ代谢通路也是开发 AD 治疗药物最受关注的靶
点。据 2010 年 Lancet 报道，目前研究开发的 AD
防治药物中约 66%是针对 Aβ 及其代谢通路的，而
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抗 Aβ聚集又是其中最为重要的研究方向之一。由
于 AD发病因素多，发病机制复杂，因此充分利用中
药多途径、多方式、多靶点的作用优势，开拓治疗
AD的新途径，寻找治疗 AD的中草药势在必行。联
合用药可能成为 AD 治疗合理而有效的选择，目前
AD中药治疗尤其是一些中药复方制剂的应用在临
床上已取得一定进展。尽管中医药研究起步稍晚，
但有传统中医理论，借助现代科技手段，有望在中
药防治 AD的研究领域取得进展。以现代生物学对
AD的研究成果为基础，从多层次、多角度深入研究
中药提取物治疗 AD 的多途径作用机制，有利于进
一步提高中药在 AD 治疗中的临床价值，并为研究
开发疗效更高、毒性更小的 AD 治疗药物提供更多
思路［19］。
此外，二氢黄酮是细叶鸢尾中重要的化学成
分，具有广泛的药理作用，一定条件下可作为药材
质量控制的指标性成分。本实验首次测定了细叶
鸢尾中的该类成分，可为药材的质量评价提供方法
学依据。
3． 1 色谱条件的优化
3． 1． 1 流动相的优化 黄酮类结构中常带有酚羟
基，为了抑制其解离，克服分离时的拖尾现象，流动
相中需要加入酸调节 pH 值。本实验对甲醇—
0． 1%乙酸，甲醇—0． 5%乙酸，甲醇—1%乙酸，甲
醇—2%乙酸四种流动相系统进行比较，最终确定
甲醇—1%乙酸作为流动相。
综合考虑分离度，出峰时间及峰形等因素，调
节流动相配比，最终采用如表 1 所示的梯度进行洗
脱，可快速，准确地测定细叶鸢尾中 5，2＇，3＇-三羟基-
6，7-亚甲二氧基二氢黄酮的含量。
3． 1． 2 检测波长的选择 依据相关文献报道，本
实验设置了 230、245、254、268、290、295、310、355
nm等 8 个波长进行考察，利用 DAD 检测器扫描这
些波长下 5，2＇，3＇-三羟基-6，7-亚甲二氧基二氢黄酮
的吸收光谱，结果表明:其在 295 nm 波长处有最大
吸收，且噪音较小，基线平滑，具有较高的灵敏度，
故选择 295 nm作为检测波长。
3． 2 样品提取工艺的考察 以 5，2＇，3＇-三羟基-6，7-
亚甲二氧基二氢黄酮的提取率为指标，本实验考察
了乙酸乙酯，甲醇，乙醇等三种提取溶剂对提取效
率的影响，结果表明甲醇的提取率最高且峰形良
好。同时考察了提取时间对实验结果的影响，结果
为索式提取 1 h即可提取完全。
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