全 文 ：收稿日期：2008-05-01
基金项目：辽宁省科技攻关项目（2006208001）
作者简介：王林美（1966－），女，辽宁省农业科学院助理研究员，从事细胞分子生物学研究。
独角莲抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和诱导
凋亡的作用研究
王林美，叶 博，赵振军，李树英
（辽宁省农业科学院 大连生物技术研究所，辽宁 大连 116024）
摘要：为探讨独角莲对人乳腺癌 MCF-7 细胞增殖和凋亡的作用，将不同浓度的独角莲根茎水提物（The aqueous extract from dried
powdered rhizomes of Typhonium giganteum Engl.,AEoTGE） 处理 MCF-7细胞 24，48，72h后， 应用四甲基偶唑蓝 （Methyl thiazolyl
tetrazolium，MTT）比色试验、倒置光学显微镜观察、流式细胞术（Flow cytometry,FCM）及琼脂糖凝胶电泳法检测细胞增殖和凋亡情况。
结果表明：AEoTGE能够显著抑制 MCF-7细胞增殖， 且在一定的浓度范围内呈时间和浓度依赖性， 并可诱导其细胞凋亡。 30g·L-1
AEoTGE处理 24，48，72h后，MCF-7细胞凋亡率分别为 8.34%、12.1%和 12.6%，其凋亡程度与时间呈正相关，S期（DNA合成期）的细
胞在处理 72h后分布显著增加。 可见，独角莲对 MCF-7细胞有抑制增殖和诱导凋亡作用，其抗肿瘤机制与诱导凋亡有关。
关键词：独角莲；乳腺癌细胞；凋亡；细胞周期
中图分类号：Q949.714.7.2 文献标识码： A 文章编号： 1000-1700（2009）02-0174-04
Inhibition of Proliferation and Induction of Apoptosis in
MCF-7 Cell by Typhonium Giganteum Engl.
WANG Lin-mei, YE Bo, ZHAO Zhen-jun, LI Shu-ying
(Dalian Institute of Biotechnology，Liaoning Academy of Agricultural Sciences, Dalian Liaoning 116024, China)
Abstract： The effects of the aqueous extract from dried powdered rhizomes of Typhonium giganteum Engl., (AEoTGE) on
proliferation and apoptosis of MCF-7 cells were studied. MCF-7 were incubated with AEoTGE at different concentrations for 24h,
48h and 72h, respectively.The effects of AEoTGE on cell proliferation were measured with Methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）
colormetric assay and cell apoptosis with inverted optical microscope， flow cytometry （FCM）and agarose gel electrophoresis.
AEoTGE inhibited the proliferation of MCF-7 cells in a time and dose dependent manner. The apoptotic rate of cells treated
with 30 g·L-1 AEoTGE were 8.34%,12.1% and 12.6% in 24h, 48h and 72h intervals. Cells of MCF-7 was apparently in S
phases by AEoTGE in time depending manner. Typhonium giganteum Engl could inhibit proliferation and induce apoptosis in
MCF-7 and might play a role in treatment of breast cancer.
Key words： AEoTGE; MCF-7 cell; apoptosis; cell cycle
乳腺癌在我国发病率较高且近年来有逐渐增加的趋势 [1]，使用化疗药物是治疗乳腺癌的主要手段之一，而
现行化疗药物均有其各自的缺点， 寻求毒副作用小、 疗效确切的新型抗肿瘤药物有重要的现实意义。 独角莲
（Typhonium giganteum Engl.）为天南星科植物，是一种清热解毒中草药，在中医临床中已被广泛应用于治疗多种
恶性肿瘤疾病[2，3]，且疗效较好。 动物模型研究表明独角莲可明显抑制肿瘤生长[4,5]，并发现其对肝癌细胞 SMMC-
7721在 DNA合成期（Synthesis phase，S）的生长具有阻滞作用，诱导肿瘤细胞发生凋亡[6]。 但应用独角莲根茎水
提物（The aqueous extract from dried powdered rhizomes of Typhonium giganteum Engl.,AEoTGE）治疗乳腺癌的研
究国内外还未见报道。 本研究采用多种检测方法观察 AEoTGE对乳腺癌 MCF-7细胞增殖、凋亡和细胞周期的
影响，探讨独角莲治疗乳腺癌的依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试人乳腺癌 MCF-7细胞系由大连医科大学细胞实验室提供。 供试独角莲由吉林市农业科学院长白山资
沈阳农业大学学报，2009－04，40(2)：174-177
Journal of Shenyang Agricultural University，2009－04，40(2)：174-177
第 2期
源开发研究所提供。 将新鲜独角莲根茎洗净、去皮，取 20g切成厚度约 1cm的薄片，室温下阴干，捣碎后于研钵
中研磨，加蒸馏水 100mL，4℃放置 10d，4层纱布粗滤，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。 供试 RPMI-1640培
养液购自 Gibco 公司；胎牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自天津科密欧试剂公
司；染色剂四甲基偶唑蓝（MTT）购自美国 Fluka公司；细胞裂解液（Takara，Japan）试验使用的仪器有 CO2培养箱
(上海一恒科学仪器有限公司)、 超净工作台 （苏州苏净集团）、 酶标仪 （Biocell， 奥地利）、 倒置光学显微镜
（Olympus,日本）、台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、流式细胞仪（Coulter EPICS-XL）和电泳仪（大连竟迈科技
有限公司）。
1.2 方法
将 MCF-7 细胞接种在含有 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养液中， 在培养基中加入青霉素和链霉素各
100Unit·mL-1，pH 值 7.2～7.4，置于 37℃、5% CO2 培养箱中培养。 待细胞生长状态良好时，进行传代。
1.2.1 MTT法检测 AEoTGE对MCF-7细胞增殖的影响试验 将对数生长期的 MCF-7细胞以 1×105个·mL-1接
种于 96孔培养板上，每孔 190μL，于 37℃、5% CO2培养箱内培养 4h，待细胞沉淀后加入 10μL AEoTGE进行处理，
试验设计 5，10，20，30，50，80，100，120 g·L-1共 8个不同浓度的 AEoTGE处理。 以加入 10μL灭菌双蒸水作为对照
组，并设无细胞调零组。每组 4个孔，置 37℃、5% CO2培养箱内分别培养 24，48，72h后，加入 5g·L-1MTT20μL，继续
孵育 4h后，弃上清，每孔加入 150μL DMSO溶解，室温震荡 10min，于酶标仪 490nm处测定 OD值。 计算生长抑
制率（inhibitory rate，IR）。 IR=1－[（加药组 OD值－调零组 OD值）/（对照组 OD值－调零组 OD值）]×100%。 以上试
验设 3次重复。
1.2.2 光学显微镜观察细胞形态试验 采用倒置显微镜法观察 30g·L-1 AEoTGE 处理 24，48，72h 的处理组和
对照组的 MCF-7细胞生长形态变化。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳法观察细胞凋亡特征 DNA ladder带试验取 30g·L-1AEoTGE处理 24，48，72h后的细胞
和对照组细胞各 1×106个·mL-1，用磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）洗涤。 分别加入 250μL三羟基
甲基氨基甲烷（Tris EDTA Buffer，TE，pH值 7.6)、250μL 细胞裂解液、10μL 蛋白酶 K（Proteinase K）、8μL 核糖核
酸酶（Ribonuclease A，RNaseA），混匀后 37℃水浴过夜；苯酚：氯仿：异戊醇（v/v/v=25:24:1）抽提 1 次；上清液加入
1/10体积 3mol·L-1醋酸钠和 2.5～3.0倍体积冷无水乙醇沉淀 DNA，12000r·min-1离心弃上清，1mL 75%乙醇漂洗
1次，干燥后将 DNA溶于 50μLTE中。 取 10μL样品缓冲液，1.5%的琼脂糖凝胶电泳 1～2h，紫外灯下观察 DNA
梯度条带。
1.2.4 流式细胞仪检测 MCF-7 细胞凋亡和细胞周期试验 取 30g·L-1 AEoTGE 处理 24,48,72h 后的细胞和对
照组细胞各 1×106个·mL-1，1000r·min-1离心弃上清，重新悬浮于 1mL、4℃预冷的固定液中（1L固定液组成：葡萄
糖 1.1g、NaCl 8.0g、KCl 0.4g、Na3PO4·12H2O 0.39g、KH2PO4 0.15g、MgSO4·7H2O 0.08g、CaCl2·2H2O 0.16g）固定。 缓
慢加入－20℃预冷的 95%乙醇 3mL，使之终浓度为 75%，冰浴 30min，4℃保存。 流式细胞仪的检测分析由大连市
中心医院中心实验室协助完成。
1.2.5 数据处理 采用 SPSS11.5软件进行分析处理，数据用方差分析统计检验。
2 结果与分析
2.1 AEoTGE对MCF-7细胞增殖的影响
由图 1 可知， 处理 24h，AEoTGE 抑制 MCF-7
细胞增殖而对正常对照细胞无明显抑制作用，其
最佳有效浓度为 30g·L-1；处理 48h，最佳有效浓度
为 20 g·L-1； 处理 72h， 最佳有效浓度为 10g·L-1。
30g·L-1 的 AEoTGE 处理对 MCF-7 细胞生长抑制
率达 40.29%，超过临床化疗药物敏感标准（30%）。
可见，AEoTGE 对 MCF-7 细胞有抑制作用，且在一
定浓度范围抑制率呈明显时间剂量依赖性。
2.2 光镜观察MCF-7细胞形态结果
30g·L-1AEoTGE 处理 24，48，72h 后，MCF-7 细
图 1 AEoTGE 对 MCF-7细胞的抑制作用
Figure 1 Inhibitory effects of AEoTGE on MCF-7
cell growth
王林美等：独角莲抑制乳腺癌 MCF-7细胞增殖和诱导凋亡的作用研究 175· ·
第 40卷沈 阳 农 业 大 学 学 报
胞发生一系列变化。 对照组细胞密度大、形态完整、圆而透明。 AEoTGE处理的细胞明显受到抑制，细胞增长减
缓。 随处理时间的增加，单位面积细胞数量逐渐减少，细胞间连接消失。 MCF-7细胞透明度和亮度都降低，体积
缩小、变圆，形态不规则，细胞内出现有异物感的颗粒，核固缩，胞膜完整但出现发泡现象（图 2）。
图 2 30g·L-1AEoTGE 处理不同时间的 MCF-7细胞形态
A1～A3.对照组分别在 24，48，72h 的细胞形态（×100）；B1～B3.试验组分别在 24，48，72h 的细胞形态（×100）；
C1～C3.试验组分别在 24，48，72h 的细胞形态（×400）
Figure 2 Cell morphlogy observation of MCF-7 cells treated with AEoTGE（30 g·L-1）in different time
A1-A3. Untreated cells at 24,48,72h（×100）；B1-B3.Cells treated with AEoTGE at 24,48,72h （×100）；C1-C3.Cells treated with AEoTGE at 24,48,72h （×400）
2.3 琼脂糖凝胶电泳观察凋亡特征性梯度带结果
由图 3 可知，经 1.5%琼脂糖凝胶电泳，出现
典型 DNA Ladder， 表明核酸内切酶把 DNA 切
割成约 200bp的断裂片段，从而干扰细胞生长周
期以诱导细胞凋亡。并且随时间延长断裂片段增
多、梯带强度增加、凋亡细胞增加。细胞凋亡呈明
显的时效关系。
2.4 流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡结果
由表 2可知，对照组细胞大多数处于有丝分裂
第一间距期（Gap1 phase,G1），S期次之，有丝分裂期
(Gap2 phase-mitosis phase,G2-M)最少，其凋亡率
是 0.23%；30g·L-1AEoTGE 处理 MCF-7 细胞 24h，
48h，72h 后， 凋亡率随处理时间的延长而增加，
在处理 24h，48h，72h 后分别为 8.34%、12.1%和
12.6% ， 可见其凋亡程度与时间呈正相关 。
200bp
A B C D E
图 3 不同 AEoTGE（30g·L-1）处理时间下 MCF-7细胞 DNA琼脂
糖凝胶电泳图谱
A.200bp DNA marker 标志；B.对照组；C.72h 组；D.48h 组；E.24h 组
Figure 3 DNA agarose gel electrophoresis pattern of MCF-7
cells treated with AEoTGE（30g·L-1）at different time
A.200bp DNAmarker; B. Blank control group； C.72h group；D. 48h group ; E. 24h group
176· ·
第 2期
AEoTGE处理 72h时，S期的细胞分布显著增加，表明 AEoTGE对细胞周期的阻断效应。
处理时间 Treatment time/h
0(CK)
24
48
72
凋亡率 Apoptotic rate/%
0.23
8.34
12.10
12.60
G0-G1/%
69.27
51.13
47.97
23.10
S/%
24.20
38.70
36.30
54.20
G2-M/%
6.30
1.83
3.63
4.10
表 2 AEoTGE 处理下不同细胞周期 MCF-7细胞 DNA比例及凋亡率
Table 2 DNA content rate of defferent cell cycles of MCF-7 cells treated with AEoTGE and apoptotic rate
3 结论与讨论
试验结果表明，AEoTGE能够显著抑制 MCF-7细胞增殖， 且在一定的浓度范围内呈时间和浓度依赖性，并
可诱导其细胞凋亡。 30g·L-1AEoTGE在处理 MCF-7细胞 24,48,72h后，凋亡率分别为 8.34%、12.1%和 12.6%，其
凋亡程度与时间呈正相关；S期的细胞在处理 72h后分布显著增加。 可见，独角莲对 MCF-7细胞增殖有抑制和
诱导凋亡作用，其抗肿瘤机制与诱导凋亡有关。这与文献报道独角莲具有诱导多种肿瘤细胞株凋亡的作用,并具
有时间及剂量依赖性[3]一致。 也有研究结果提示凋亡的剂量依赖性有其一定范围，大剂量造成细胞的急性坏死，
使诱导凋亡的作用不明显；而过低剂量可能仅仅引起微小的、可复性的损伤[8]。 因此研究诱导凋亡药物使用的最
佳剂量在临床工作中具有重要意义。
用 MTT法对其进行药物敏感性检测可间接了解亚细胞状态及线粒体的改变[9]，有利于进行针对性较强的个
体化治疗，可提高疗效，改善生存质量。 本试验也间接地证实了 AEoTGE有抑制 MCF-7细胞线粒体呼吸，使氧
化磷酸化受阻，电子传递失调等作用，从而导致细胞凋亡。 诱导肿瘤细胞的凋亡是肿瘤治疗研究中的主要目标
与手段 [7]。 30g·L-1 AEoTGE 处理 MCF-7 细胞后，倒置显微镜观察结果表明，与对照组相比，随处理时间延长
MCF-7细胞生存数量明显减少，凋亡细胞增多，可见 AEoTGE对 MCF-7细胞凋亡作用有时间依赖性。 因此，从
诱导细胞凋亡角度考虑，对 MCF-7细胞小剂量持续给药可提高疗效。AEoTGE能明显诱导 MCF-7细胞凋亡，提
示诱导凋亡可能是 AEoTGE 的抗肿瘤作用机制之一， 这为今后肿瘤治疗提供了一种新的治疗策略。 30g·L-1
AEoTGE 处理 MCF-7 细胞后， 随着时间的增加，S 期细胞分布明显增多，G2-M 期细胞也有所增多。 可见，
AEoTGE 作用于 MCF-7 细胞株时可改变细胞的增殖周期动力学， 表现为 S 期比率上升，G2-M 期比率略有上
升，G1-S 期比率下降， 从而阻滞肿瘤细胞 S 期和 G2-M 期， 使肿瘤细胞分裂能力下降， 肿瘤增殖受到抑制。
AEoTGE细胞周期阻断效应是导致凋亡细胞增多的重要原因， 这种阻断作用的增强可产生细胞同步化效应，使
肿瘤细胞分布在 S 期，再加上作用于 S 期细胞周期特异性药物，可起到协同抗肿瘤作用，为 AEoTGE 在临床上
与其他药物的联合应用以提高化疗效果提供了理论依据。 另外，以往研究证实处于分裂期的细胞比处于其他期
的细胞对放疗更为敏感[10]，所以使用 AEoTGE后联合放疗可使肿瘤患者获得更好的治疗效果。
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[责任编辑 马迎杰]
王林美等：独角莲抑制乳腺癌 MCF-7细胞增殖和诱导凋亡的作用研究 177· ·